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Bioengineering

Micropatterned मैक्रो-बढ़ाया 3 डी सेलुलर वास्तुकला के लिए मॉड्यूलर हाइड्रोजेल शीट्स का निर्माण

Published: January 11, 2016 doi: 10.3791/53475
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Bio and Brain Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST)

Abstract

हाइड्रोजेल एक में विवो तरह तीन आयामी (3 डी) ऊतक ज्यामिति प्रदान करने के लिए microfluidic या micropatterning प्रौद्योगिकियों का उपयोग सूक्ष्म पैमाने पर नमूनों की जा सकती है। परिणामस्वरूप 3D हाइड्रोजेल आधारित सेलुलर निर्माणों उन्नत जैविक अध्ययन, औषधीय assays और अंग प्रत्यारोपण अनुप्रयोगों के लिए पशु प्रयोगों के लिए एक विकल्प के रूप में पेश किया गया है। हाइड्रोजेल आधारित कणों और फाइबर आसानी से गढ़े जा सकता है, यह ऊतक पुनर्निर्माण के लिए उन्हें हेरफेर करने के लिए मुश्किल है। इस वीडियो में, हम एक नियंत्रित सेलुलर microenvironment के साथ एक वृहद पैमाने पर 3 डी सेल संस्कृति प्रणाली के रूप में उनके विधानसभा के साथ एक साथ, micropatterned alginate हाइड्रोजेल शीट के लिए एक निर्माण विधि का वर्णन है। 200 माइक्रोन, और सटीक micropatterns साथ - कैल्शियम बीच बढ़िया तालमेल एजेंट की एक धुंध फ़ॉर्म से, पतली हाइड्रोजेल शीट आसानी से 100 की रेंज में एक मोटाई के साथ उत्पन्न कर रहे हैं। कोशिकाओं तो हाइड्रोजेल चादरों की ज्यामितीय मार्गदर्शन में साथ संवर्धित किया जा सकताफ्रीस्टैंडिंग की स्थिति। इसके अलावा, हाइड्रोजेल शीट आसानी से एक को समाप्त कटौती टिप के साथ एक micropipette का उपयोग चालाकी से किया जा सकता है, और एक नमूनों polydimethylsiloxane (PDMS) फ्रेम का उपयोग कर उन्हें stacking द्वारा बहुस्तरीय संरचनाओं में इकट्ठा किया जा सकता है। एक सतही प्रक्रिया का उपयोग कर निर्मित किया जा सकता है, जो इन मॉड्यूलर हाइड्रोजेल चादरें, सूक्ष्म और macrostructure और ऊतक पुनर्निर्माण के कार्यात्मक अध्ययन सहित इन विट्रो दवा assays और जैविक अध्ययन के संभावित आवेदन किया है।

Introduction

हाइड्रोजेल विशेष रूप से biomaterials वादा कर रहे हैं, और बुनियादी जीव विज्ञान, औषधीय assays और चिकित्सा के क्षेत्र में महत्वपूर्ण होने की उम्मीद कर रहे हैं। एक हाइड्रोजेल आधारित सेलुलर निर्माणों के Biofabrication पशु प्रयोगों के उपयोग को कम करने के लिए सुझाव दिया गया है, 2,3, 4 transplantable ऊतकों को बदलने के लिए और सुधार सेल आधारित assays। 5,6 पानी युक्त (पन) viscoelastic सामग्री (जैल) कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या समझाया और 3 डी सेलुलर microenvironment नियंत्रित करने के लिए एक पाड़ संरचना में बनाए रखा जा करने की अनुमति। Microfluidic या micropatterning प्रौद्योगिकियों के मार्गदर्शन के साथ संयोजन में, हाइड्रोजेल निर्माणों की ज्यामिति ठीक सेलुलर पैमाने पर नियंत्रित किया जा सकता है। तारीख, कण सहित हाइड्रोजेल के आकार की एक किस्म के लिए, 7-9 फाइबर, 10-12 और चादरें, 13-15 नीचे अप appro में निर्माण इकाइयों के रूप में इस्तेमाल किया गया हैवृहद पैमाने पर बहु-कोशिकीय आर्किटेक्चर का निर्माण करने के लिए दर्द।

हाइड्रोजेल आधारित कणों और फाइबर दोनों microfluidic उपकरणों का उपयोग कर fluidic नियंत्रण के साथ, सूक्ष्म पैमाने सेलुलर वातावरण के रूप में आवेदन के लिए आसानी से और तेजी से निर्मित किया गया है। हालांकि, इंजीनियर ऊतकों की बुनियादी इकाइयों के रूप में, यह उन्हें पुनर्व्यवस्थित करने के लिए और वृहद पैमाने निर्माणों के रूप में उनकी मात्रा बढ़ाना है। 16 माइक्रोन आकार बुनियादी मॉड्यूल का उत्पादन करने के लिए की तुलना में यह स्थूल आकार निर्माणों को प्राप्त करने के लिए और अधिक कठिन है जटिल हो जाएगा। हाइड्रोजेल आधारित निर्माणों की चादर की तरह इकाइयों एक साधारण सभा की प्रक्रिया के माध्यम से मचानों की मात्रा बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। तदनुसार, हाइड्रोजेल चादरों की खड़ी परतें एक बड़ा वृद्धि लेकिन यह भी एक 3 डी अंतरिक्ष में एक ज्यामितीय विस्तार ही उपलब्ध नहीं है।

बहु-जब्री में उनके विधानसभा के साथ एक साथ 15 - हम पहले 13 micropatterned हाइड्रोजेल शीट fabricating की एक विधि की सूचना दी हैजुटी सेलुलर आर्किटेक्चर। तकनीक बहुस्तरीय ढांचे की एक स्टैकिंग प्रक्रिया के माध्यम से जटिल micropatterning और सेलुलर निर्माणों की मॉड्यूलर डिजाइन सक्षम बनाता है। Micropatterned रहे हैं, जो खड़ी मॉड्यूलर हाइड्रोजेल चादरें, के निर्माण के माध्यम से, एक नियंत्रित वृहद पैमाने पर सेलुलर microenvironment के साथ एक 3 डी सेल संस्कृति प्रणाली महसूस किया जा सकता है। इस वीडियो प्रोटोकॉल मानव यकृत कार्सिनोमा सेल लाइन (HepG2) पर आधारित मॉड्यूलर हाइड्रोजेल चादरों का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक सरल अभी तक शक्तिशाली निर्माण विधि का वर्णन है। हम इस के साथ साथ साधारण इन नमूनों मॉड्यूलर हाइड्रोजेल शीट के हेरफेर, और एक बहुस्तरीय संरचना में उनके विधानसभा प्रदर्शित करता है।

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Protocol

Micropatterned Molds और hydrogels के 1. तैयारी

  1. PDMS नए नए साँचे कास्टिंग के लिए एक मानक दो कदम फोटोलिथोग्राफी तकनीक 15,17 के माध्यम से एक सिलिकॉन वेफर की सतह पर SU-8 photoresist का उपयोग कर वांछित सूक्ष्म पैमाने पैटर्न का उत्पादन। दिखाए गए उदाहरण एक जिगर लोब्यूल की तरह जाल पैटर्न (चित्रा 1) का उपयोग करता है।
  2. 1 के अनुपात के साथ PDMS और एक इलाज एजेंट समाधान वजन: 5 (यानी, PDMS की 12.5 ग्राम और इलाज के एजेंट के 2.5 ग्राम)।
  3. अच्छी तरह से समाधान की 15 ग्राम मिश्रण, एक निर्वात चैम्बर में बुलबुले देगास, और फिर समान रूप से एक पन्नी कास्टिंग पकवान भीतर सिलिकॉन वेफर की एक micropatterned सतह पर मिश्रित समाधान फैल गया।
  4. PDMS इलाज करने के लिए एक फ्लैट सतह पर 90 मिनट के लिए एक 65 डिग्री सेल्सियस गर्म थाली पर सिलिकॉन वेफर रखें।
  5. कास्टिंग पकवान और सिलिकॉन वेफर से ठीक PDMS निकालें।
  6. PDMS के किनारों में कटौती और एक 100 मिमी व्यास पेट्री डिश के साथ पर यह जगहmicropatterned ऊपर की ओर।
  7. प्राथमिक नसबंदी के लिए 70% इथेनॉल और आसुत जल का उपयोग कर पेट्री डिश पर micropatterned ठीक PDMS धो लें। फिर, 65 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में पूरी तरह से 10 मिनट के लिए उन्हें सूखी।
  8. कोटिंग समाधान (w / v) एक 3% बनाने, भंग और आसुत पानी की 100 मिलीलीटर में एक पाउडर nonionic पृष्ठसक्रियकारक हे / एन 3 जी मिश्रण।
  9. एक प्लाज्मा क्लीनर में micropatterned PDMS नए साँचे प्लेस और 1 मिनट (85 डब्ल्यू, 0.73 मिलीबार) जलीय तरल पदार्थ के अलावा सुविधा के लिए, एक हाइड्रोफिलिक सतह बनाने के लिए उन्हें साफ। फिर, कोट एक प्रयोगशाला घुमाव का उपयोग करते हुए कम से कम 3 घंटा (ओरो / एन) के लिए 100 मिलीलीटर surfactant समाधान के साथ PDMS की सतह।
  10. PDMS molds से surfactant समाधान धो लें और 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में उन्हें पूरी तरह से सूखे। फिर, 30 मिनट से अधिक पराबैंगनी (यूवी) विकिरण के संपर्क में से प्रत्येक micropatterned ढालना बाँझ।

2. एक हाइड्रोजेल अग्रदूत में सेल निलंबन की तैयारी

  1. कोएक 1% (डब्ल्यू / वी) alginate अग्रदूत बनाने, हाइड्रोजेल अग्रदूत तैयार फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 10 मिलीलीटर में सोडियम alginate पाउडर के 0.1 ग्राम भंग। पूरी तरह से पाउडर भंग करने के लिए, सेते हैं और / ओ एन उन्हें मिश्रण।
  2. 1 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ा एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर।
  3. संस्कृति 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन 70% तक एक पारंपरिक टिशू कल्चर पकवान पर साथ पूरक Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में HepG2 कोशिकाओं - एक 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में 80% संगम 37 डिग्री सेल्सियस पर ।
  4. एक बार पीबीएस का उपयोग कोशिकाओं को धो लें, और फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में 4 मिनट के लिए 0.05% ट्रिप्सिन- EDTA के 1 मिलीलीटर जोड़कर उन्हें trypsinize। अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला को हटाने के बाद पीबीएस के 1 मिलीलीटर का उपयोग कर 3 मिनट और resuspend के लिए 250 XG पर संस्कृति पकवान से काटा कोशिकाओं।
  5. एक स्वचालित सेल का उपयोग पीबीएस में ही वितरित कोशिकाओं की संख्या की गणनाकाउंटर।
  6. 3 मिनट और पीबीएस हटाने, के लिए 250 XG पर centrifugation के बाद 1% की 1 मिलीलीटर जोड़ने (w / v) शेष सेल गोली सोडियम alginate समाधान की और pipetting का उपयोग कर उन्हें धीरे मिश्रण। 10 7 कोशिकाओं / एमएल - कोशिकाओं के अंतिम बोने घनत्व 5 एक्स 10 6 होना चाहिए। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में सेल / हाइड्रोजेल निलंबन सेते हैं।

3. लोड हो रहा है और सेल / हाइड्रोजेल सस्पेंशन के पार से जोड़ने

  1. कैल्शियम क्लोराइड की 1.47 ग्राम एक पार से जोड़ने अभिकर्मक उत्पादन करने के लिए DDH 2 हे की 100 मिलीलीटर में निर्जलीकरण भंग (यानी, 100 मिमी 2 CaCl · 2H 2 ओ में DDH 2 ओ)।
  2. 70% इथेनॉल का उपयोग अल्ट्रासोनिक transducer के साथ एक humidifier के इंटीरियर बाहर कुल्ला, और पार से जोड़ने अभिकर्मक के 200 मिलीलीटर के साथ भरें। humidifier, 110 मिमी चौड़ा 300 मिमी लंबा और 170 मिमी गहरी है (यानी, 110 मिमी x 300 मिमी x 170 मिमी (डब्ल्यू एक्स एच एक्स डी))।
  3. Micropatterned PDMS रखेंएक प्लाज्मा क्लीनर में नए नए साँचे और एक हाइड्रोफिलिक सतह बनाने के लिए 85 डब्ल्यू पर 1 मिनट के लिए उन्हें साफ।
  4. तेजी से सांचे में micropattern के किनारे पर अच्छी तरह से मिश्रित सेल / हाइड्रोजेल निलंबन की 7.2 μl लोड। दिखाए गए उदाहरण एक जिगर लोब्यूल की तरह जाल पैटर्न (चित्रा 1) का उपयोग करता है। निलंबन की मात्रा स्थलाकृतिक तर्ज पर निर्भर करता है।
  5. सेल / हाइड्रोजेल निलंबन का जमाना को प्राप्त करने के लिए, humidifier के मोड़ पर है और humidifier पार से जोड़ने अभिकर्मक की एक धुंध है कि उत्पादन की जाँच करें। 5 सेमी की एक सीमा के भीतर PDMS molds के स्थलाकृतिक सतह को कवर, 5 मिनट के लिए हाइड्रोजेल अग्रदूत पर पार से जोड़ने अभिकर्मक का छिड़काव करें।
    दूरियां अब और कम से कम 5 सेमी क्रमश: अधूरा है और असमान जमाना कारण बन सकता है: ध्यान दें। Humidifier 5 मिनट में पार से जोड़ने अभिकर्मक की धुंध के 20 मिलीलीटर उत्पादन 250 मिलीग्राम / घंटा की एक छिड़काव दर है कि सुनिश्चित करें।
  6. पार से जोड़ने की प्रक्रिया के बाद, humidifier बंद कर देते हैं और PDMS मो भरनेपीबीएस के साथ एलडीएस।

एकल मॉड्यूलर हाइड्रोजेल शीट्स 4. हैंडलिंग

  1. एक 200 μl विंदुक टिप का उपयोग हाइड्रोजेल चादर चारों ओर धीरे पीबीएस pipetting के माध्यम से micropatterned नए साँचे से प्रत्येक कठोर हाइड्रोजेल चादर अलग करें।
  2. एक अंत में कटौती 1000 μl विंदुक टिप अंत का उपयोग कर प्रत्येक चल हाइड्रोजेल चादर उठाओ। प्रत्येक जिगर लोब्यूल की तरह जाल हाइड्रोजेल चादर 8 मिमी x 8.7 मिमी के आयाम है, और 100 हो - 200 माइक्रोन मोटी।
  3. एक 5 में हाइड्रोजेल एक सप्ताह से अधिक 12 अच्छी तरह से थाली में एक इकाई के घटक के रूप में निर्माण का उपयोग कर एक अस्थायी तरीके से इन विट्रो में कोशिकाओं को एक 12 अच्छी तरह से थाली में DMEM के 1 मिलीलीटर में हाइड्रोजेल शीट की एक परत स्थानांतरण, और संस्कृति % सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर humidified। हर दूसरे दिन संस्कृति के माध्यम से आदान-प्रदान।

5. विधानसभा बहुस्तरीय हाइड्रोजेल शीट्स

  1. दोहराएँ 18 मिमी x 18 मिमी x 4 मिमी के आयामों के साथ एक PDMS फ्रेम का उत्पादन करने के लिए 1.1-1.5 कदम (डब्ल्यू एक्सनिचली सतह पर 170 माइक्रोन उच्च स्तंभ संरचनाओं में शामिल है जो एच एक्स डी), और। 1.2 चरण में के रूप में उसी अनुपात के साथ, PDMS और इलाज के एजेंट के मिश्रण की 42 ग्राम का प्रयोग करें। PDMS फ्रेम एक्स 9 मिमी x 2 मिमी 8 मिमी के आयाम के साथ एक आंतरिक फ्रेम बनाने के लिए के लिए सिलिकॉन वेफर पर एक विशेष पॉली कार्बोनेट ढालना प्लेस (डब्ल्यू एक्स एच एक्स डी)।
  2. 121 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए एक ऑटोक्लेव में आसुत जल और चिमटी में डूबे हुए PDMS फ्रेम और 180 माइक्रोन ताकना नायलॉन फिल्टर कागजात जीवाणुरहित।
  3. एक 60 मिमी व्यास पेट्री डिश में (5 सेमी की एक व्यास के साथ) नायलॉन फिल्टर कागज के एक टुकड़े के एक चौथाई पर निष्फल PDMS फ्रेम रखें।
  4. एक अंत में कटौती 1000 μl विंदुक टिप का उपयोग PDMS फ्रेम के इंटीरियर में एक मॉड्यूलर हाइड्रोजेल चादर स्थानांतरण। विधानसभा के लिए इस्तेमाल किया हाइड्रोजेल चादरों वे गढ़े गए थे के बाद कम से कम एक दिन के लिए सभ्य होना चाहिए।
  5. एक खाली 200 μl विंदुक टिप का उपयोग PDMS फ्रेम के साथ प्रत्येक मॉड्यूलर हाइड्रोजेल चादर के किनारे संरेखित।
  6. 6 परतों - दोहराएँ 4 के एक ढेर के रूप में करने के लिए मॉड्यूलर हाइड्रोजेल शीट का प्रयोग 5.4 और 5.5 कदम।
  7. PDMS फ्रेम के नीचे स्थित स्तंभ संरचनाओं के माध्यम से इसे बाहर बहने से संस्कृति के माध्यम से निकालें। तब alginate समाधान के 2 μl जोड़ने (w / 2% वी) बहु परत का निर्माण के एक कोने में।
  8. एक और उन लोगों के साथ प्रत्येक परत के किनारों संलग्न करने के लिए बहु परत निर्माण पर 30 सेकंड के लिए पार से जोड़ने अभिकर्मक की एक धुंध स्प्रे। (250 मिलीग्राम / घंटा की एक छिड़काव दर पर) पार से जोड़ने अभिकर्मक की धुंध के 2 मिलीलीटर का प्रयोग करें।
  9. 400 μl DMEM के साथ धीरे बहुस्तरीय निर्माण कुल्ला और चिमटी का उपयोग PDMS फ्रेम को हटा दें।
  10. धीरे DMEM के 4 मिलीलीटर के अलावा के बाद चोर एक सेल के साथ पोंछते द्वारा फिल्टर पेपर से बहुस्तरीय निर्माण को अलग करें।
  11. स्थानांतरण बहुस्तरीय हाइड्रोजेल साथ के रूप में निर्माण 3 DMEM के मिलीलीटर फिल्टर पेपर, और संस्कृति के एक अस्थायी तरीके से इन विट्रो में कोशिकाओं का उपयोग, जिसमें 6 अच्छी तरह से थाली करने के लिए निर्माण37 डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में एक सप्ताह से अधिक 6 अच्छी तरह से थाली में एक बहु पैमाने सेलुलर पाड़। हर दूसरे दिन संस्कृति के माध्यम से आदान-प्रदान।

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Representative Results

हम निर्माण और सेलुलर हाइड्रोजेल शीट freestanding के हेरफेर का वर्णन किया है। चित्र 1 में दिखाया गया है, हम micropatterned PDMS नए साँचे गढ़े, और सेल युक्त हाइड्रोजेल हाइड्रोफिलिक इन नए नए साँचे की सतह और पर लादा गया था पार से जुड़े एजेंट बीच बढ़िया तालमेल का एक aerosolized धुंध उत्पन्न करने के लिए एक humidifier का उपयोग। नए नए साँचे से रिहाई के बाद, HepG2 कोशिकाओं विभिन्न पैटर्न (चित्रा 2) के साथ हाइड्रोजेल शीट freestanding में सुसंस्कृत थे। इस प्रकार, पतली हाइड्रोजेल चादरें एक 3 डी संस्कृति वातावरण प्रदान की है। इसके अलावा, मॉड्यूलर हाइड्रोजेल चादरें एक अंत में कटौती टिप के साथ एक micropipette का उपयोग शीट लेयरिंग, और 3 डी वृहद पैमाने पर सेल संस्कृति (चित्रा 3) सक्षम बनाता है जो एक PDMS फ्रेम, उपयोग करके इकट्ठा किया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1 फ्लो चाRT एक हाइड्रोजेल शीट और बहु परत हाइड्रोजेल शीट्स का निर्माण दिखा रहा है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
विभिन्न हाइड्रोजेल शीट्स में चित्रा 2. फ्रीस्टैंडिंग 3 डी सेल संस्कृति। सूक्ष्म पैमाने पर alginate हाइड्रोजेल की सटीक आकृति सक्षम पार से जोड़ने अभिकर्मक छिड़काव के निर्माण विधि। इसके अलावा, गढ़े हाइड्रोजेल शीट मोल्ड से काटा जा सकता है और फ्रीस्टैंडिंग की स्थिति में आसानी से छेड़छाड़। HepG2 कोशिकाओं के नमूनों और एक फ्लैट हाइड्रोजेल शीट (ए) में सुसंस्कृत थे, हेक्सागोनल खंभे (बी), मेष (सी), जिगर लोब्यूल-जैसे मेष (डी), छेद की एक सरणी (ई), और multipl साथ हाइड्रोजेल शीटई microcomb-तरह microfibers (एफ)। इस प्रकार के रूप पैमाने सलाखों हैं:। 500 माइक्रोन (ए, डी, एफ), 100 माइक्रोन (बी, सी), और 2 मिमी (ई) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. विधानसभा वृहद पैमाने पर सेलुलर निर्माणों के लिए micropatterned हाइड्रोजेल शीट्स। हाइड्रोजेल चादर के विभिन्न प्रकार के हरे प्रतिदीप्ति और NIH3T3 कोशिकाओं के साथ दाग HepG2 कोशिकाओं से युक्त पांच हाइड्रोजेल चादरों की विधानसभा सहित संरेखण के साथ परत-दर-परत स्टैकिंग के माध्यम से इकट्ठा किया जा सकता है लाल प्रतिदीप्ति (ए) के साथ दाग। विस्तार किया पाइपलाइन संरचना (बी) के साथ micropatterned हाइड्रोजेल शीट की एक सभा के उच्च सेल व्यवहार्यता था प्रदान कीएन 7 दिनों के बाद गैर नमूनों हाइड्रोजेल शीट (सी) का है। व्यवहार्यता calcein-AM (हरे रंग के रूप में दिखाया जीवित कोशिकाओं) और ethidium homodimer-1 (लाल के रूप में दिखाया मृत कोशिकाओं) के साथ HepG2 कोशिकाओं धुंधला द्वारा मूल्यांकन किया गया था। स्केल सलाखों:। 500 माइक्रोन (ए) और 200 माइक्रोन (बी, सी) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल मॉड्यूलर हाइड्रोजेल शीट fabricating, और 3 डी सेलुलर मचानों बनाने के लिए उन्हें कोडांतरण का एक सरल तरीका प्रदान करता है।

एक कम समय में स्पष्ट नमूनों alginate संरचनाओं के निर्माण के लिए, हम मोल्ड से जटिल micropatterns बनाए रखने के लिए, साथ ही सेल व्यवहार्यता और चयापचय को बनाए रखने के लिए पर्याप्त कठोर संरचना बना सकते हैं कि एक पार से जोड़ने की प्रक्रिया की पहचान करनी चाहिए। हम एक धुंध के रूप में एक humidifier का उपयोग कर एक पार से जोड़ने अभिकर्मक स्प्रे करने के लिए, एक प जेल संक्रमण सहित एक पार से जोड़ने की प्रक्रिया को विकसित किया है। चयापचयों और पोषक तत्वों के लिए उच्च वाचाल पारगम्यता है - जो (200 माइक्रोन 100), इस पार से जोड़ने की प्रक्रिया के बिना, सूक्ष्म पैमाने पैटर्न सीमित वाचाल गहराई के साथ निर्माण एक पतली हाइड्रोजेल के रूप में उत्पन्न नहीं किया जा सकता है। 60 मिनट, 18 - - 20 पार से जोड़ने तिवारी इसके अलावा, 30 की आवश्यकता होती है, जो मौजूदा प्रसार आधारित विधियों, के साथ तुलना में(- 5 मिनट 3) मुझे अपेक्षाकृत कम था।

इसके अलावा, यह भी केवल एक तरल माध्यम में यंत्रवत् स्थिर थे जो पतली हाइड्रोजेल चादरें, हेरफेर करने के लिए चुनौतीपूर्ण था। चित्र 1 में दिखाया गया है, पतली हाइड्रोजेल संरचना बस और स्थिरतापूर्वक संभाला और विभिन्न संवर्धन की स्थिति के बीच स्थानांतरण के लिए एक अंत में कटौती पारंपरिक टिप का उपयोग कर चालाकी से किया गया था। पीढ़ी और हेरफेर तकनीक का उपयोग करना, हम ऊतक की तरह निर्माणों के लिए scaffolds के रूप में संभावित अनुप्रयोगों के साथ, एक दवा assays में संभावित अनुप्रयोगों के लिए एक अस्थायी ढंग से एकल परत चादर लेकिन यह भी खड़ी बहु परत संरचनाओं न केवल प्रदान कर सके।

बहुस्तरीय सेलुलर आर्किटेक्चर मॉड्यूलर एकल परत हाइड्रोजेल शीट (चित्रा 3) स्टैकिंग द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है। प्रत्येक मॉड्यूलर हाइड्रोजेल चादर सेल प्रकार भिन्न हो सकती है, और अलग संस्कृति की स्थिति से अवगत कराया जा सकता है। ये बहु परत निर्माणों तो चुनिंदा विधानसभा की जा सकती हैलहूलुहान। कुल गहराई सीमित वाचाल गहराई (चित्रा 3 सी) से अधिक है जब हालांकि, बस स्टैकिंग हाइड्रोजेल शीट इकट्ठे संरचना के अंदर सेल गल जाना हो सकता है। इस समस्या को दूर करने के लिए, यह बहु परत हाइड्रोजेल शीट इकट्ठा कर रहे हैं जब इस तरह के जिगर लोब्यूल-तरह meshes, के रूप में micromesh पैटर्न, संरेखित करने के लिए आवश्यक होगा। हाइड्रोजेल चादर की सीमा खड़ी हाइड्रोजेल चादरों के लिए पंक्ति में के रूप में हम इसलिए एक ही आंतरिक पैटर्न के साथ एक PDMS फ्रेम की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, इकट्ठे जाल हाइड्रोजेल शीट में गठबंधन छेद सरणी micropatterns सुधार सेल व्यवहार्यता (चित्रा 3 बी) के लिए और अधिक कुशल पोषक तत्व परिवहन की सुविधा का विस्तार पाइपलाइन संरचनाओं फार्म का उपयोग किया जा सकता है।

इस तकनीक की एक सीमा alginate हाइड्रोजेल में सेल मैट्रिक्स बातचीत का अभाव है। Alginate में विवो तरह सेल मैट्रिक्स बातचीत के लिए कोशिका आसंजन ligands प्रदान नहीं कर सकते हैं; 21 तथापि, यह दूर करता हैसेल सेल बातचीत के साथ एक 3 डी सेल-encapsulating पाड़ के रूप में यांत्रिक और ज्यामितीय प्रभाव इंजी। कोशिकाओं प्राथमिक कोशिकाओं के लिए और स्टेम, alginate RGD युक्त पेप्टाइड्स, 21 या कोलेजन या जिलेटिन के साथ संयोजन में साथ निम्न संशोधन किया जा सकता है। 14,18 एक और सीमा है, कि सेल एम्बेडेड हाइड्रोजेल चादरों के नीचे कम सेल घनत्व के साथ निर्मित कर रहे हैं एक बार संरचना की ही बढ़त अतिरिक्त alginate के उपयोग के द्वारा तय हो गई है, क्योंकि 5 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल, बहुस्तरीय संरचना के निर्माण हाइड्रोजेल चादर के बीच कमजोर संलग्नक कारण बन सकता है। हालांकि, परतों PDMS फ्रेम के तहत जल निकासी संरचना के माध्यम से एक भी पाड़ के रूप में दृढ़तापूर्वक खड़ी हो सकती है। इसके अलावा, हाइड्रोजेल शीट में कोशिकाओं की उच्च घनत्व सतह पर और साथ ही चित्रा 3 में दिखाया गया है परतों के बीच संलग्नक मदद मिलेगी, जो एक दिन संस्कृति के बाद परत के भीतर पैदा करना हो सकता है।

हाइड्रोजेल चादर Fabricaयहाँ वर्णित मोर्चे और हेरफेर तकनीक सेलुलर assays और इंजीनियरिंग कृत्रिम अंगों सहित अनुप्रयोगों के लिए एक इन विवो तरह microenvironment, प्रदान करने के लिए इन विट्रो संस्कृति प्रणालियों और ऊतक तरह सेलुलर मॉडल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इस तकनीक को सेल आधारित दवा assays और ज्यामितीय अलग 3 डी सेलुलर सूक्ष्म और विभिन्न कोशिकाओं या हाइड्रोजेल प्रकार को शामिल कि macroenvironments की आवश्यकता है कि जैविक अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning Corporation 000000000001064291
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443 Powdered nonionic surfactant 
Alginic acid sodium salt, low viscosity Alfa Aesar B25266
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C7902
Ultrasonic humidifier MediHeim MH-2800 Modified equipment, Maximum sprayed rate: 250 ml/hr
Nylon net filter hydrofilic, 180 μm EMD Millipore NY8H04700
Polycarbonate mold Customized mold for fabrication of a PDMS frame pattern

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References

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Micropatterned मैक्रो-बढ़ाया 3 डी सेलुलर वास्तुकला के लिए मॉड्यूलर हाइड्रोजेल शीट्स का निर्माण
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Son, J., Bae, C. Y., Park, J. K.… More

Son, J., Bae, C. Y., Park, J. K. Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture. J. Vis. Exp. (107), e53475, doi:10.3791/53475 (2016).

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