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Bioengineering

Construcción de Hojas modular de hidrogel para la arquitectura celular 3D a escala macro micropatterned

Published: January 11, 2016 doi: 10.3791/53475
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Bio and Brain Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST)

Abstract

Los hidrogeles pueden ser modelados en la micro-escala utilizando tecnologías de microfluidos o micropatterning para proporcionar una geometría de tejido vivo -como (3D) tridimensional en. Los constructos celulares a base de hidrogel 3D resultantes se han introducido como una alternativa a los experimentos con animales para estudios biológicos avanzados, ensayos farmacológicos y las aplicaciones de trasplante de órganos. Aunque las partículas y fibras a base de hidrogel pueden ser fabricados fácilmente, es difícil manipularlos para la reconstrucción de tejidos. En este vídeo, se describe un método de fabricación de láminas de hidrogel de alginato micropatterned, junto con su montaje para formar un sistema de cultivo de células en 3D a escala macro con un microambiente celular controlada. Usando una forma de niebla del agente gelificante de calcio, hojas delgadas de hidrogel se generan fácilmente con un espesor en el rango de 100 - 200 m, y con micropatrones precisas. Las células pueden ser cultivadas a continuación, con la orientación geométrica de las hojas de hidrogel encondiciones independientes. Además, las láminas de hidrogel pueden ser manipulados fácilmente utilizando una micropipeta con una punta final de corte, y pueden ser montados en estructuras de varias capas por el apilamiento de ellos utilizando un polidimetilsiloxano modelado (PDMS) marco. Estas hojas de hidrogel modulares, que pueden ser fabricados utilizando un proceso Facile, tienen aplicaciones potenciales de los ensayos in vitro de drogas y estudios biológicos, incluyendo los estudios funcionales de micro y macroestructura y la reconstrucción de tejidos.

Introduction

Los hidrogeles son particularmente prometedores biomateriales, y se espera que ser importante en la biología básica, ensayos farmacológicos y la medicina. 1 Biofabrication de constructos celulares a base de hidrogel se ha sugerido para reducir el uso de los experimentos con animales, 2,3 reemplazar los tejidos trasplantables, 4 y mejorar ensayos basados ​​en células. 5,6 que contiene agua-(carburos) materiales viscoelásticos (geles) permiten un gran número de células a encapsular y se mantiene en una estructura de andamio para controlar el microambiente celular 3D. En combinación con la orientación de las tecnologías de microfluidos o micropatterning, la geometría de las construcciones de hidrogel puede ser controlada con precisión a escala celular. Hasta la fecha, una variedad de formas de hidrogeles, incluyendo partículas, fibras 7 - 9, 10 - 12 y hojas, 13 - 15 años han sido utilizados como unidades de construcción en apro bottom-updolores a la fabricación de escala macro arquitecturas multi-celulares.

Ambas partículas y fibras a base de hidrogel se han fabricado fácil y rápidamente para aplicaciones como entornos celulares micro-escala, con controles de fluidos utilizando dispositivos de microfluidos. Sin embargo, como las unidades básicas de la ingeniería de tejidos, sería complicado para reorganizar ellos y para ampliar su volumen como construcciones a escala macro. 16 Es más difícil de lograr construcciones macro-escala que producir módulos básicos de tamaño micrométrico. Unidades similar a una lámina de construcciones a base de hidrogel pueden ser usados ​​para aumentar el volumen de los andamios a través de un proceso de montaje simple. Consecuentemente, las capas apiladas de láminas de hidrogel proporcionan no sólo un aumento volumétrico sino también una extensión geométrica en un espacio 3D.

Hemos informado anteriormente de un método de fabricación de láminas de hidrogel micropatterned, 13-15 junto con su montaje en multi-layarquitecturas celulares Ered. La técnica permite micropatterning complejo y el diseño modular de los constructos celulares a través de un proceso de apilamiento de las estructuras de varias capas. A través de la fabricación de láminas de hidrogel modulares apilados, que se micropatterned, un sistema de cultivo celular 3D con un microambiente celular escala macro controlada puede ser realizado. Este protocolo de vídeo describe un método de fabricación sencilla pero potente que puede utilizarse para construir hojas de hidrogel modulares, basado en la línea celular de carcinoma de hígado humano (HepG2). Se demuestra en el presente documento sencilla manipulación de estas hojas de hidrogel modulares modelados, y su montaje en una estructura de múltiples capas.

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Protocol

1. Preparación de la micropatterned Moldes y hidrogeles

  1. Producir los patrones de micro-escala deseada utilizando SU-8 fotoprotector en la superficie de una oblea de silicio a través de una de dos pasos 15,17 técnica de fotolitografía estándar para moldes de fundición PDMS. El ejemplo que se muestra utiliza un patrón de malla hígado lóbulo como (Figura 1).
  2. Pesar PDMS y una solución de agente de curado con una proporción de 1: 5 (es decir, 12,5 g de PDMS y 2,5 g de agente de curado).
  3. Mezclar el 15 g de la solución a fondo, desgasificar las burbujas en una cámara de vacío, y luego se extendió la solución mezclada sobre una superficie microestructurada de la oblea de silicio uniformemente dentro de un plato de fundición de aluminio.
  4. Coloque la oblea de silicio sobre una placa de 65 ° C durante 90 min se calienta sobre una superficie plana para curar los PDMS.
  5. Retire los PDMS curados desde el plato de fundición y la oblea de silicio.
  6. Cortar los bordes de los PDMS y colocarlo en una placa de Petri de 100 mm de diámetro conel lado micropatterned arriba.
  7. Lavar los PDMS curados micropatterned en la placa de Petri utilizando etanol al 70% y agua destilada para la esterilización primaria. A continuación, secar completamente durante 10 min en un horno a 65 ° C.
  8. Disolver y mezclar O / N 3 g de un tensioactivo no iónico en polvo en 100 ml de agua destilada, la creación de un 3% (w / v) solución de revestimiento.
  9. Coloque los moldes de PDMS micropatterned en un limpiador de plasma y limpiarlos durante 1 min (85 W, 0,73 mbar) para crear una superficie hidrófila, para facilitar la adición de líquidos acuosos. A continuación, recubrir la superficie de los PDMS con la solución de 100 ml de tensioactivo durante al menos 3 hr (Oro / N) utilizando un eje de balancín de laboratorio.
  10. Lavar la solución de tensioactivo de los moldes de PDMS y secarlas completamente en un horno a 65 ° C durante 10 min. Entonces, esterilizar cada molde microestructurada por la exposición a los rayos ultravioleta (UV) durante 30 min.

2. Preparar la suspensión de células en un hidrogel Precursor

  1. Apreparar precursor de hidrogel, se disuelven 0,1 g de polvo de alginato de sodio en 10 ml de tampón fosfato salino (PBS), la creación de un 1% (w / v) precursor de alginato. Para disolver el polvo completamente, incubar y mezclarlas O / N.
  2. Se filtra la solución a través de un filtro de 0,22 micras conectado a una jeringa de 1 ml.
  3. Cultivar las células HepG2 en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10% y 1% de penicilina-estreptomicina en una placa de cultivo tisular convencional hasta 70% - 80% de confluencia en un incubador humidificado 5% de CO2 a 37 ° C .
  4. Lave las células una vez utilizando PBS, y luego trypsinize ellos añadiendo 1 ml de 0,05% de tripsina-EDTA durante 4 minutos en una incubadora de CO 2 humidificado 5% a 37 ° C. Centrifugar las células recogidas de la placa de cultivo a 250 xg durante 3 min y resuspender usando 1 ml de PBS siguientes eliminación del sobrenadante.
  5. Contar el número de células individuales distribuidas en PBS utilizando una célula automatizadamostrador.
  6. Después de centrifugación a 250 xg durante 3 min y la eliminación PBS, añadir 1 ml de la 1% (w / v) de solución de alginato de sodio al sedimento celular restante y mezclar suavemente usando pipeteado. La densidad de siembra final de las células debe ser de 5 × 10 6 - 10 7 células / ml. Se incuba la suspensión de células / hidrogel en un incubador humidificado 5% de CO2 a 37 ° C.

3. Carga y reticulación de celular / hidrogel Suspensión

  1. Disolver 1,47 g de cloruro de calcio deshidratar en 100 ml de ddH 2 O para producir un reactivo de reticulación (es decir, 100 mM CaCl 2 · 2H 2 O en ddH 2 O).
  2. Enjuague el interior de un humidificador con transductor ultrasónico usando 70% de etanol, y llenarlo con 200 ml de reactivo de reticulación. El humidificador es de 110 mm de ancho, 300 mm de largo y 170 mm de profundidad (es decir, 110 mm x 300 mm x 170 mm (W x H x D)).
  3. Coloque el PDMS micropatternedmoldes en un limpiador de plasma y limpiarlos durante 1 min a 85 W para crear una superficie hidrófila.
  4. Constantemente cargar 7.2 l de la suspensión de células / hidrogel bien mezclada en el borde de la microestructura en el molde. El ejemplo que se muestra utiliza un patrón de malla hígado lóbulo como (Figura 1). El volumen de la suspensión depende del patrón topográfico.
  5. Para lograr la gelificación de la suspensión de células / hidrogel, encender el humidificador y verifique que el humidificador produce una niebla del reactivo de reticulación. Pulverizar el reactivo de reticulación en el precursor de hidrogel durante 5 min, que cubre la superficie topográfica de los moldes de PDMS dentro de un rango de 5 cm.
    Nota: Las distancias más largas y más cortas que 5 cm podrían causar gelificación incompleta y desigual, respectivamente. Asegúrese de que el humidificador tiene una tasa de pulverización de 250 ml / hr, produciendo 20 ml de niebla del reactivo de reticulación en 5 min.
  6. Tras el proceso de entrecruzamiento, apague el humidificador y llenar el mo PDMSlds con PBS.

4. Manejo de hojas sueltas modular de hidrogel

  1. Separe cada hoja hidrogel endurecido de los moldes micropatterned mediante pipeteo PBS suavemente alrededor de la lámina de hidrogel usando una punta de pipeta 200 l.
  2. Recoge cada hoja hidrogel flotante utilizando un 1000 l extremo de la punta de la pipeta extremo cortado. Cada lámina de hidrogel de malla-lóbulo como el hígado tiene unas dimensiones de 8 mm x 8,7 mm, y ser 100-200 m de espesor.
  3. Transferir una sola capa de la lámina de hidrogel en 1 ml de DMEM en una placa de 12 pocillos, y cultivar las células in vitro de una manera flotante utilizando el hidrogel construir como un componente unitario en la placa de 12 pocillos durante una semana en un 5 % de CO 2 humidificado incubadora a 37 ° C. Cambie el medio de cultivo cada dos días.

5. Hojas de hidrogel Asamblea de múltiples capas-

  1. Repita los pasos 1,1 a 1,5 para producir un marco de PDMS con unas dimensiones de 18 mm x 18 mm x 4 mm (W xH x D), y que contiene estructuras de 170 m de altura de pilar en la superficie inferior. Utilice 42 g de la mezcla de PDMS y agente de curado, con la misma relación que en el paso 1.2. Coloque un molde de policarbonato especializada en la oblea de silicio para el marco de PDMS para crear un marco interior con dimensiones de 8 mm x 9 mm x 2 mm (W x alto x profundidad).
  2. Esterilizar el marco de PDMS y 180-m-poros papeles de filtro de nylon sumergida en agua destilada y pinzas en un autoclave durante 15 min a 121 ° C.
  3. Coloque el marco PDMS esterilizada en un cuarto de una pieza de papel de filtro de nylon (con un diámetro de 5 cm) en una placa Petri de diámetro de 60 mm.
  4. Transferir una lámina de hidrogel modular en el interior del bastidor de PDMS usando una punta de pipeta de 1000 l final de corte. Las láminas de hidrogel utilizados para el montaje deben ser cultivadas durante al menos un día después de que fueron fabricados.
  5. Alinee el borde de cada hoja de hidrogel modular con el marco PDMS utilizando una punta de pipeta 200 l vacío.
  6. Repetir los pasos 5.4 y 5.5 el uso de hojas de hidrogel modulares para formar una pila de 4 - 6 capas.
  7. Retire el medio de cultivo por que fluye hacia fuera a través de las estructuras de pilar en la parte inferior del bastidor de PDMS. A continuación, añadir 2 l de solución de alginato (2% w / v) en una esquina de la construcción multi-capa.
  8. Pulverizar una niebla del reactivo de reticulación durante 30 segundos en la construcción de múltiples capas para fijar los bordes de cada capa con los de otro. Utilice 2 ml de niebla del reactivo de reticulación (a una velocidad de pulverización de 250 ml / h).
  9. Enjuague la construcción de múltiples capas suavemente con 400 l DMEM y retire el marco de PDMS con unas pinzas.
  10. Separe la construcción de varias capas de papel de filtro frotando suavemente con una célula elevador después de la adición de 4 ml de DMEM.
  11. Transferir el de varias capas construir una placa de 6 pocillos que contiene 3 ml de DMEM usando papel de filtro, y cultivar las células in vitro de una manera flotante, con el hidrogel como construirun andamio celular multi-escala en la placa de 6 pocillos más de una semana en un incubador humidificado 5% de CO 2 a 37 ° C. Cambie el medio de cultivo cada dos días.

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Representative Results

Hemos descrito la fabricación y manipulación de láminas de hidrogel autoportante celulares. Como se muestra en la Figura 1, se han fabricado de PDMS micropatterned moldes, y de hidrogel que contiene las células se cargó sobre la superficie hidrófila de estos mohos y reticulada usando un humidificador para generar una niebla de aerosol de agente gelificante. Tras la liberación de los moldes, las células HepG2 se cultivaron en autoportante hojas de hidrogel con varios patrones (Figura 2). Por lo tanto, las hojas delgadas de hidrogel proporcionó un ambiente de cultivo 3D. Además, las hojas de hidrogel modulares se pueden ensamblar por capas de las hojas utilizando una micropipeta con una punta final de corte, y el uso de un marco de PDMS, que permite el cultivo de células a escala macro 3D (Figura 3).

Figura 1
Figura 1. Flujo Chart Mostrando la fabricación de una lámina de hidrogel y Hojas de hidrogel de múltiples capas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. independiente 3D cultivo celular in varias láminas de hidrogel. El método de fabricación de pulverización reactivo de reticulación permitido patrón preciso de hidrogel de alginato en la escala micro. Además, las láminas de hidrogel fabricados podrían ser cosechadas del molde y manipularse fácilmente en condiciones independientes. Células HepG2 eran iguales y se cultivan en una hoja de hidrogel plana (A), hojas de hidrogel con pilares hexagonales (B), de malla (C), malla-lóbulo como el hígado (D), una serie de agujeros (E), y multipl-microcomb como microfibras e (F). Las barras de escala son los siguientes:. 500 micras (A, D, F), 100 m (B, C), y 2 mm (E) Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Montaje de micropatterned hojas de hidrogel para constructos celulares macro escala. Varios tipos de lámina de hidrogel podría ser montado a través de apilamiento de capas por capa con la alineación, incluyendo el montaje de cinco hojas de hidrogel que contiene las células HepG2 teñidas con fluorescencia verde y las células NIH3T3 teñidas con fluorescencia roja (A). Un conjunto de hojas de hidrogel micropatterned con estructura gasoducto ampliado (B) proporciona mayor viabilidad tha celularn la de hojas de hidrogel no estampados (C) después de 7 días. La viabilidad se evaluó por tinción de las células HepG2 con calceína-AM (células vivas que se muestran como verde) y homodímero de etidio-1 (células muertas que se muestran como rojo). Las barras de escala:. 500 m (A) y 200 m (B, C) ​​Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo proporciona un método sencillo de fabricar láminas de hidrogel modulares, y montaje de ellos para formar andamios celulares 3D.

Para construir claras estructuras modeladas de alginato en un corto tiempo, deberíamos identificar un procedimiento de reticulación que pueden crear estructuras suficientemente rígido para mantener los complejos micropatrones del molde, así como mantener la viabilidad celular y el metabolismo. Hemos desarrollado un proceso de reticulación, incluyendo una transición sol-gel, para rociar un reactivo de reticulación usando un humidificador en forma de una niebla. Sin este proceso de reticulación, los patrones de micro-escala no podrían ser generados en la forma de un hidrogel delgada construir con la profundidad limitada de difusión (100 - 200 micras), que tiene una alta permeabilidad difusiva a metabolitos y nutrientes. Además, en comparación con los métodos existentes basados ​​en la difusión, que requieren 30 - 60 min, 18 - 20 de la TI de reticulaciónyo estaba relativamente corto (3-5 minutos).

Por otra parte, también era difícil de manipular las hojas delgadas de hidrogel, que eran mecánicamente estable sólo en un medio líquido. Como se muestra en la Figura 1, la estructura fina de hidrogel fue simplemente y de forma estable manejado y manipulado utilizando una punta convencional de fin de corte para transferal entre diferentes condiciones de cultivo. El uso de técnicas de generación y manipulación, podríamos proporcionar no sólo una hoja de una sola capa de una manera flotante para aplicaciones potenciales en ensayos de fármacos, pero las estructuras de múltiples capas también apilados, con aplicaciones potenciales como andamios para construcciones similar a un tejido.

Arquitecturas celulares de varias capas pueden ser generados por el apilamiento de las láminas de hidrogel de una sola capa modulares (Figura 3A). Cada lámina de hidrogel modular puede contener diferentes tipos de células, y puede ser expuesta a diferentes condiciones de cultivo. Estas construcciones multi-capa puede entonces ser ASSEM selectivamentesangrado. Sin embargo, simplemente apilar hojas de hidrogel pueden conducir a la necrosis celular dentro de la estructura montada cuando la profundidad total supera la profundidad de difusión limitada (Figura 3C). Para superar este problema, sería necesario alinear los patrones de micromalla, tales como mallas-lóbulo como el hígado, cuando se ensamblan las hojas de hidrogel multi-capa. Por lo tanto, se requiere un marco de PDMS con el mismo patrón de interiores como el borde de la lámina de hidrogel para alinear las hojas de hidrogel apilados. Por lo tanto, micropatrones agujero de matriz alineados en las hojas de hidrogel de malla reunidos se podrían utilizar para formar estructuras de tuberías expandido, lo que facilita el transporte de nutrientes más eficiente para mejorar la viabilidad de las células (Figura 3B).

Una limitación de esta técnica es la ausencia de interacciones célula-matriz en el hidrogel de alginato. El alginato no puede proporcionar ligandos de adhesión celular para in vivo -como interacciones célula-matriz; 21 sin embargo, lo hace fueraer efectos mecánicas y geométricas como un andamio celular que encapsula 3D con interacciones célula-célula. Para las células primarias y las células madre, alginato podría usarse siguiente modificación con péptidos que contienen RGD-21, o en combinación con colágeno o gelatina. 14,18 Otra limitación es que, una vez que las hojas de hidrogel de células embebido se fabrican con baja densidad celular por debajo 5 x 10 6 células / ml, la construcción de estructura de múltiples capas podrían causar adjuntos débiles entre las láminas de hidrogel debido a que sólo el borde de la estructura se fija mediante el uso de alginato adicional. Sin embargo, las capas pueden apilarse de forma compacta como una sola andamio a través de estructura de drenaje bajo el marco PDMS. Además, una mayor densidad de células en las hojas de hidrogel podría proliferar en la superficie así como dentro de la capa después del cultivo de un día, lo que ayudaría a uniones entre capas como se muestra en la Figura 3A.

La fabrica lámina de hidrogella técnica y la manipulación se describe aquí se puede adaptar a los sistemas de cultivo in vitro y modelos celulares similar a un tejido para proporcionar un microambiente en vivo -como para aplicaciones, incluyendo ensayos celulares y órganos artificiales de ingeniería. Esta técnica podría aplicarse a los ensayos de fármacos basados ​​en células y estudios biológicos que requieren geométricamente diferente micro celular 3D y macroenvironments que incorporan diversas células o tipos de hidrogel.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning Corporation 000000000001064291
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443 Powdered nonionic surfactant 
Alginic acid sodium salt, low viscosity Alfa Aesar B25266
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C7902
Ultrasonic humidifier MediHeim MH-2800 Modified equipment, Maximum sprayed rate: 250 ml/hr
Nylon net filter hydrofilic, 180 μm EMD Millipore NY8H04700
Polycarbonate mold Customized mold for fabrication of a PDMS frame pattern

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References

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Son, J., Bae, C. Y., Park, J. K. Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture. J. Vis. Exp. (107), e53475, doi:10.3791/53475 (2016).

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