Introduction
Молоко является единственным источником питания для новорожденных млекопитающих, обеспечивая энергию и питательные вещества для роста младенцев и развития 1,2. В то время как молоко, главным образом, состоит из клеток, липидов и белков 1, он также содержит множество биологически активных соединений, которые модулируют раннее развитие жизни потомства в том числе ферментов, углеводов, гормонов, антител, факторов роста, цитокинов, экзосомы, микропузырьков, и малых РНК таких а микроРНК 1,2. Фундаментальная роль материнского молока в создании потомства иммунной и здоровья кишечника 3, в сочетании с доказательством того, что грудное вскармливание младенцев менее восприимчивы к болезни 2, подчеркивает важность определения компонентов молока, связанные с процессами заболевания в раннем возрасте и молекулярные механизмы, вовлеченные в своих действиях. Развивающийся крыса популярной моделью для изучения влияния различной пищевой, физиологических и химических вмешательств на ранней-Жизнь развитие 4. Поэтому анализ молоке крыса может обеспечить новый понимание здоровья матери и потомства.
Текущие научные достижения в настоящее время обеспечивают расширение возможностей для углубленного исследования воздействия конкретных компонентов молока на здоровье и болезни. Например, последовательность молока бактериальных профилям выяснены их роль в начале кишечной колонизации младенческой кишки 5, масс-спектрометрия анализ молока олигосахаридов проливают в изменении профилей молоко олигосахаридов с помощью материнской диеты 6 и глубокой последовательности микроРНК, выделяемой в жировые шарики грудного молока подчеркивает возможные роли в транскрипции генов, метаболизм и иммунную функцию 7.
Модели крыс представляют собой один из самых популярных модельных организмов, используемых в материнских исследований 8,9. Одним из преимуществ является их короткие беременности и лактации периоды, длящиеся только approximatЭлай 21 дней каждый; Поэтому общее время от начала беременности до лактации представляет собой короткий период времени, в котором ценные данные могут быть получены. Чем больше размер крыс по сравнению с мышами, в контексте сбора молока, может обеспечить значительные преимущества по отношению к объему молока и легкости сбора молока; производство молока у мышей, например, по-видимому, зависит от общей массы тела с более тяжелыми мышей, продуцирующих молоко 10 больше.
Здесь общее описание для ручного сбора молока от кормящих крысы предоставляется. Этот протокол требует минимального оборудования, является неинвазивным, недорогим и могут быть использованы для сбора адекватных объемов молока для последующих анализов дальнейших. Вкратце, плотина под наркозом с изофлуран, молоко разочарование стимулируется окситоцин, и молоко собирают в пробирки с помощью капиллярных ручной выражения молока. Наконец, как двух основных компонентов молока жиры и протеины краткое Descriptioп оценки молока содержание жира, используя измерения creamatocrit 11 и количественное общей концентрации белка с использованием стандартного анализа белка представлена.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол был одобрен университета Калгари комитета по уходу за животными и соответствовала Руководству по уходу и использованию лабораторных животных.
1. Отдельные плотины из Offspring
- Отделите от плотины ее потомства в течение как минимум 5 мин до доения 12.
ПРИМЕЧАНИЕ: Плотина можно доить до 5-6 ч после разделения 1,6,13, однако периоды разлуки дольше, чем 4 часа может изменить состав молока 14. В то время как время разделения, кажется, не влияют на объем молока сбора 12, он сообщил, что последовательное время разделения сохраняется на протяжении всего исследования. Состав молока могут изменяться в течение лактации 15, поэтому попытки должны быть сделаны, чтобы сохранить день сбора молока последовательной. Максимальная производство молока предложил происходят на лактации 14 12 день. - Использование потепления камеру, убедитесь, что щенки в состоянии поддерживать надлежащий temperatu телаповторно без присутствия матери на время процедуры доения.
ПРИМЕЧАНИЕ: В исследовании, представленном ниже, доение осуществляется при отъеме, когда плотины были приблизительно 22 недель и потомство 21 дней, не был использован, поэтому нет потепление камера.
2. Установка и подготовка
- Соберите все материалы, необходимые для процедуры доения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все материалы можно найти в материалах и оборудования таблице. - Поместите грелку на скамейке, где доение будет происходить и покрыть площадку с абсорбирующим скамейке под-панели.
- Настройте обезболивающий системы. Убедитесь, что система имеет достаточное количество кислорода и изофлуран до начала. Прикрепите обезболивающий маска, которая будет использоваться для первоначального анестезии индукции к машине. Поместите маску, которая будет использоваться для обслуживания анестезии поблизости, если отличается от первоначального анестетика маски.
- Прикрепите иглу 25 G к 1 мл шприц для окситоцинаинъекции с помощью асептической техники.
- Включите грелку таким образом, что материнский температура тела поддерживается в ходе процедуры доения. ПРИМЕЧАНИЕ: Контролируйте температуру грелку, чтобы обеспечить площадку не становится слишком жарко и вызвать ожоги. Кроме того, использование источника тепла, например, операционный стол с подогревом, который может быть установлен до определенной температуры.
3. Обезболить плотины Использование Isoflurane
- Откройте кислородный баллон и поверните поток до 1 л (1000 куб.см) на мин. Включите потока изофлюрана и устанавливается на 5%. ВНИМАНИЕ: Избегайте прямого вдыхания анестетика и предотвратить накопление обезболивающий паров.
- Обезболить плотину.
- Переключитесь на маску обслуживания, если требуется, размещение дамбы на спине на скамейке поглощающей панели. Подтвердите обезболивания отсутствием педали рефлекс.
- Уменьшить поток изофлуран в 2-3% для поддержания анестезии. Постоянно следить за дамбу на протяжении всей процедуры для обеспечения де-Pression дыхания не происходит. ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как под наркозом, глаза плотины должен быть защищен с помощью стерильного глаз смазку, чтобы предотвратить глаза от высыхания или становятся поцарапан.
4. Окситоцин Инъекции
- Убедитесь, что окситоцин (20 USP единиц / мл) не прошел срок годности. Лечить флакон окситоцина с стерильные спиртом / алкоголя чистки клавиатуры.
- С помощью асептической техники, составить 2 МЕ (0,1 мл) окситоцина в шприц. Используйте новую иглу и шприц для каждой плотины, которые будут доить.
Примечание: Окситоцин дозы обычно в диапазоне от одной инъекции 1 до 5 МЕ 1,6,12,16. Кроме того, в дозе 4 МЕ / кг массы тела может быть использован 12. Разовая доза 2 МЕ может повторяться один раз, если трудность доения встречается. - Вводите окситоцин внутрибрюшинно. Вставьте иглу в правом нижнем квадранте живота с иглы, указывая к голове под углом15-30 °, около 0,5 см в глубину.
- Потяните на поршень, чтобы обеспечить отрицательное давление перед инъекцией. Если какой-либо жидкости (кровь, моча, содержимое кишечника и т.д.) отбирают в шприц, снимите иглу и попытаться инъекции с новой иглы и шприца. Если жидкость не всасывается ввести окситоцин и выбросьте иглу и шприц непосредственно в контейнер для биологически опасных.
- Подождите примерно 5-15 мин для окситоцина для стимуляции молока разочарование.
5. Подготовка доильные сайты
- Выберите сайты / соски, из которых будут собираться молоко. Молоко может быть собрана из любого соска 12.
- Аккуратно снимите шерсть вокруг сосков, чтобы быть доили с триммером, а мех может вызвать трудности в сборе образца из-за капиллярного затекания молока. Будьте нежны - кожа вокруг сосков является чрезвычайно чувствительным и может быть сухим и, как таковая, восприимчива к царапинам и слез.
- Стерилизация соска IS не нужно, но необязательно, очистить соску с теплой водой после мех удален. Подготовьте по крайней мере, два места, как более чем один сайт может потребоваться для сбора молока.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если анализ молока включает в себя микробной профилирование, площадь соска может потребовать стерилизации с йодом 5.
6. Молоко Коллекция
- Слегка сожмите основание соска, вручную изгнания молока для коллекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если анализ молока включает в себя микробной профилирование, первые несколько капель молока должны быть отброшены. - Сбор капельки молока в капиллярной трубке, наполняя капиллярной трубки. Капиллярные трубки, которые приспосабливают большие объемы (например, 50 мкл) облегчить процесс.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если сложность в сборе молока встречается, вторая доза окситоцина можно вводить. Рекомендуется доза не должна превышать 4 общей МЕ. - Разлить молоко из капиллярной трубки в стерильную пробирку микроцентрифужных покасаясь конец трубки, который был использован, чтобы сделать молоко из соска к стороне трубки микроцентрифужных - наблюдать молоко втягивается из капиллярной трубки с помощью капиллярного действия.
Примечание: "Продуть 'молоко, не засасывают в эту трубку с помощью 18 г иглу, прикрепленную к 1 мл шприца. - Постоянно следить за дамбу на наличие признаков боли или дыхания и регулировать поток ИФ соответственно.
- Продолжайте собирать молоко, как описано в этом разделе, пока молоко не достаточно было собрано для выбранного анализа молока. Для определения концентрации белка и creamatocrit описано ниже, собирать 0,25 мл молока.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте другую доения сайт, если молоко разочарование замедляется или выбранный сайт не высылать молоко достаточно. Максимум приблизительно 2,5 мл молока на животное могут быть собраны 17, или до 0,5 мл на соске. Авторы рекомендуют общее время под наркозом, ограничивается примерно 45-60 мин, оR 45 мин доения. - Сбор молока в гематокритную микропробирку трубки для измерения creamatocrit из свежих образцов молока, и запечатать конец трубки с глиной герметиком. Этикетка Microhematocrit трубку с плотины ID и хранить образцы молока в вертикальном положении.
- Когда доения полная, выключите поток изофлуран и кислорода. Удалить маску с плотины и продолжит следить за плотину, пока бодрствует. Рекомендуется, что если не в полном сознании, плотина должна быть помещена на скамейке абсорбирующего площадку в течение периода восстановления, а не непосредственно на клетки постельных принадлежностей, чтобы предотвратить кроватях от того атмосферный или царапин глаза плотины во время восстановления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте без присмотра плотину, пока не восстановил достаточную сознание поддерживать грудины recumbancy. - Если дальнейшие анализы не требуются, заморозить молоко при температуре -80 ° С. Другие предположили, что молоко можно хранить до 3 часов при 4 ° С или 5 месяцев при -20 ° С 18.
7. Измерение Creamatocrit
- Оценить содержание жира в молоке путем расчета молока creamatocrit (процент сливок в образце молока) 19.
Примечание: Измерения с молоке показали, что либо свежие или замороженные молоко может быть использовано для измерения creamatocrit, однако свежее молоко более высокую корреляцию (г = 0,92 по сравнению с R = 0,90) с концентрацией липида 11. Использование свежей или замороженной молока для измерения creamatocrit должны храниться последовательно через исследования, а оттаивают молоко связано с небольшим снижением creamatocrit значения 11. - Для свежего молока, собираем образец молока из соска в гематокритную микропробирку трубки; заполнить по крайней мере на ¾ (примерно 15-20 мкл). Кроме того, привлечь свежее молоко от собранной пробы в капиллярной трубке после смешивания хорошо. Печать конец с глиной герметиком.
- Поместите капиллярную трубку в гематокрита блесны, сзапечатаны концом вперед снаружи, обеспечивая центрифуги является сбалансированным.
- Начните спина гематокрита (120 сек при 13700 мкг).
ПРИМЕЧАНИЕ: время отжима или скорость может меняться в зависимости от модели центрифуги используются. - Снимите трубку из центрифуги после спин является полным и выполнить измерения для расчета creamatocrit. Соблюдайте разделение сэмпла в сливочном слоя и прозрачного слоя.
- Измерьте и запишите общую длину жидкости в трубе и длину жира (сливки) слой с помощью циркуля или линейки.
Примечание: creamatocrit выражается как процент от кремового слоя в образце молока 19, в расчете на (длины слоя крема / общая длина колонны молока) х 100 (фиг.1А). Рассчитать жира концентрации и значения энергии из измерения creamatocrit следующим образом: концентрацию жира (г / л) = (creamatocrit (%) - 0,59) /0.146 (рис 1B) 19; Энергетическая ценность (ксAL / л) = 290 + (66,8 * creamatocrit (%) (рис 1С) 19.
Определение концентрации белка 8.
- Использование альбумина бычьей сыворотки в качестве белкового стандарта, определяют общую концентрацию белка молока с использованием стандартного анализа белка, такого как белок анализа Lowry 6.
Примечание: Разбавление молока могут быть необходимы для измерения молочного белка, подпадают под стандартной кривой анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Молоко было собрано, как описано при отъеме от Вистар плотин (около 22 недель назад, весом от 350 до 400 г), что потребляется контроль (AIN-93G, N = 5), с высоким содержанием белка (40% казеина вес / вес, п = 5) или высокой пребиотических волокон (21,6% вес / вес, соотношение 1: 1 олигофруктозы и инулина, N = 4) диеты на протяжении беременности и лактации. Доза окситоцин был 2 МЕ. Молоко было собрано с помощью капиллярных трубок, и одна трубка была выделена с помощью гематокрита счетчик для определения creamatocrit (рис 1А), который затем был использован для оценки жира концентрации и энергетическую ценность в соответствии с: концентрации жира (г / л) = (creamatocrit (% ) -0,59) /0.146 (1В); Энергетическая ценность (ккал / л) = 290 + (66,8 * creamatocrit (%) (рис 1С) 19. Концентрация молочного белка определяли с помощью анализа белка Bio-Rad постоянного тока (рисунок 2). Там не было никаких различий в creamatocrit (р = 0,674), жир концентрация (р = 0,674), значение энергии (р = 0,674), оКонцентрация белка г (р = 0,127) на основе материнской диеты (односторонним ANOVA).
Рисунок 1. Молоко creamatocrit, жир концентрация, и энергетическая ценность. Образцы молока были собраны при отъеме от Вистар плотин по контролю (п = 5), с высоким содержанием белка (п = 5), или высокий Пребиотик волокна (п = 4) диеты во время беременности и в период лактации. Creamatocrit измерения (A) были использованы для расчета концентрации молочного жира (B) и энергетической ценности (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Общая концентрация белка молока. Образцы молока были собиратьред при отъеме от Вистар плотин по контролю (п = 5), с высоким содержанием белка (п = 5), или высокий Пребиотик волокна (п = 4) диеты на протяжении беременности и в период лактации. Общая концентрация белка определяли с помощью анализа Bio-Rad DC белка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конфликта интересов раскрывать. Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с протоколами блока ССАС одобрен.
Acknowledgments
Это работает при поддержке за счет субсидий из естественных наук и инженерного исследовательский совет Канады (RGPIN 238382-2011) и Канадского института исследований в области здравоохранения (MOP115076). Хизер Павел поддерживается естественных и технических наук исследовательский совет Канады последипломного стипендий и стипендий Альберта инновационную Solutions Здоровье. Меган Халлам была поддержана естественных и технических наук Исследования последипломного Совет стипендии, в Фредерик Бантинг и Чарльз Лучший Канаде Высшей стипендии, а Альберта детской больницы научно-исследовательский институт подготовки премии в области генетики, развития ребенка, и здоровья.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment - Milking | |||
| 1 ml syringes | BD-Canada | 309602 | |
| 25 G needles | BD-Canada | 305122 | |
| 18 G needles | BD-Canada | 305196 | |
| 50 μl Microdispenser Capillary Tubes | Fisher Scientific | 21-169D | |
| Oxytocin (20 USP Units/ml) | Bimeda-MTC | 1OXY015 | |
| PPC Vet Isoflurane Inhalation Anesthetic, 250 ml | Fresenius Kabi | M60302 | Used on the order of a veterinarian |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Dukal | 853 | |
| Absorbent Bench Underpad | VWR | 82020-845 | |
| Maxi-Therm Hyper/Hypothermia Blanket | Cincinnati Sub-Zero | 274 | |
| Rodent Anesthesia Machine with Vaporizer | Benson Medical Industries Inc. | Subject to individual laboratory needs | |
| Animal Masks | Benson Medical Industries Inc. | 50100/50102 | |
| Microcentrifuge Tubes | Axygen | MCT-060-C | |
| ChroMini Professional Trimmer | Wahl | ||
| Equipment - Creamatocrit | |||
| StatSpin SafeCrit Plastic Microhematocrit Tubes (Untreated) | Fisher Scientific | 22-274-914 | |
| Critoseal Capillary Tube Sealant Tray | VWR | 470161-478 | |
| StatSpin CritSpin Microhematocrit Centrifuge | Beckman Coulter, Inc | X00-004999-001 |
References
- Izumi, H., Kosaka, N., Shimizu, T., Sekine, K., Ochiya, T., Takase, M. Time-dependent expression profiles of microRNAs and mRNAs in rat milk whey. PLoS ONE. 9 (2), e0088843 (2014).
- Hsieh, C. C., Hernández-Ledesma, B., Fernández-Tomé, S., Weinborn, V., Barile, D., de Moura Bell, J. M. Milk Proteins, Peptides, and Oligosaccharides: Effects against the 21st Century Disorders. BioMed Res. Int. , (2015).
- Rogier, E. W., et al. Lessons from mother: Long-term impact of antibodies in breast milk on the gut microbiota and intestinal immune system of breastfed offspring. Gut Microbes. 5 (5), 663-668 (2014).
- Keen, C. L., Lönnerdal, B., Clegg, M., Hurley, L. S. Developmental changes in composition of rat milk: trace elements, minerals, protein, carbohydrate and fat. J. of Nutr. 111 (2), 226-236 (1981).
- Cabrera-Rubio, R., Collado, M. C., Laitinen, K., Salminen, S., Isolauri, E., Mira, A. The human milk microbiome changes over lactation and is shaped by maternal weight and mode of delivery. Am. J. Clin. Nutr. 96 (3), 544-551 (2012).
- Hallam, M. C., Barile, D., Meyrand, M., German, J. B., Reimer, R. A. Maternal high-protein or high-prebiotic-fiber diets affect maternal milk composition and gut microbiota in rat dams and their offspring. Obesity. 22 (11), 2344-2351 (2014).
- Munch, E. M., et al. Transcriptome Profiling of microRNA by Next-Gen Deep Sequencing Reveals Known and Novel miRNA Species in the Lipid Fraction of Human Breast Milk. PLoS ONE. 8 (2), e50564 (2013).
- Li, M., Sloboda, D. M., Vickers, M. H. Maternal obesity and developmental programming of metabolic disorders in offspring: Evidence from animal models. Exp Diabetes Res. 2011, (2011).
- Ellis, P. J. I., et al. Thrifty metabolic programming in rats is induced by both maternal undernutrition and postnatal leptin treatment, but masked in the presence of both: implications for models of developmental programming. BMC Genomics. 15, 49 (2014).
- Gomez-Gallago, C., et al. A method to collect high volumes of milk from mice (Mus musculus). An. Vet. Murcia. 29, 55-61 (2013).
- Wang, C. D., Chu, P. S., Mellen, B. G., Shenai, J. P. Creamatocrit and the nutrient composition of human milk. J. Perinatol. 19 (5), 343-346 (1999).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab. Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- Godbole, V. Y., Grundleger, M. L. Composition of rat milk from day 5 to 20 of lactation and milk intake of lean and preobese zucker pups. J. Nutr. 111 (3), 480-487 (1981).
- Del Prado, M., Delgado, G., Villalpando, S. Maternal lipid intake during pregnancy and lactation alters milk composition and production and litter growth in rats. J. Nutr. 127 (3), 458-462 (1997).
- Nicholas, K. R., Hartmann, P. E. Milk secretion in the rat: progressive changes in milk composition during lactation and weaning and the effect of diet. Comp. Biochem. Physiol. A. Comp. Physiol. 98 (3-4), 533-542 (1991).
- Azara, C. R. P., et al. Ethanol intake during lactation alters milk nutrient composition and growth and mineral status of rat pups. Biol. Res. 41 (3), 317-330 (2008).
- Keen, C. L., Lönnerdal, B., Sloan, M. V., Hurley, L. S. Effects of milking procedure on rat milk composition. Physiol. Behav. 24 (3), 613-615 (1980).
- Romeu-Nadal, M., Castellote, A. I., Lòpez-Sabater, M. C. Effect of cold storage on vitamins C and E and fatty acids in human milk. Food Chem. 106 (1), 65-70 (2008).
- Lucas, A., Gibbs, J. A., Lyster, R. L., Baum, J. D. Creamatocrit: simple clinical technique for estimating fat concentration and energy value of human milk. Br. Med. J. 1 (6119), 1018-1020 (1978).
- Furtado, K., Andrade, F. Comparison of the beneficial and adverse effects of inhalable and injectable anaesthetics in animal models: a mini-review. OA Anaesthetics. 1 (2), 20 (2013).
- Hausman Kedem, M., et al. The effect of advanced maternal age upon human milk fat content. Breastfeed. Med. 8 (1), 116-119 (2013).
- Mandel, D., Lubetzky, R., Dollberg, S., Barak, S., Mimouni, F. B. Fat and energy contents of expressed human breast milk in prolonged lactation. Pediatrics. 116 (3), e432-e435 (2005).
