Introduction
Mælk er den eneste kilde til ernæring til nyfødte pattedyr, der giver energi og næringsstoffer for barnets vækst og udvikling 1,2. Mens mælk består hovedsageligt af celler, lipider og protein 1, indeholder den også en overflod af bioaktive forbindelser, der modulerer tidlige udvikling levetid afkom herunder enzymer, kulhydrater, hormoner, antistoffer, vækstfaktorer, cytokiner, exosomer, mikrovesikler, og små RNA'er sådanne som microRNA 1,2. Den grundlæggende rolle modermælk i etableringen af afkommet immune og tarm sundhed 3, kombineret med beviser for, at ammede børn er mindre modtagelige for sygdomme 2, fremhæver betydningen af at identificere de mælkebestanddele forbundet med sygdomsprocesser tidligt i livet, og de molekylære mekanismer, der er involveret i deres handlinger. Den udvikling rotte er en populær model til at undersøge effekten af forskellige ernæringsmæssige, fysiologiske og kemiske interventioner på tidlig-Life udvikling 4. Analysen af rottemælk kan derfor give nye indsigt i mødres og afkom sundhed.
Aktuelle videnskabelige fremskridt nu give øgede muligheder for dybdegående undersøgelser af effekterne af specifikke mælkebestanddele om sundhed og sygdom. For eksempel har sekventering af mælk bakterielle profiler belyst deres rolle i begyndelsen af intestinal kolonisering af barnet gut 5, har massespektrometrianalyse af mælkeoligosaccharider givet indsigt i ændringen af mælk oligosaccharid profiler via moderens kost 6, og dyb sekventering af microRNA udskilles i fedtkuglerne i modermælk fremhæver mulige roller i gentranskription, metabolisme og immunfunktion 7.
Rottemodeller repræsenterer en af de mest populære modelorganismer anvendes i maternelle studier 8,9. En fordel er deres korte drægtighed og amning perioder, der varer kun approximatEly 21 dage hver; derfor den samlede tid fra starten af graviditeten for at amning udgør en kort periode, hvor værdifulde data kan genereres. Den større størrelse af rotter sammenlignet med mus, i forbindelse med indsamling af mælk, kan give en betydelig fordel med hensyn til mængden af mælk og lettere opkrævning mælk; mælkeproduktionen i mus, for eksempel synes at være afhængig af den totale kropsvægt med tungere mus producerer mere mælk 10.
Her en generel beskrivelse til manuel indsamling af mælk fra diegivende rotter forudsat. Denne protokol kræver minimal udstyr, er non-invasiv, billig, og kan bruges til at indsamle tilstrækkelige mængder af mælk til yderligere downstream analyser. Kort sagt, er dæmningen bedøvet med isofluran, mælkeaftapningssekvens stimuleres af oxytocin og mælk opsamles i kapillarrør via manuel ekspression af mælken. Endelig, som to vigtigste komponenter i mælk er fedt og proteiner, en kort description estimere mælkefedtindhold hjælp creamatocrit målinger 11 og kvantificering af total proteinkoncentration ved anvendelse af en standard proteinanalyse præsenteres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol blev godkendt af University of Calgary Animal Care Udvalg og var i overensstemmelse med vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr.
1. Separat Dam fra Afkom
- Adskil dæmningen fra hendes afkom i mindst 5 minutter før malkning 12.
BEMÆRK: Dæmningen kan malkes op til 5-6 timer efter separation 1,6,13 dog perioder med separation længere end 4 timer kan ændre mælkens sammensætning 14. Mens adskillelse tid ikke synes at påvirke indsamling af mælk volumen 12, anbefales det, at en konsekvent adskillelse tid opretholdes under hele undersøgelsen. Mælk sammensætning kan ændre sig i løbet amning 15, derfor forsøg bør gøres for at holde indsamlingsdagen konsistent mælk. Maksimal mælkeproduktion foreslås at forekomme på amning dag 14 12. - Ved hjælp af en opvarmning kammer, sikre hvalpene er i stand til at opretholde en ordentlig krop tempere uden tilstedeværelsen af deres mor for varigheden af malkeprocessen.
BEMÆRK: I undersøgelsen præsenteres nedenfor, blev malkning udført ved fravænning, da dæmningerne var ca. 22 uger gammel og The Offspring 21 dage gammel, derfor ingen opvarmning kammer blev brugt.
2. Opstilling og klargøring
- Indsamle alle nødvendige materialer til malkeproceduren.
BEMÆRK: Alle materialer kan findes i materialer og udstyr tabel. - Placer en varmepude på bænken, hvor malkningen finder sted, og dækker puden med et absorberende bænk under-pad.
- Opsætning af bedøvelsesmiddel system. Sørg for, at systemet har tilstrækkelig ilt og isofluran før begyndelsen. Fastgør narkosemasken, der skal bruges til den indledende anæstesi-induktion til maskinen. Placer maske, der vil blive anvendt til anæstesi vedligeholdelse i nærheden, hvis anderledes end den oprindelige narkosemasken.
- Vedhæft en 25 G nål til en 1 ml sprøjte til oxytocininjektion ved brug af aseptisk teknik.
- Tænd varmepude, så maternal kropstemperaturen opretholdes under malkeprocessen. BEMÆRK: overvåge temperaturen i varmepuden at sikre puden ikke bliver for varmt og forårsage forbrændinger. Alternativt kan du bruge en varmekilde, såsom en opvarmet operationsbord, der kan indstilles til en bestemt temperatur.
3. Bedøver Dam Brug Isofluran
- Åbn ilt tank og drej strømmen til 1 L (1000 cc) pr min. Tænd for strømmen af isofluran og sat til 5%. ADVARSEL: Undgå direkte indånding af bedøvelsesmiddel og forhindre ophobning af bedøvende dampe.
- Bedøver dæmningen.
- Skift til vedligeholdelse maske, hvis det kræves, at placere dæmningen liggende på bænken absorberende pude. Bekræft bedøvelse ved manglende pedal refleks.
- Reducere strømmen af isofluran til 2-3% til vedligeholdelse af anæstesi. Løbende overvåge dæmning hele proceduren for at sikre depression af respiration ikke forekommer. BEMÆRK: Når under anæstesi, bør dæmningens øjne beskyttes ved anvendelse af en steril øjensalve at forhindre øjnene mod udtørring eller bliver ridset.
4. Oxytocin Injection
- Sørg for oxytocin (20 USP enheder / ml) har ikke bestået sin udløbsdato. Desinficere hætteglasset med oxytocin med en steril spritserviet / alkohol udrensning pad.
- Ved hjælp af aseptisk teknik, udarbejde 2 IE (0,1 ml) af oxytocin i sprøjten. Brug en ny nål og sprøjte for hver dæmning, som vil blive malket.
BEMÆRK: Oxytocin doser vil generelt ligge i området fra enkelte injektioner af 1 til 5 IU 1,6,12,16. Alternativt kan en dosis på 4 IU / kg legemsvægt anvendes 12. En enkelt dosis på 2 IU kan gentages én gang, hvis vanskeligheder malkning stødt. - Injicere oxytocin intraperitonealt. Stik nålen ind i den nederste højre kvadrant af maven med nålen pegende mod hovedet, i en vinkel15-30 °, omkring 0,5 cm dyb.
- Træk tilbage i stemplet for at sikre undertryk før injektion. Hvis nogen væske (blod, urin, tarmindhold, etc.) opsuges i sprøjten, fjernes kanylen og forsøge at injektion med en ny nål og sprøjte. Hvis der ikke væske opsuges injicere oxytocin og bortskaffelse af nålen og sprøjten straks ind i en biologisk farlige beholder.
- Vent cirka 5-15 minutter for oxytocin for at stimulere mælk konstruktionsmaskiner.
5. Udarbejdelse af Malkning steder
- Vælg de websteder / patter, hvis mælk vil blive indsamlet. Mælk kan indsamles fra enhver patten 12.
- Fjern forsigtigt pelsen omkring patterne at blive malket med trimmere, som pels kan medføre besvær med prøvetagning på grund vægevirkning af mælken. Være blid - huden omkring patterne er yderst følsom og kan være tør og er som sådan modtagelige for ridser og tårer.
- Sterilisering af patten ier ikke nødvendigt, men eventuelt rense patten med lunkent vand efter pelsen er fjernet. Forbered mindst to lokaliteter som mere end et sted kan være påkrævet til indsamling af mælk.
BEMÆRK: Hvis analysen mælken indeholder mikrobielle profilering, kan patten område kræver sterilisation med jod 5.
6. Mælk Collection
- Tryk forsigtigt på bunden af patten, manuelt udkasterladning mælken til afhentning.
BEMÆRK: Hvis analysen mælken indeholder mikrobiel profilering, bør de første par dråber mælk kasseres. - Saml mælkedråber i et kapillarrør, påfyldning kapillarrøret. Kapillarrør, der tilgodeser større mængder (f.eks 50 pi) lette processen.
BEMÆRK: Hvis vanskeligheder med at indsamle mælk stødt på, kan en anden dosis af oxytocin administreres. Det anbefales dosis ikke overstige 4 IU total. - Dispensere mælken fra kapillarrøret i en steril mikrocentrifugerør vedrører enden af røret, der blev brugt til at suge mælk fra patten til side af mikrocentrifugerør - observere mælken blive trukket ud af kapillarrøret via kapillarvirkning.
BEMÆRK: Blow out "mælk, der ikke er trukket ind i røret ved hjælp af en 18 G nål fastgjort til en 1 ml sprøjte. - Løbende overvåge dæmningen for tegn på smerte eller respiratorisk depression og justere strømmen af isofluran i overensstemmelse hermed.
- Fortsæt med at indsamle mælk, som beskrevet i dette afsnit indtil tilstrækkelig mælk er blevet indsamlet for den valgte mælk analyse. For beskrev creamatocrit og protein koncentrationsbestemmelse nedenfor, indsamler 0,25 ml mælk.
BEMÆRK: Brug en anden malkning websted, hvis mælk konstruktionsmaskiner forsinker eller det valgte sted ikke udvise mælk tilstrækkeligt. Højst ca. 2,5 ml mælk pr dyr kan opsamles 17, eller op til 0,5 ml pr patten. Forfatterne anbefaler, at den samlede tid under bedøvelse være begrænset til ca. 45-60 min, or 45 min af malkningen. - Saml mælk i en microhematocrit rør til creamatocrit måling fra friske mælkeprøver, og forsegle enden af røret med ler fugemasse. Mærk microhematocrit rør med dæmningen id og prøven mælk gemme oprejst.
- Når malkningen er færdig, skal du slukke for strømmen af isofluran og ilt. Fjern masken fra dæmningen og fortsætte med at overvåge dæmning indtil vågen. Det anbefales, at hvis ikke ved fuld bevidsthed, bør dæmningen placeres på et absorberende bænk pude i løbet af tilbagebetalingsperioden, i stedet for direkte på buret strøelse, for at forhindre, strøelse bliver indsugning eller ridse dæmningen øjne under opsving.
BEMÆRK: Lad ikke dæmningen uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystbenet recumbancy. - Hvis der ikke kræves yderligere analyser, fryse mælk ved -80 ° C. Andre har foreslået, at mælken kan opbevares i op til 3 timer ved 4 ° C eller 5 måneder ved -20 ° C 18.
7. Creamatocrit Måling
- Vurdere fedtindholdet i mælken ved at beregne mælken creamatocrit (procentdelen af fløde i prøven mælk) 19.
BEMÆRK: Målinger med modermælk har vist, at enten friske eller frosne mælk kan anvendes til en creamatocrit måling, men frisk mælk er mere stærkt korreleret (r = 0,92 versus r = 0,90) med lipidkoncentration 11. Brugen af mælk frisk eller frosset til creamatocrit målinger skal holdes konsistent i hele undersøgelsen, som optøet mælk er forbundet med et mindre fald i creamatocrit værdier 11. - Til frisk mælk, indsamle en prøve af mælk fra patten i en microhematocrit rør; fylde mindst ¾ fuld (ca. 15-20 pi). Alternativt trækker frisk mælk fra det indsamlede prøven i kapillarrøret efter blanding godt. Seal enden med ler fugemasse.
- Placer kapillarrøret i hæmatokrit spinner, medforseglede ende peger mod ydersiden, sikrer centrifugen er afbalanceret.
- Begynd hæmatokritværdien centrifugering (120 sekunder ved 13.700 xg).
BEMÆRK: Spin tid eller hastighed kan ændre sig afhængigt af modellen af centrifuge anvendes. - Fjern slangen fra centrifugen efter spin er færdig, og udføre de målinger til beregning af creamatocrit. Observere prøven adskillelse i en creme lag og et klart lag.
- Mål og registrere den samlede længde af væske i røret og længden af fedt (fløde) lag bruge calipre eller en lineal.
BEMÆRK: creamatocrit udtrykkes som procentdelen af cremen lag i mælkeprøven 19, beregnes som (længde cremelag / samlet længde på mælk kolonne) x 100 (figur 1A). Beregn fedtkoncentrationen og energiværdierne fra creamatocrit måling som følger: Fedt koncentration (g / L) = (creamatocrit (%) - 0,59) /0.146 (figur 1B) 19; Energiværdi (kcal / L) = 290 + (66,8 * creamatocrit (%) (figur 1C) 19.
8. Protein koncentrationsbestemmelse
- Brug af bovint serumalbumin som et protein standard, bestemmelse af total mælkeprotein koncentration på en standard protein assay, såsom en Lowry-proteinanalyse 6.
BEMÆRK: Fortynding af mælken kan være nødvendigt for Mælkeproteinet målinger for at falde inden for standardkurve for assayet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mælk blev opsamlet som beskrevet ved fravænning fra Wistar dæmninger (ca. 22 uger gamle, der vejer 350 til 400 g), der forbruges en kontrol (AIN-93G, n = 5), højt proteinindhold (40% casein vægt / vægt, n = 5) eller høj præbiotiske fibre (21,6% vægt / vægt, 1: 1-forhold mellem oligofruktose og inulin, n = 4) kost hele graviditet og amning. Dosis oxytocin var 2 IE. Mælk blev opsamlet ved hjælp af kapillarrør og et rør blev centrifugeret ved anvendelse af en hæmatokrit spinner at bestemme creamatocrit (figur 1A), som derefter blev anvendt til at estimere fedt koncentration og energiindhold ifølge: Fat koncentration (g / L) = (creamatocrit (% ) -0,59) /0.146 (figur 1B); Energiværdi (kcal / l) = 290 + (66,8 * creamatocrit (%) (figur 1C Mælkeprotein koncentrationen blev bestemt ved anvendelse af Bio-Rad DC-proteinassayet (figur 2)) 19.. Der var ingen forskelle i creamatocrit (p = 0,674), fedtkoncentration (p = 0,674), energiværdi (p = 0,674), oR proteinkoncentration (p = 0,127) baseret på moderens kost (envejs ANOVA).
Figur 1. Mælk creamatocrit, fedt koncentration og energi værdi. Mælkeprøver blev indsamlet ved fravænning fra Wistar dæmninger på kontrol (n = 5), High Protein (n = 5), eller High Prebiotic Fibre (n = 4) kost hele graviditet og amning. Creamatocrit målinger (A), blev anvendt til at beregne koncentrationen mælkefedt (B) og energi værdi (C). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Samlet mælkeprotein koncentration. Mælkeprøver var indsamleed ved fravænning fra Wistar dæmninger på kontrol (n = 5), High Protein (n = 5), eller High Prebiotic Fibre (n = 4) kost hele graviditet og amning. Total proteinkoncentration blev bestemt ved anvendelse af Bio-Rad DC proteinassayet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre. Alle dyreforsøg blev gennemført i overensstemmelse med CCAC godkendte protokoller.
Acknowledgments
Dette fungerer blev støttet gennem tilskud fra naturvidenskab og teknik Forskningsråd of Canada (RGPIN 238382-2011) og canadiske Institutes of Health Research (MOP115076). Heather Paul blev understøttet af en naturvidenskab og teknik Forskningsråd Canada Postgraduate Scholarship og en Alberta innoverer Health Solutions stipendium. Megan Hallam blev understøttet af en naturvidenskab og teknik Forskningsråd Postgraduate Scholarship, en Frederick Banting og Charles Best Canada Graduate Scholarship og en Alberta Børnehospital Research Institute Training Award i genetik, Børns Udvikling og Sundhed.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment - Milking | |||
| 1 ml syringes | BD-Canada | 309602 | |
| 25 G needles | BD-Canada | 305122 | |
| 18 G needles | BD-Canada | 305196 | |
| 50 μl Microdispenser Capillary Tubes | Fisher Scientific | 21-169D | |
| Oxytocin (20 USP Units/ml) | Bimeda-MTC | 1OXY015 | |
| PPC Vet Isoflurane Inhalation Anesthetic, 250 ml | Fresenius Kabi | M60302 | Used on the order of a veterinarian |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Dukal | 853 | |
| Absorbent Bench Underpad | VWR | 82020-845 | |
| Maxi-Therm Hyper/Hypothermia Blanket | Cincinnati Sub-Zero | 274 | |
| Rodent Anesthesia Machine with Vaporizer | Benson Medical Industries Inc. | Subject to individual laboratory needs | |
| Animal Masks | Benson Medical Industries Inc. | 50100/50102 | |
| Microcentrifuge Tubes | Axygen | MCT-060-C | |
| ChroMini Professional Trimmer | Wahl | ||
| Equipment - Creamatocrit | |||
| StatSpin SafeCrit Plastic Microhematocrit Tubes (Untreated) | Fisher Scientific | 22-274-914 | |
| Critoseal Capillary Tube Sealant Tray | VWR | 470161-478 | |
| StatSpin CritSpin Microhematocrit Centrifuge | Beckman Coulter, Inc | X00-004999-001 |
References
- Izumi, H., Kosaka, N., Shimizu, T., Sekine, K., Ochiya, T., Takase, M. Time-dependent expression profiles of microRNAs and mRNAs in rat milk whey. PLoS ONE. 9 (2), e0088843 (2014).
- Hsieh, C. C., Hernández-Ledesma, B., Fernández-Tomé, S., Weinborn, V., Barile, D., de Moura Bell, J. M. Milk Proteins, Peptides, and Oligosaccharides: Effects against the 21st Century Disorders. BioMed Res. Int. , (2015).
- Rogier, E. W., et al. Lessons from mother: Long-term impact of antibodies in breast milk on the gut microbiota and intestinal immune system of breastfed offspring. Gut Microbes. 5 (5), 663-668 (2014).
- Keen, C. L., Lönnerdal, B., Clegg, M., Hurley, L. S. Developmental changes in composition of rat milk: trace elements, minerals, protein, carbohydrate and fat. J. of Nutr. 111 (2), 226-236 (1981).
- Cabrera-Rubio, R., Collado, M. C., Laitinen, K., Salminen, S., Isolauri, E., Mira, A. The human milk microbiome changes over lactation and is shaped by maternal weight and mode of delivery. Am. J. Clin. Nutr. 96 (3), 544-551 (2012).
- Hallam, M. C., Barile, D., Meyrand, M., German, J. B., Reimer, R. A. Maternal high-protein or high-prebiotic-fiber diets affect maternal milk composition and gut microbiota in rat dams and their offspring. Obesity. 22 (11), 2344-2351 (2014).
- Munch, E. M., et al. Transcriptome Profiling of microRNA by Next-Gen Deep Sequencing Reveals Known and Novel miRNA Species in the Lipid Fraction of Human Breast Milk. PLoS ONE. 8 (2), e50564 (2013).
- Li, M., Sloboda, D. M., Vickers, M. H. Maternal obesity and developmental programming of metabolic disorders in offspring: Evidence from animal models. Exp Diabetes Res. 2011, (2011).
- Ellis, P. J. I., et al. Thrifty metabolic programming in rats is induced by both maternal undernutrition and postnatal leptin treatment, but masked in the presence of both: implications for models of developmental programming. BMC Genomics. 15, 49 (2014).
- Gomez-Gallago, C., et al. A method to collect high volumes of milk from mice (Mus musculus). An. Vet. Murcia. 29, 55-61 (2013).
- Wang, C. D., Chu, P. S., Mellen, B. G., Shenai, J. P. Creamatocrit and the nutrient composition of human milk. J. Perinatol. 19 (5), 343-346 (1999).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab. Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- Godbole, V. Y., Grundleger, M. L. Composition of rat milk from day 5 to 20 of lactation and milk intake of lean and preobese zucker pups. J. Nutr. 111 (3), 480-487 (1981).
- Del Prado, M., Delgado, G., Villalpando, S. Maternal lipid intake during pregnancy and lactation alters milk composition and production and litter growth in rats. J. Nutr. 127 (3), 458-462 (1997).
- Nicholas, K. R., Hartmann, P. E. Milk secretion in the rat: progressive changes in milk composition during lactation and weaning and the effect of diet. Comp. Biochem. Physiol. A. Comp. Physiol. 98 (3-4), 533-542 (1991).
- Azara, C. R. P., et al. Ethanol intake during lactation alters milk nutrient composition and growth and mineral status of rat pups. Biol. Res. 41 (3), 317-330 (2008).
- Keen, C. L., Lönnerdal, B., Sloan, M. V., Hurley, L. S. Effects of milking procedure on rat milk composition. Physiol. Behav. 24 (3), 613-615 (1980).
- Romeu-Nadal, M., Castellote, A. I., Lòpez-Sabater, M. C. Effect of cold storage on vitamins C and E and fatty acids in human milk. Food Chem. 106 (1), 65-70 (2008).
- Lucas, A., Gibbs, J. A., Lyster, R. L., Baum, J. D. Creamatocrit: simple clinical technique for estimating fat concentration and energy value of human milk. Br. Med. J. 1 (6119), 1018-1020 (1978).
- Furtado, K., Andrade, F. Comparison of the beneficial and adverse effects of inhalable and injectable anaesthetics in animal models: a mini-review. OA Anaesthetics. 1 (2), 20 (2013).
- Hausman Kedem, M., et al. The effect of advanced maternal age upon human milk fat content. Breastfeed. Med. 8 (1), 116-119 (2013).
- Mandel, D., Lubetzky, R., Dollberg, S., Barak, S., Mimouni, F. B. Fat and energy contents of expressed human breast milk in prolonged lactation. Pediatrics. 116 (3), e432-e435 (2005).
