Introduction
Il latte è l'unica fonte di nutrimento per i mammiferi neonati, fornendo energia e nutrienti per la crescita infantile e lo sviluppo 1,2. Mentre il latte è composto principalmente da cellule, lipidi e proteine 1, contiene anche una pletora di composti bioattivi che modulano lo sviluppo primi anni di vita della prole compresi gli enzimi, carboidrati, ormoni, anticorpi, fattori di crescita, citochine, esosomi, microvescicole, e piccoli RNA tali come microRNA 1,2. Il ruolo fondamentale del latte materno nello stabilimento della prole immunitario e la salute intestinale 3, insieme con la prova che allattati al seno i neonati sono meno suscettibili alle malattie 2, sottolinea l'importanza di identificare i componenti del latte associati ai processi di malattia nella prima infanzia ed i meccanismi molecolari coinvolti nelle loro azioni. Il ratto di sviluppo è un modello popolare per studiare l'effetto di vari nutrizionale, fisiologico, e interventi chimici sulle precocesviluppo -life 4. L'analisi del latte di ratto può quindi fornire romanzo spaccato la salute materna e prole.
Progressi scientifici attuali forniscono ora aumentare le opportunità per le approfondite indagini sugli effetti di specifici componenti del latte sulla salute e la malattia. Ad esempio, il sequenziamento di latte profili batterici ha chiarito il loro ruolo nella prima colonizzazione intestinale dell'intestino infantile 5, analisi di spettrometria di massa di oligosaccaridi del latte hanno fornito spaccato l'alterazione dei profili latte oligosaccaridi via dieta materna 6, e sequenziamento profondo di microRNA secreto in i globuli di grasso del latte materno evidenzia possibili ruoli nella trascrizione genica, il metabolismo, e la funzione immunitaria 7.
Modelli di ratto rappresentano uno dei più popolari organismi modello usati in studi materni 8,9. Un vantaggio è la loro gestazione e allattamento periodi brevi, che durano solo approximately 21 giorni ciascuno; il tempo totale dall'inizio della gravidanza per allattamento rappresenta un breve periodo di tempo in cui i dati importanti possono essere generati. Le maggiori dimensioni dei ratti rispetto ai topi, nel contesto di raccolta del latte, può fornire un vantaggio significativo rispetto al volume di latte e facilità di raccolta del latte; produzione di latte nel topo, per esempio, sembra essere dipende dal peso corporeo totale con topi pesanti producono più latte 10.
Qui, è fornita una descrizione generale per la raccolta manuale del latte di ratti che allattano. Questo protocollo richiede attrezzatura minima, non è invasiva, poco costoso, e può essere utilizzato per raccogliere adeguati volumi di latte per ulteriori analisi a valle. In breve, la diga è anestetizzato con isoflurano, latte letdown è stimolata da ossitocina, e latte viene raccolto in provette capillari tramite spremitura manuale del latte. Infine, come due componenti principali di latte sono grassi e proteine, una breve description di stimare latte tenore di materia grassa utilizzando misurazioni creamatocrit 11 e la quantificazione della concentrazione proteica totale usando un test standard di proteine è presentato.
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Protocol
Questo protocollo è stato approvato dalla University of Calgary Comitato cura degli animali e conforme alla Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio.
1. Diga separato da Offspring
- Separare la diga dalla sua prole per un minimo di 5 minuti prima mungitura 12.
NOTA: La diga può essere munta fino a 5-6 ore dopo la separazione 1,6,13, ma periodi di separazione più lunghi di 4 ore possono alterare la composizione del latte 14. Mentre tempo di separazione non sembra impattare latte volume di raccolta 12, è consigliabile che un tempo di separazione coerente essere mantenuta per tutto lo studio. Composizione del latte può cambiare tutta la lattazione 15, quindi i tentativi dovrebbe essere fatto per mantenere il giorno di raccolta del latte coerente. La produzione massima di latte si consiglia di verificare in lattazione giorno 14 12. - Usando una camera di riscaldamento, verificare i cuccioli sono in grado di mantenere la corretta tempera corpori senza la presenza della madre per la durata della procedura di mungitura.
NOTA: Nello studio presentato di seguito, la mungitura è stata eseguita allo svezzamento, quando le dighe erano circa 22 settimane di età e le prole 21 giorni di età, quindi nessuna camera di riscaldamento è stato utilizzato.
2. Set-up e preparazione
- Raccogliere tutti i materiali necessari per la procedura di mungitura.
NOTA: Tutti i materiali possono essere trovati nella tabella materiali ed apparecchiature. - Posizionare una piastra elettrica sulla panca dove la mungitura avrà luogo e coprire il pad con un banco assorbenti sotto-pad.
- Impostare il sistema anestetico. Assicurarsi che il sistema ha ossigeno e isoflurano prima dell'inizio sufficiente. Fissare la maschera anestetico che verrà utilizzato per l'induzione di anestesia iniziale alla macchina. Posizionare la maschera che verrà utilizzata per l'anestesia di mantenimento vicino se diversa dalla maschera anestetico iniziale.
- Collegare un ago da 25 G per una siringa da 1 ml per ossitocinainiezione con tecnica asettica.
- Accendere il rilievo di riscaldamento in modo che la temperatura del corpo della madre è mantenuta durante la procedura di mungitura. NOTA: Monitorare la temperatura della piastra elettrica per assicurare il pad non diventi troppo calda e causare ustioni. In alternativa, utilizzare una fonte di calore, ad esempio un tavolo operatorio riscaldato, che può essere impostato ad una temperatura specifica.
3. Anestetizzare la diga di Utilizzo Isoflurane
- Aprire il serbatoio di ossigeno e ruotare il flusso a 1 L (1.000 cc) per min. Accendere il flusso di isoflurano e impostare al 5%. ATTENZIONE: Evitare l'inalazione diretta di anestetico e prevenire l'accumulo di vapori anestetici.
- Anestetizzare la diga.
- Passare alla maschera di manutenzione, se necessario, ponendo la supina diga sul tampone assorbente panca. Confermare anestesia dalla mancanza di pedale reflex.
- Ridurre il flusso di isoflurano al 2-3% per il mantenimento dell'anestesia. Monitorare continuamente diga durante tutta la procedura per garantire la depressione di respirazione non si verifica. NOTA: Una volta sotto anestesia, gli occhi della diga devono essere protetti con un lubrificante occhio sterile per evitare che gli occhi si secchi o di diventare graffiato.
4. L'ossitocina Iniezione
- Assicurarsi che il ossitocina (20 USP Unità / ml) non ha superato la data di scadenza. Disinfettare la fiala di ossitocina con un alcool sterile wipe / alcol detergente pad.
- Utilizzando una tecnica asettica, elaborare 2 UI (0,1 ml) di ossitocina nella siringa. Usare un nuovo ago e la siringa per ogni diga che verranno munte.
NOTA: L'ossitocina dosi variano generalmente da singole iniezioni di 1-5 UI 1,6,12,16. In alternativa, una dose di 4 UI / kg di peso corporeo può essere utilizzato 12. Una singola dose di 2 UI può essere ripetuta una volta se si incontra difficoltà di mungitura. - Iniettare l'ossitocina per via intraperitoneale. Inserire l'ago nel quadrante in basso a destra dell'addome con l'ago rivolto verso la testa, con un angolodi 15-30 °, circa 0,5 cm di profondità.
- Tirare indietro lo stantuffo per garantire pressione negativa prima dell'iniezione. Se il liquido (sangue, urine, contenuto intestinale, ecc) è aspirato nella siringa, estragga l'ago e tentare l'iniezione con un nuovo ago e la siringa. Se nessun fluido viene aspirato iniettare l'ossitocina e scartare il ago e la siringa immediatamente in un contenitore a rischio biologico.
- Attendere circa 5-15 min per il ossitocina per stimolare il latte delusione.
5. Preparazione di siti mungitura
- Scegli i siti / mammelle da cui verrà raccolto il latte. Il latte può essere raccolto da ogni capezzolo 12.
- Rimuovere delicatamente il pelo intorno ai capezzoli da mungere con i trimmer, come la pelliccia può causare difficoltà nella raccolta dei campioni a causa dell'umidità del latte. Essere gentile - la pelle intorno i capezzoli è estremamente sensibile e può essere secco e come tale è soggetta a graffi e rotture.
- Sterilizzazione della tettarella iNon s necessario, ma opzionalmente, pulire il capezzolo con acqua tiepida dopo il pelo viene rimosso. Preparare almeno due siti come più di un sito può essere richiesta per la raccolta del latte.
NOTA: Se l'analisi del latte comprende profiling microbica, la zona del capezzolo può richiedere la sterilizzazione con iodio 5.
6. Latte Collection
- Premere delicatamente la base del capezzolo, espellendo manualmente il latte per la raccolta.
NOTA: Se l'analisi del latte comprende profiling microbica, le prime gocce di latte devono essere eliminate. - Raccogliere le gocce di latte in un tubo capillare, riempiendo il tubo capillare. Tubi capillari che possono ospitare volumi maggiori (ad esempio, 50 microlitri) facilitare il processo.
NOTA: Se si riscontra difficoltà nella raccolta del latte, una seconda dose di ossitocina può essere somministrata. Si raccomanda di non superare la dose di 4 UI totale. - Erogare il latte dal tubo capillare in una provetta steriletoccare l'estremità del tubo che è stato utilizzato per disegnare il latte dal capezzolo al lato della provetta - osservare il latte viene estratto dal tubo capillare tramite azione capillare.
NOTA: 'Soffiare' il latte che non aspirata nel tubo con un ago 18 G attaccato ad una siringa da 1 ml. - Monitorare continuamente la diga per segni di dolore o di depressione respiratoria e regolare il flusso di isoflurano conseguenza.
- Continuare a raccogliere il latte, come descritto in questa sezione fino a quando il latte sufficiente sono stati raccolti per l'analisi del latte prescelto. Per la creamatocrit e proteine determinazione della concentrazione descritto di seguito, raccogliere 0,25 ml di latte.
NOTA: utilizzare un sito di mungitura diverso se il latte delusione rallenta o il sito scelto non espelle il latte a sufficienza. Un massimo di circa 2,5 ml di latte per animale può essere raccolto 17, o fino a 0,5 ml per tettarella. Gli autori raccomandano che il tempo totale in anestesia essere limitato a circa 45-60 minuti, or 45 min di mungitura. - Raccogliere latte in una provetta per la misura creamatocrit microematocrito da campioni di latte fresco, e sigillare l'estremità del tubo con argilla sigillante. Etichettare la provetta microematocrito con l'ID diga e conservare il campione di latte in posizione verticale.
- Quando la mungitura è completata, spegnere il flusso di isoflurano e ossigeno. Rimuovere la maschera dalla diga e continuare a monitorare diga fino sveglio. Si raccomanda che se non pienamente cosciente, la diga deve essere collocato su un tampone assorbente panchina durante il periodo di recupero, anziché direttamente sulla biancheria gabbia, per evitare che la biancheria venga aspirato o graffiare gli occhi della diga durante il recupero.
NOTA: Non lasciare incustodita la diga fino a che non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere recumbancy sternale. - Se non sono necessarie ulteriori analisi, congelare il latte a -80 ° C. Altri hanno suggerito che il latte può essere conservato fino a 3 ore a 4 ° C o 5 mesi a -20 ° C 18.
7. Creamatocrit misura
- Stimare il contenuto di grasso nel latte calcolando la creamatocrit latte (la percentuale di crema nel campione di latte) 19.
NOTA: Le misurazioni con latte umano hanno dimostrato che il latte fresco o congelato può essere utilizzato per una misurazione creamatocrit, tuttavia latte fresco è più strettamente correlata (r = 0,92 rispetto r = 0,90) con concentrazione di lipidi 11. L'uso di latte fresco o congelato per misurazioni creamatocrit deve essere mantenuto costante attraverso lo studio, come il latte scongelato è associato ad una piccola diminuzione creamatocrit valori 11. - Per il latte fresco, raccogliere un campione di latte dal capezzolo in un tubo microematocrito; riempire almeno ¾ (circa 15-20 ml). In alternativa, disegnare il latte fresco dal campione raccolto nel tubo capillare dopo mescolando bene. Sigillare la fine con l'argilla sigillante.
- Posizionare il tubo capillare nella filatore ematocrito, con ilestremità sigillata orientate verso l'esterno, assicurando la centrifuga è equilibrata.
- Iniziare lo spin ematocrito (120 sec a 13.700 xg).
NOTA: il tempo di rotazione o la velocità possono cambiare a seconda del modello di centrifuga utilizzata. - Rimuovere il tubo dalla centrifuga dopo lo spin è completa ed eseguire le misurazioni per calcolare il creamatocrit. Osservare separazione del campione in uno strato di crema e uno strato trasparente.
- Misurare e registrare la lunghezza totale del fluido nel tubo e la lunghezza del grasso (crema) strato utilizzando pinze o un righello.
NOTA: Il creamatocrit è espresso come percentuale dello strato di crema all'interno del campione del latte 19, calcolato come (lunghezza dello strato di crema / lunghezza totale della colonna latte) x 100 (Figura 1A). Calcolare valori di concentrazione e di energia grasso da valutazione creamatocrit come segue: concentrazione di grasso (g / L) = (creamatocrit (%) - 0,59) /0.146 (Figura 1B) 19; Valore energetico (kcal / L) = 290 + (66,8 * creamatocrit (%) (Figura 1C) 19.
8. Proteine Concentrazione Determinazione
- Utilizzando Bovine Serum Albumin come standard proteine, determinare la concentrazione totale di proteine del latte usando un test standard di proteine, come una proteina test Lowry 6.
NOTA: La diluizione del latte può essere necessario per le misurazioni della proteina del latte a cadere all'interno della curva standard del dosaggio.
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Representative Results
Il latte è stato raccolto come descritto allo svezzamento da dighe Wistar (circa 22 settimane di età, peso 350 a 400 g) che consuma un controllo (AIN-93G, n = 5), ad alto contenuto proteico (40% di caseina peso / peso, n = 5) , o di fibre prebiotiche (21,6% peso / peso, rapporto 1: 1 di oligofruttosio e l'inulina, n = 4) dieta durante la gravidanza e l'allattamento. La dose di ossitocina era 2 UI. Il latte è stato raccolto in provette capillari, e un tubo è stato filato usando un filatore ematocrito per determinare creamatocrit (Figura 1A), che è stato poi utilizzato per stimare la concentrazione di grasso e valore energetico secondo: concentrazione di grasso (g / L) = (creamatocrit (% ) -0.59) /0.146 (Figura 1B); Valore energetico (kcal / L) = 290 + (66,8 * creamatocrit (%) (Figura 1C) 19. Concentrazione di proteine del latte è stata determinata utilizzando il saggio di proteine Bio-Rad DC (figura 2). Non vi erano differenze in creamatocrit (p = 0,674), la concentrazione di grassi (p = 0,674), valore energetico (p = 0,674), ola concentrazione di proteine R (p = 0,127), in base a dieta materna (ANOVA).
Figura 1. Il latte creamatocrit, concentrazione di grasso, e valore energetico. I campioni di latte sono stati raccolti allo svezzamento da dighe Wistar per il controllo (n = 5), High Protein (n = 5), o Alta prebiotica Fibra (n = 4) diete tutta la gravidanza e l'allattamento. Misure Creamatocrit (A) sono stati utilizzati per calcolare la concentrazione grasso del latte (B) e valore energetico (C). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Totale concentrazione di proteine del latte. I campioni di latte erano raccogliereed allo svezzamento da dighe Wistar per il controllo (n = 5), High Protein (n = 5), o High Fibre prebiotica (n = 4) diete tutta la gravidanza e l'allattamento. Concentrazione totale di proteine è stata determinata utilizzando il saggio di proteine Bio-Rad DC. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo protocolli approvati CCAC.
Acknowledgments
Funziona questo è stato sostenuto attraverso sovvenzioni dal scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (RGPIN 238382-2011) e Canadian Institutes of Health Research (MOP115076). Heather Paul è stato sostenuto da una borsa di studio post-laurea scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada e una borsa di studio Alberta innova Health Solutions. Megan Hallam è stato sostenuto da un scienze naturali e ingegneria Research Council Postgraduate borse di studio, una borsa di studio Frederick Banting e Charles Best Canada laureato e premio un bambini Alberta Hospital Research Training Institute in Genetica, Child Development, e la salute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment - Milking | |||
| 1 ml syringes | BD-Canada | 309602 | |
| 25 G needles | BD-Canada | 305122 | |
| 18 G needles | BD-Canada | 305196 | |
| 50 μl Microdispenser Capillary Tubes | Fisher Scientific | 21-169D | |
| Oxytocin (20 USP Units/ml) | Bimeda-MTC | 1OXY015 | |
| PPC Vet Isoflurane Inhalation Anesthetic, 250 ml | Fresenius Kabi | M60302 | Used on the order of a veterinarian |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Dukal | 853 | |
| Absorbent Bench Underpad | VWR | 82020-845 | |
| Maxi-Therm Hyper/Hypothermia Blanket | Cincinnati Sub-Zero | 274 | |
| Rodent Anesthesia Machine with Vaporizer | Benson Medical Industries Inc. | Subject to individual laboratory needs | |
| Animal Masks | Benson Medical Industries Inc. | 50100/50102 | |
| Microcentrifuge Tubes | Axygen | MCT-060-C | |
| ChroMini Professional Trimmer | Wahl | ||
| Equipment - Creamatocrit | |||
| StatSpin SafeCrit Plastic Microhematocrit Tubes (Untreated) | Fisher Scientific | 22-274-914 | |
| Critoseal Capillary Tube Sealant Tray | VWR | 470161-478 | |
| StatSpin CritSpin Microhematocrit Centrifuge | Beckman Coulter, Inc | X00-004999-001 |
References
- Izumi, H., Kosaka, N., Shimizu, T., Sekine, K., Ochiya, T., Takase, M. Time-dependent expression profiles of microRNAs and mRNAs in rat milk whey. PLoS ONE. 9 (2), e0088843 (2014).
- Hsieh, C. C., Hernández-Ledesma, B., Fernández-Tomé, S., Weinborn, V., Barile, D., de Moura Bell, J. M. Milk Proteins, Peptides, and Oligosaccharides: Effects against the 21st Century Disorders. BioMed Res. Int. , (2015).
- Rogier, E. W., et al. Lessons from mother: Long-term impact of antibodies in breast milk on the gut microbiota and intestinal immune system of breastfed offspring. Gut Microbes. 5 (5), 663-668 (2014).
- Keen, C. L., Lönnerdal, B., Clegg, M., Hurley, L. S. Developmental changes in composition of rat milk: trace elements, minerals, protein, carbohydrate and fat. J. of Nutr. 111 (2), 226-236 (1981).
- Cabrera-Rubio, R., Collado, M. C., Laitinen, K., Salminen, S., Isolauri, E., Mira, A. The human milk microbiome changes over lactation and is shaped by maternal weight and mode of delivery. Am. J. Clin. Nutr. 96 (3), 544-551 (2012).
- Hallam, M. C., Barile, D., Meyrand, M., German, J. B., Reimer, R. A. Maternal high-protein or high-prebiotic-fiber diets affect maternal milk composition and gut microbiota in rat dams and their offspring. Obesity. 22 (11), 2344-2351 (2014).
- Munch, E. M., et al. Transcriptome Profiling of microRNA by Next-Gen Deep Sequencing Reveals Known and Novel miRNA Species in the Lipid Fraction of Human Breast Milk. PLoS ONE. 8 (2), e50564 (2013).
- Li, M., Sloboda, D. M., Vickers, M. H. Maternal obesity and developmental programming of metabolic disorders in offspring: Evidence from animal models. Exp Diabetes Res. 2011, (2011).
- Ellis, P. J. I., et al. Thrifty metabolic programming in rats is induced by both maternal undernutrition and postnatal leptin treatment, but masked in the presence of both: implications for models of developmental programming. BMC Genomics. 15, 49 (2014).
- Gomez-Gallago, C., et al. A method to collect high volumes of milk from mice (Mus musculus). An. Vet. Murcia. 29, 55-61 (2013).
- Wang, C. D., Chu, P. S., Mellen, B. G., Shenai, J. P. Creamatocrit and the nutrient composition of human milk. J. Perinatol. 19 (5), 343-346 (1999).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab. Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- Godbole, V. Y., Grundleger, M. L. Composition of rat milk from day 5 to 20 of lactation and milk intake of lean and preobese zucker pups. J. Nutr. 111 (3), 480-487 (1981).
- Del Prado, M., Delgado, G., Villalpando, S. Maternal lipid intake during pregnancy and lactation alters milk composition and production and litter growth in rats. J. Nutr. 127 (3), 458-462 (1997).
- Nicholas, K. R., Hartmann, P. E. Milk secretion in the rat: progressive changes in milk composition during lactation and weaning and the effect of diet. Comp. Biochem. Physiol. A. Comp. Physiol. 98 (3-4), 533-542 (1991).
- Azara, C. R. P., et al. Ethanol intake during lactation alters milk nutrient composition and growth and mineral status of rat pups. Biol. Res. 41 (3), 317-330 (2008).
- Keen, C. L., Lönnerdal, B., Sloan, M. V., Hurley, L. S. Effects of milking procedure on rat milk composition. Physiol. Behav. 24 (3), 613-615 (1980).
- Romeu-Nadal, M., Castellote, A. I., Lòpez-Sabater, M. C. Effect of cold storage on vitamins C and E and fatty acids in human milk. Food Chem. 106 (1), 65-70 (2008).
- Lucas, A., Gibbs, J. A., Lyster, R. L., Baum, J. D. Creamatocrit: simple clinical technique for estimating fat concentration and energy value of human milk. Br. Med. J. 1 (6119), 1018-1020 (1978).
- Furtado, K., Andrade, F. Comparison of the beneficial and adverse effects of inhalable and injectable anaesthetics in animal models: a mini-review. OA Anaesthetics. 1 (2), 20 (2013).
- Hausman Kedem, M., et al. The effect of advanced maternal age upon human milk fat content. Breastfeed. Med. 8 (1), 116-119 (2013).
- Mandel, D., Lubetzky, R., Dollberg, S., Barak, S., Mimouni, F. B. Fat and energy contents of expressed human breast milk in prolonged lactation. Pediatrics. 116 (3), e432-e435 (2005).
