Introduction
Mjölk är den enda näringskälla för nyfödda däggdjur, ge energi och näringsämnen för barnets tillväxt och utveckling 1,2. Även mjölk består huvudsakligen av celler, lipider och protein 1, innehåller den också en uppsjö av bioaktiva föreningar som modulerar tidiga liv utveckling avkommor däribland enzymer, kolhydrater, hormoner, antikroppar, tillväxtfaktorer, cytokiner, exosomes, mikrovesiklar och små RNA sådana som mikroRNA 1,2. Den grundläggande roll modersmjölk i upprättandet avkommor immun- och tarmhälsa 3, tillsammans med bevis för att ammade spädbarn är mindre mottagliga för sjukdomar 2, understryker vikten av att identifiera de mjölkbeståndsdelar i samband med sjukdomsprocesser i början av livet och de molekylära mekanismer som är inblandade i sina handlingar. Framkallnings råttan är en populär modell för att undersöka effekten av olika näringsmässiga, fysiologiska och kemiska interventioner på tidigt-Life utveckling 4. Analysen av råttmjölk kan därför tillhandahålla nya insikt i mödra- och avkomma hälsa.
Aktuella vetenskapliga framsteg nu ge ökade möjligheter för fördjupade undersökningar av effekterna av särskilda mjölkbeståndsdelar på hälsa och sjukdom. Till exempel, har sekvensering av mjölkbakterie profiler klar deras roll i början av intestinal kolonisering av barnet gut 5, har massanalys av mjölkoligosackarider spektrometri inblick i förändringen av mjölk oligosackarid profiler moderns kost 6, och djupa sekvensering av mikroRNA utsöndras i fettkuloma av bröstmjölk belyser möjliga roller i gentranskription, metabolism och immunfunktion 7.
Råttmodeller representerar en av de mest populära modellorganismer som används i moderns studier 8,9. En fördel är deras korta dräktighet och laktationsperioder, varar bara approximately 21 dagar vardera; därför den totala tiden från början av graviditeten till amning utgör en kort tid där värdefulla data kan genereras. Den större storleken hos råttor jämfört med möss, inom ramen för uppsamling av mjölk, kan ge en betydande fördel i förhållande till volymen av mjölk och enkel mjölkhämtningen; mjölkproduktion i musen, till exempel, verkar vara beroende av den totala kroppsvikten med tyngre möss som producerar mer mjölk 10.
Här är en allmän beskrivning för manuell insamling av mjölk från digivande råttor tillhandahålls. Detta protokoll kräver minimal utrustning, är icke-invasiv, billig, och kan användas för att samla tillräckliga volymer mjölk för ytterligare analyser nedströms. I korthet, är fördämningen bedövades med isofluran, mjölknedgivningen stimuleras av oxitocin, och mjölken samlas in i kapillärrör genom manuell uttryckning av mjölken. Slutligen, som två huvudkomponenterna i mjölk är fett och proteiner, en kort description att uppskatta mjölkfetthalt använder creamatocrit mätningar 11 och kvantifiering av den totala proteinkoncentration med hjälp av en standardproteinanalys presenteras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll godkändes av University of Calgary Djurvård kommittén och överensstämde med handledningen för vård och användning av försöksdjur.
1. Separat fördämning från Avkomma
- Separera dammen från hennes avkomma till minst 5 minuter före mjölkning 12.
OBS: Dammen kan mjölkas upp till 5-6 timmar efter separation 1,6,13, men perioder av separation längre än fyra timmar kan förändra mjölkens sammansättning 14. Även om separation tid inte verkar påverka mjölkinsamlingsvolym 12, är det tillrådligt att en konsekvent separationstid upprätthållas under hela studien. Mjölkens sammansättning kan komma att ändras under amning 15, därför försök bör göras för att hålla den dag uppsamling av mjölk konsekvent. Maximal mjölkproduktion föreslås ske på amning dag 14 12. - Med hjälp av en värmande kammare, se till att valparna kan upprätthålla god kropps temperature utan närvaro av sin mor under hela mjölkningsproceduren.
OBS: I studien presenteras nedan, mjölkningen utfördes vid avvänjning, när dammarna var cirka 22 veckor gamla och avkomman 21 dagar gammal, därför ingen värme kammare användes.
2. Ställ upp och förberedelse
- Samla alla material som krävs för mjölkningsproceduren.
NOTERA: Alla material kan hittas i tabell det material och utrustning. - Placera en värmedyna på bänken där mjölkningen sker och täcka plattan med en absorberande bänk under-pad.
- Sätt upp narkosutrustningen. Se till att systemet har tillräckligt med syre och isofluran före början. Fäst anestesimask som kommer att användas för initial anestesi induktion till maskinen. Placera masken som kommer att användas för anestesi underhåll i närheten om annan än den ursprungliga anestesi masken.
- Bifoga en 25 G-nål till en 1 ml spruta för oxytocininjektion med aseptisk teknik.
- Slå på värmedyna, så att moderns kroppstemperaturen bibehålls under mjölkningsproceduren. OBS: Övervaka temperaturen hos värmedynan för att säkerställa att dynan inte blir för varmt och orsaka brännskador. Alternativt använder en värmekälla, såsom en uppvärmd operationsbord, som kan ställas in till en specifik temperatur.
3. Bedöva Dam Använda Isofluran
- Öppna syretank och vrid flödet till 1 L (1000 cc) per minut. Slå på flödet av isofluran och satt till 5%. VARNING: Undvik direkt inandning av narkosmedel och förhindra ansamling av anestesiångor.
- Söva dammen.
- Omkoppling till underhålls mask om det behövs, placera dammen liggande på absorberande bänkdynan. Bekräfta bedövning av bristande pedal reflex.
- Minska flödet av isofluran till 2-3% för underhåll av anestesi. Kontinuerligt övervaka dammen under hela förfarandet för att säkerställa depres av andning förekommer inte. OBS: En gång under narkos, bör damm ögon skyddas med en steril ögon smörjmedel för att förhindra att ögonen blir uttorkade eller blir repig.
4. Oxytocin Injektion
- Se till att oxytocin (20 USP enheter / ml) har inte passerat utgångsdatum. Desinficera flaskan med oxytocin med en steril alkohol torka / alkohol rensning pad.
- Använd aseptisk teknik, utarbeta 2 IE (0,1 ml) av oxytocin i sprutan. Använd en ny nål och spruta för varje damm som ska mjölkas.
OBS: Oxytocin doser sträcker sig i allmänhet från enstaka injektioner av ett till fem lU 1,6,12,16. Alternativt kan en dos av 4 IE / kg kroppsvikt användas 12. En enda dos av 2 IU kan upprepas en gång om svårigheter mjölkning påträffas. - Injicera oxytocin intraperitonealt. Stick in nålen i det nedre högra kvadranten av buken med nålen pekar mot huvudet, i en vinkelav 15-30 °, ca 0,5 cm djup.
- Dra tillbaka kolven för att säkerställa undertryck före injektion. Om någon vätska (blod, urin, tarminnehåll, etc.) sugs in i sprutan, ta ut nålen och försöka injektion med en ny nål och spruta. Om ingen vätska sugs injicera oxytocin och kassera nålen och sprutan omedelbart till en biologiskt behållare.
- Vänta ca 5-15 min för oxytocin för att stimulera mjölk besvikelse.
5. Beredning av Mjölknings webbplatser
- Välj platser / spenarna som producerar mjölk kommer att samlas in. Mjölk kan hämtas från någon spene 12.
- Försiktigt bort pälsen runt spenarna som ska mjölkas med trimmare, som päls kan orsaka svårigheter att provsamling på grund av uppsugning av mjölken. Var försiktig - huden runt spenarna är extremt känslig och kan vara torr och som sådan är känslig för repor och tårar.
- Sterilisering av spenen iär inte nödvändigt, men valfritt, rengöra spenen med ljummet vatten efter pälsen avlägsnats. Bered minst två platser som mer än en webbplats kan krävas för uppsamling av mjölk.
OBS: Om mjölkanalysen ingår mikrobiell profilering kan spenen området kräver sterilisering med jod 5.
6. Mjölk Collection
- Tryck försiktigt på basen av spenen manuellt utvisa mjölken för indrivning.
OBS: Om mjölkanalysen ingår mikrobiell profilering, bör de första några droppar mjölk kasseras. - Samla mjölkdroppar i ett kapillärrör, fylla kapillärröret. Kapillärrör som rymmer större volymer (t ex 50 il) underlätta processen.
OBS: Om svårigheter att samla in mjölken påträffas, kan en andra dos av oxytocin ges. Det rekommenderas dosen inte överstiga 4 IE totalt. - Dispensera mjölken från kapillärröret i ett sterilt mikrocentrifugrör genomvidröra änden av röret som användes för att dra mjölk från spenen till den sida av mikrocentrifugrör - observera mjölken dras ut ur kapillärröret via kapillärverkan.
OBS: 'Blås ut "den mjölk som inte dras in i röret med hjälp av en 18 G nål fäst till en 1 ml spruta. - Kontinuerligt övervaka dammen för tecken på smärta eller andningsdepression och justera flödet av isofluran i enlighet därmed.
- Fortsätt att samla mjölk som beskrivs i det här avsnittet tills tillräcklig mjölk har samlats in för den valda mjölkanalys. För beskrev koncentrationsbestämningen creamatocrit och protein nedan samla 0,25 ml mjölk.
OBS: Använd en annan mjölknings webbplats om mjölknedgivningen bromsar eller den valda platsen inte utvisa mjölk tillräckligt. Högst cirka 2,5 ml mjölk per djur kan uppsamlas 17, eller upp till 0,5 ml per spene. Författarna rekommenderar att den totala tid under narkos begränsas till cirka 45-60 min, or 45 min av mjölkning. - Samla mjölken i en microhematocrit rör för creamatocrit mätning från färska mjölkprover, och täta änden av röret med lera tätningsmedel. Märk microhematocrit rör med dammen-ID och lagra mjölkprovet upprätt.
- När mjölkningen är klar, stäng av flödet av isofluran och syre. Ta bort masken från dammen och fortsätta att övervaka dammen tills vaken. Det rekommenderas att om inte fullt medvetande, bör dammen placeras på ett absorberande bänk dyna under återhämtningsperioden, snarare än direkt på buren sängkläder, för att förhindra att strö från att aspire eller repa damm ögon under återhämtningen.
OBS: Låt inte dammen obevakad tills den har återfått tillräckligt medvetandet att upprätthålla sternala recumbancy. - Om inga ytterligare analyser krävs, frysa mjölk vid -80 ° C. Andra har föreslagit att mjölk kan förvaras i upp till 3 timmar vid 4 ° C eller 5 månader vid -20 ° C 18.
7. Creamatocrit Mätning
- Uppskatta fetthalten i mjölken genom att beräkna mjölk creamatocrit (andelen av grädde i mjölkprovet) 19.
OBS: Mätningar med bröstmjölk har visat att antingen färsk eller fryst mjölk kan användas för en creamatocrit mätning, men färsk mjölk är mer starkt korrelerade (r = 0,92 jämfört med r = 0,90) med lipidkoncentration 11. Användningen av färsk eller fryst mjölk för creamatocrit mätningar bör hållas konsekvent över studien, som tinade mjölk är associerad med en liten minskning i creamatocrit värden 11. - För färsk mjölk, samla ett prov av mjölk från spenen i ett microhematocrit rör; fylla minst ¾ full (ca 15-20 pl). Alternativt dra färsk mjölk från det uppsamlade provet i kapillärröret efter blandning väl. Täta änden med lera tätningsmedel.
- Placera kapillärröret in i hematokrit spinnaren, medförseglade änden pekar utåt, se till att centrifugen är balanserad.
- Börja hematokrit spinn (120 sek vid 13.700 xg).
OBS: Spin tid eller hastighet kan variera beroende på vilken modell av centrifugen används. - Ta bort röret från centrifugen efter utdelningen är klar och utföra mätningarna för att beräkna creamatocrit. Observera provets separation i en kräm skikt och ett klart skikt.
- Mät och registrera den totala längden av fluidum i röret och längden av fettet (grädde) skiktet med hjälp av skjutmått eller en linjal.
OBS: creamatocrit uttrycks som procentandelen av grädden skiktet inom mjölkprovet 19, beräknas som (längd av grädde skikt / total längd av mjölkpelaren) x 100 (Figur 1A). Beräkna fettkoncentration och energivärden från creamatocrit mätningen enligt följande: Fett koncentration (g / I) = (creamatocrit (%) - 0,59) /0.146 (Figur 1B) 19; Energivärde (kcfl / L) = 290 + (66,8 * creamatocrit (%) (Figur 1C) 19.
8. Proteinkoncentration Bestämning
- Med användning av bovint serumalbumin som proteinstandard, fastställa totala mjölkproteinkoncentration med användning av en standardproteinanalys, såsom en Lowry-proteinanalys 6.
OBS: Utspädning av mjölken kan vara nödvändig för mjölkprotein att falla inom standardkurva för analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mjölk samlades som beskrivs i avvänjning från Wistar dammar (cirka 22 veckor gamla, som vägde 350 till 400 g) som konsumerade en kontroll (AIN-93G, n = 5), hög proteinhalt (40% kasein vikt / vikt, n = 5) eller hög prebiotic fiber (21,6% vikt / vikt, 1: 1 förhållande av oligofruktos och inulin, n = 4) diet under graviditet och amning. Oxytocin dosen var 2 IE. Mjölk samlades upp med användning av kapillärrör, och ett rör spanns under användning av en hematokrit spinnaren för att bestämma creamatocrit (Figur 1A), som sedan användes för att uppskatta fettkoncentrationen och energivärdet enligt: Fett koncentration (g / I) = (creamatocrit (% ) -0,59) /0.146 (Figur 1B); Energivärde (kcal / L) = 290 + (66,8 * creamatocrit (%) (Figur 1C) 19. Mjölkproteinkoncentrationen bestämdes med användning av proteinanalysen från Bio-Rad DC (Figur 2). Det fanns inga skillnader i creamatocrit (p = 0,674), fetthalt (p = 0,674), energivärde (p = 0,674), or proteinkoncentration (p = 0,127), baserat på moderns kost (en-vägs ANOVA).
Figur 1. Mjölk creamatocrit, fetthalt och energivärde. Mjölkprover samlades in vid avvänjning från Wistar dammar på kontroll (n = 5), High Protein (n = 5), eller High Prebiotic Fibre (n = 4) dieter hela graviditet och amning. Creamatocrit mätningar (A) användes för att beräkna mjölkfett koncentration (B) och energivärde (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Den totala mjölkproteinkoncentration. Mjölkprover var samlaed på avvänjning från Wistar dammar på kontroll (n = 5), High Protein (n = 5), eller High Prebiotic Fibre (n = 4) dieter hela graviditet och amning. Totala proteinkoncentrationen bestämdes med användning av proteinanalys Bio-Rad DC. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att lämna ut. Alla djurförsök utfördes i enlighet med CCAC godkända protokoll.
Acknowledgments
Detta fungerar stöddes genom bidrag från naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (RGPIN 238382-2011) och kanadensiska Institutes of Health Research (MOP115076). Heather Paul fick stöd av ett naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada Forskarutbildning stipendium och en Alberta förnyar Health Solutions stipendium. Megan Hallam fick stöd av ett naturvetenskaplig och teknisk forskning Council Forskarutbildning stipendium, en Frederick Banting och Charles Best Kanada Graduate stipendium, och en Alberta Barnsjukhus Research Institute Training Award i genetik, barns utveckling och hälsa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment - Milking | |||
| 1 ml syringes | BD-Canada | 309602 | |
| 25 G needles | BD-Canada | 305122 | |
| 18 G needles | BD-Canada | 305196 | |
| 50 μl Microdispenser Capillary Tubes | Fisher Scientific | 21-169D | |
| Oxytocin (20 USP Units/ml) | Bimeda-MTC | 1OXY015 | |
| PPC Vet Isoflurane Inhalation Anesthetic, 250 ml | Fresenius Kabi | M60302 | Used on the order of a veterinarian |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Dukal | 853 | |
| Absorbent Bench Underpad | VWR | 82020-845 | |
| Maxi-Therm Hyper/Hypothermia Blanket | Cincinnati Sub-Zero | 274 | |
| Rodent Anesthesia Machine with Vaporizer | Benson Medical Industries Inc. | Subject to individual laboratory needs | |
| Animal Masks | Benson Medical Industries Inc. | 50100/50102 | |
| Microcentrifuge Tubes | Axygen | MCT-060-C | |
| ChroMini Professional Trimmer | Wahl | ||
| Equipment - Creamatocrit | |||
| StatSpin SafeCrit Plastic Microhematocrit Tubes (Untreated) | Fisher Scientific | 22-274-914 | |
| Critoseal Capillary Tube Sealant Tray | VWR | 470161-478 | |
| StatSpin CritSpin Microhematocrit Centrifuge | Beckman Coulter, Inc | X00-004999-001 |
References
- Izumi, H., Kosaka, N., Shimizu, T., Sekine, K., Ochiya, T., Takase, M. Time-dependent expression profiles of microRNAs and mRNAs in rat milk whey. PLoS ONE. 9 (2), e0088843 (2014).
- Hsieh, C. C., Hernández-Ledesma, B., Fernández-Tomé, S., Weinborn, V., Barile, D., de Moura Bell, J. M. Milk Proteins, Peptides, and Oligosaccharides: Effects against the 21st Century Disorders. BioMed Res. Int. , (2015).
- Rogier, E. W., et al. Lessons from mother: Long-term impact of antibodies in breast milk on the gut microbiota and intestinal immune system of breastfed offspring. Gut Microbes. 5 (5), 663-668 (2014).
- Keen, C. L., Lönnerdal, B., Clegg, M., Hurley, L. S. Developmental changes in composition of rat milk: trace elements, minerals, protein, carbohydrate and fat. J. of Nutr. 111 (2), 226-236 (1981).
- Cabrera-Rubio, R., Collado, M. C., Laitinen, K., Salminen, S., Isolauri, E., Mira, A. The human milk microbiome changes over lactation and is shaped by maternal weight and mode of delivery. Am. J. Clin. Nutr. 96 (3), 544-551 (2012).
- Hallam, M. C., Barile, D., Meyrand, M., German, J. B., Reimer, R. A. Maternal high-protein or high-prebiotic-fiber diets affect maternal milk composition and gut microbiota in rat dams and their offspring. Obesity. 22 (11), 2344-2351 (2014).
- Munch, E. M., et al. Transcriptome Profiling of microRNA by Next-Gen Deep Sequencing Reveals Known and Novel miRNA Species in the Lipid Fraction of Human Breast Milk. PLoS ONE. 8 (2), e50564 (2013).
- Li, M., Sloboda, D. M., Vickers, M. H. Maternal obesity and developmental programming of metabolic disorders in offspring: Evidence from animal models. Exp Diabetes Res. 2011, (2011).
- Ellis, P. J. I., et al. Thrifty metabolic programming in rats is induced by both maternal undernutrition and postnatal leptin treatment, but masked in the presence of both: implications for models of developmental programming. BMC Genomics. 15, 49 (2014).
- Gomez-Gallago, C., et al. A method to collect high volumes of milk from mice (Mus musculus). An. Vet. Murcia. 29, 55-61 (2013).
- Wang, C. D., Chu, P. S., Mellen, B. G., Shenai, J. P. Creamatocrit and the nutrient composition of human milk. J. Perinatol. 19 (5), 343-346 (1999).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab. Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- Godbole, V. Y., Grundleger, M. L. Composition of rat milk from day 5 to 20 of lactation and milk intake of lean and preobese zucker pups. J. Nutr. 111 (3), 480-487 (1981).
- Del Prado, M., Delgado, G., Villalpando, S. Maternal lipid intake during pregnancy and lactation alters milk composition and production and litter growth in rats. J. Nutr. 127 (3), 458-462 (1997).
- Nicholas, K. R., Hartmann, P. E. Milk secretion in the rat: progressive changes in milk composition during lactation and weaning and the effect of diet. Comp. Biochem. Physiol. A. Comp. Physiol. 98 (3-4), 533-542 (1991).
- Azara, C. R. P., et al. Ethanol intake during lactation alters milk nutrient composition and growth and mineral status of rat pups. Biol. Res. 41 (3), 317-330 (2008).
- Keen, C. L., Lönnerdal, B., Sloan, M. V., Hurley, L. S. Effects of milking procedure on rat milk composition. Physiol. Behav. 24 (3), 613-615 (1980).
- Romeu-Nadal, M., Castellote, A. I., Lòpez-Sabater, M. C. Effect of cold storage on vitamins C and E and fatty acids in human milk. Food Chem. 106 (1), 65-70 (2008).
- Lucas, A., Gibbs, J. A., Lyster, R. L., Baum, J. D. Creamatocrit: simple clinical technique for estimating fat concentration and energy value of human milk. Br. Med. J. 1 (6119), 1018-1020 (1978).
- Furtado, K., Andrade, F. Comparison of the beneficial and adverse effects of inhalable and injectable anaesthetics in animal models: a mini-review. OA Anaesthetics. 1 (2), 20 (2013).
- Hausman Kedem, M., et al. The effect of advanced maternal age upon human milk fat content. Breastfeed. Med. 8 (1), 116-119 (2013).
- Mandel, D., Lubetzky, R., Dollberg, S., Barak, S., Mimouni, F. B. Fat and energy contents of expressed human breast milk in prolonged lactation. Pediatrics. 116 (3), e432-e435 (2005).
