Introduction
Süt yenidoğan memeliler, bebek büyüme ve gelişme 1,2 için enerji ve besin sağlamak için beslenme tek kaynağıdır. Süt esas hücrelerde, lipid ve protein 1 oluşur, aynı zamanda enzimler, karbohidratlar, hormonlar, antikorlar, büyüme faktörleri, sitokinler, eksozom, microvesicles ve küçük RNA'ların bu dahil olmak üzere, yavruların erken yaşam gelişmesini ayarlayabilen biyolojik olarak aktif bileşiklerin bir bolluk içerir microRNA 1,2 olarak. Bebeklerin hastalığa 2 daha az hassas olan anne sütüyle beslenen kanıtlarla ile birleştiğinde bağışıklık yavruları ve bağırsak sağlığı 3 kuruluşunda anne sütünün temel rolü, yaşamın erken döneminde hastalık süreçleri ile ilişkili süt bileşenleri ve ilgili moleküler mekanizmaları tanımlamanın önemini vurgulamaktadır eylemlerinde. Gelişmekte olan sıçan çeşitli beslenme, fizyolojik etkisini araştırmak için popüler bir modeldir ve erken kimyasal müdahaleler-Hayat gelişim 4. Sıçan süt analizi, bu nedenle anne ve yavru sağlığı içine yeni bilgiler sağlayabilir.
Güncel bilimsel gelişmeler artık sağlık ve hastalık ile ilgili özel süt bileşenlerinin etkileri derinlemesine araştırmalar için olanaklarının artırılması sağlamak. Örneğin, süt bakteriyel profillerin dizi bebek gut 5 erken intestinal kolonizasyonunda kendi rolünü açıklamıştır, süt oligosakaritlerinin kütle spektrometresi analizi anne diyet 6 ve salgılanan microRNA derin sekanslama yoluyla süt oligosakarit profillerini değiştirilmesi fikir sağladı Anne sütünün yağ globülleri gen transkripsiyonu, metabolizma ve bağışıklık fonksiyonu 7'de olası rollerini vurgular.
Sıçan modelleri anne çalışmalarda 8,9 kullanılan en popüler model organizmaların birini temsil etmektedir. Bir avantajı sadece approximat süren kısa gebelik ve doğum dönemleri olduğunuely 21 gün, her; Bu nedenle emzirme gebelik başlangıcından itibaren toplam süresi değerli veriler elde edilebilir hangi kısa bir dönemi temsil eder. Farelere kıyasla farelerin büyük boyutlu, süt toplama bağlamında, süt ve süt toplama kolaylığı hacmine göre belirgin bir avantaj sağlayabilir; fare süt üretimi, örneğin, daha fazla süt üreten 10 ağır farelerin toplam vücut ağırlığına bağlı gibi görünüyor.
Burada, emziren sıçanların sütüne elle toplanması için genel bir açıklama sağlanır. Bu protokol, düşük ekipman gerektiren ucuz, invazif olmayan ve daha sonraki alt akış analizler için yeterli miktarda süt toplamak için kullanılabilir. Kısaca, baraj süt boşaltma oksitosin tarafından uyarılan, izofluran ile anestezi edilir ve süt süt el ekspresyonu yoluyla kılcal tüpler içine toplanır. Son olarak, süt iki temel bileşenleri olarak proteinler, kısa bir TANIMI şişman vecreamatocrit ölçümleri 11 ve standart bir protein deneyi kullanılarak toplam protein konsantrasyonu ölçümü kullanılarak süt yağı içeriği tahmin n sunulmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol Calgary Hayvan Bakım Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanmış ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu conformed oldu.
Offspring 1. Ayrı Barajı
- Önce 12 sağma 5 dakika, en az onun soyundan gelen baraj ayırın.
NOT: Baraj ancak uzun 4 saat daha ayrılık dönemleri süt bileşimini 14 değiştirebilir, ayrılık 1,6,13 sonra 5-6 saat kadar Sağılan edilebilir. Ayırma zaman süt toplama hacmi 12 darbe görünmüyor olsa da, tutarlı bir ayırma zamanı çalışma boyunca muhafaza edilmesi tavsiye edilir. Laktasyon 15 boyunca değişebilir Süt bileşimi, bu nedenle girişimleri tutarlı süt toplama gününü tutmak için yapılmalıdır. Maksimum süt üretimi laktasyon günde 14 12 oluştuğu ileri sürülmektedir. - Bir ısınma odasını kullanarak, yavrular uygun vücut temperatu muhafaza edebiliyoruz sağlamaksağma prosedür süresince annelerinin olmaksızın yeniden.
NOT: Aşağıda sunulan çalışmada, sağım nedenle hiçbir ısınma odası kullanıldı, barajlar yaklaşık 22 haftalık ve yavru 21 gün eski zaman, sütten gerçekleştirildi.
2. Set-up ve Hazırlık
- Sağım işlemi için gerekli olan tüm malzemeleri toplayın.
NOT: Tüm malzemeler malzeme ve ekipman tabloda bulunabilir. - Sağım gerçekleşecek ve altı-pad emici tezgah pedi kapsayacak bankta bir ısıtma yastığı yerleştirin.
- Anestezik sistemini ayarlayın. Sistemi yeterli oksijen ve başlamadan önce izofluran olduğundan emin olun. Makineye ilk anestezi indüksiyonu için kullanılacak anestezi maskesi takın. Yakınlarda ilk anestezik maske farklı ise anestezi bakımı için kullanılacak maske yerleştirin.
- Oksitosin için 1 ml şırınga 25 G iğne takınaseptik teknik kullanılarak enjeksiyonu.
- Maternal vücut sıcaklığı sağma işlemi sırasında muhafaza edilir, böylece, ısıtma yastığı açın. NOT: Çok ısınırlar ve yanıklara neden olmaz pedi sağlamak için ısıtma pedi sıcaklığını izleyin. Alternatif olarak, belirli bir sıcaklık için ayarlanabilir bir ısıtılmış cerrahi tablosu olarak, bir ısı kaynağı kullanır.
3. Baraj kullanma izofluran anestezisi
- Oksijen tankı açın ve min başına 1 L (1000 cc) akışını çevirin. Izofluran akışı açın ve% 5 olarak ayarlanmış. DİKKAT: anestetik doğrudan solumaktan kaçının ve anestezik buharların birikmesini önler.
- Baraj anestezisi.
- Gerekirse emici tezgah pad üzerinde baraj sırtüstü yerleştirerek, bakım maskesi üzerinden geçiş. Pedal refleksi eksikliği anesthetization onaylayın.
- Anestezi idamesi için% 2-3 izofluran akışını azaltın. Sürekli de emin olmak için prosedür boyunca baraj izlemeksolunum pression oluşmaz. NOT: anestezi altında, barajın gözleri kuruma veya çizik olma gözleri önlemek için steril bir göz yağlama kullanılarak korunmalıdır kez.
4. Oksitosin Enjeksiyon
- Oksitosin emin olun (20 USP Birimleri / ml) son kullanma tarihi geçmedi. / Alkol temizleme pedi silin steril alkol ile oksitosin flakon dezenfekte edin.
- Aseptik teknik kullanarak, enjektöre oksitosin 2 IU (0.1 ml) hazırlamak. Sağılan olacak her baraj için yeni bir iğne ve şırınga kullanın.
NOT: Oksitosin dozlar genellikle 1 tek enjeksiyondan 5 IU 1,6,12,16 değişir. Alternatif olarak, 4 lU / kg vücut ağırlığı kadar bir doz 12 kullanılabilir. Zorluk sağma karşılaşılırsa 2 IU tek bir dozu günde bir kez tekrar edilebilir. - Intraperitoneal oksitosinin enjekte edilir. Bir açıda, baş doğru iğne işaret ile karın sağ alt kadranda içine iğne takın15-30 °, 0.5 cm derinliğindedir.
- Enjeksiyondan önce negatif basınç sağlamak için pistonu geri çekin. Herhangi bir sıvı (kan, idrar, bağırsak içeriği gibi) enjektöre aspire edilir ise, iğneyi çıkarın ve yeni bir iğne ve şırınga ile enjeksiyon girişimi. Hiçbir sıvı oksitosinin enjekte ve biyolojik tehlikeli kabına hemen iğne ve şırınga atmak aspire edilirse.
- Süt boşaltma uyarma oksitosin yaklaşık 5-15 dakika bekleyin.
Sağım Siteleri 5. Hazırlık
- Süt tahsil edilecektir hangi siteleri / emzikleri seçin. Süt herhangi emzik 12 alınabilir.
- Kürk numune toplama zorluk neden olabilir hafifçe nedeniyle süt fitilleme için, makasları ile Sağılan edilecek emzikleri etrafında kürk çıkarın. Nazik olun - emzikleri çevresindeki deri çok hassastır ve kuru olabilir ve gibi çizik ve gözyaşları duyarlıdır.
- Meme i SterilizasyonGerekli değil, ancak kürk çıkarıldıktan sonra, isteğe bağlı olarak, ılık suyla emziği temizleyin. Birden fazla site süt toplama için gerekli olabilir, en az iki site hazırlayın.
NOT: Süt analizi mikrobiyal profilleme içeriyorsa, emzik alan iyot 5 ile sterilizasyon gerekebilir.
6. Süt Toplama
- Yavaşça elle toplama süt kovma, emzik tabanını sıkmak.
NOT: Süt analizi mikrobiyal profilleme içeriyorsa, sütün ilk birkaç damla atılmalıdır. - Kılcal tüp dolum, bir kılcal tüp içine süt damlacıkları toplayın. Daha büyük hacimli (örneğin, 50 ul) sürecini kolaylaştırmak uyum Kılcal borular.
Not: süt toplama zorluğu ile karşılaşılırsa, oksitosin ikinci bir doz uygulanabilir. Bu doz 4 IU toplam geçmemesi tavsiye edilir. - Steril bir mikrosantrifüj tüp ile içine kılcal tüpten süt koyunmikrosantrifüj tüpü yan meme sütü çekmek için kullanılan tüpün bitiş ucunu da dokunarak - Süt, kılcal hareket aracılığı kılcal tüp üzerinden çekilmesini dikkate alınmalıdır.
NOT: 1 ml şırınga bağlı 18 G iğne kullanılarak tüp içine çekilir değil süt 'söndür'. - Sürekli ağrı veya solunum depresyonu belirtileri için baraj izlemek ve buna göre izofluran akışını ayarlamak.
- Yeterli süt seçilen süt analizi için toplanan kadar bu bölümde tarif edildiği gibi süt toplamak için devam edin. Creamatocrit ve protein konsantrasyonu belirlenmesi için aşağıda tarif edilen, süt 0,25 ml toplar.
NOT: Süt hayal kırıklığı yavaşlatır veya seçilen sitesi yeterince süt sınırdışı etmezse, farklı bir sağım sitesini kullanın. Hayvan başına süt, yaklaşık 2,5 ml en fazla 17 toplanabilir veya meme başına 0.5 ml'ye kadar olabilir. Yazarlar o anestezi altında toplam süresi yaklaşık 45-60 dakika ile sınırlı tavsiyer sağım 45 dk. - Taze süt örneklerinden creamatocrit ölçümü için bir mikrohematokrit tüp içine süt toplamak ve kil dolgu ile tüpün ucunu mühür. Baraj kimliği ile mikrohematokrit tüp Etiket ve dik süt örneği saklayın.
- Sağma tamamlandığında, izofluran ve oksijen akışını kapatın. Baraj maskeyi çıkarın ve uyanık kadar baraj izlemeye devam. Tamamen bilinçli değilse, baraj, yerine doğrudan kafes yatak üzerinde daha iyileşme döneminde bir emici ped tezgah üzerine konulmalıdır aspire veya kurtarma sırasında baraj gözleri kaşıma olmaktan yatak önlemek için tavsiye edilir.
NOT: sternum recumbancy korumak için yeterli bilinci yerine kadar sahipsiz baraj bırakmayın. - Başka analizler gerekiyorsa, -80 ° C süt dondurma. Diğer süt, -20 ° C 18 'deki 3 saatin kadar 4 ° C de veya 5 ay boyunca saklanabilir olduğunu ileri sürmüşlerdir.
7. Creamatocrit Ölçümü
- Süt creamatocrit (süt örneğinde krem yüzdesi) 19 hesaplayarak sütündeki yağ içeriği tahmin edin.
NOT: insan sütü ile ölçümler taze veya dondurulmuş ya süt, ancak taze süt daha çok ilişkili olduğu, bir creamatocrit ölçümü için kullanılabilir olduğunu göstermiştir (r r = 0.90 = 0.92 karşı) lipit konsantrasyonuna 11. Çözülmüş süt creamatocrit küçük bir azalma ile ilişkili olarak creamatocrit ölçümleri için taze veya dondurulmuş süt kullanımı 11 değerleri, çalışma boyunca tutarlı olmalıdır. - Taze süt için, bir mikrohematokrit tüp içine emziğin süt örneği toplamak; En azından doldurun ¾ dolu (yaklaşık 15-20 ul). Alternatif olarak, iyi karıştırıldıktan sonra kılcal tüpe toplanan örnekten taze süt çizin. Kil dolgu ile sonuna mühür.
- Ile, hematokrit spinere kapiller tüp yerleştirinmühürlü uç santrifüj sağlanması dışarıya bakacak dengelidir.
- Hematokrit dönüşünü (13.700 xg'de 120 sn) başlayın.
NOT: Sıkma süresi veya hız kullanılan santrifüj modeline bağlı olarak değişebilir. - Spin tamamlandıktan sonra santrifüj tüpü çıkarın ve creamatocrit hesaplanması için ölçümler yapmak. Bir krem tabakası ve net bir tabaka haline numunenin ayrımını dikkate alınız.
- Ölçüm ve akışkanın boru içindeki toplam uzunluğu ve yağ (krem) uzunluğunu çap pergeli ya bir cetvel kullanarak katman kaydedin.
Not: creamatocrit olarak hesaplanan süt numunesi 19 olan krem tabakasının yüzdesi olarak ifade edilir (krem tabakanın uzunluk / süt sütununun toplam uzunluğu) 100 (Şekil 1A) x. Şöyle creamatocrit ölçümünden yağ konsantrasyon ve enerji değerlerini hesapla: Yağ konsantrasyonunun (g / L) = (creamatocrit (%) - 0.59) /0.146 (Şekil 1B) 19; Enerji değeri (kcal / L) = 290 + (66,8 * creamatocrit (%) (Şekil 1C) 19.
8. Protein Konsantrasyonu Tayini
- Bir protein standardı olarak sığır serum albümini kullanılarak, örneğin, bir Lowry protein testi 6 gibi standart protein deneyi kullanılarak toplam süt protein konsantrasyonunu belirleyin.
Not: Süt protein ölçümleri deneyde standart eğri içine düşmesi süt seyreltilmesi gerekli olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wistar baraj çıkışta tarif edildiği gibi süt toplandı, yüksek protein bir denetim tüketilen (5 AIN-93 g, n =) ki (ağırlığında yaklaşık 22 haftalık 350 ila 400 g) (% 40 kazein ağırlık / ağırlık, n = 5) ya da yüksek prebiyotik lif (% 21.6 wt / wt, 1: oligofruktoz ve inülin, n = 4: 1 oran), gebelik ve emzirme döneminde, diyet. Oksitosin dozu IU 2 oldu. Süt kılcal borular kullanılarak toplandı ve daha sonra bir boru göre yağ konsantrasyonu ve enerji değerini tahmin etmek için kullanıldı creamatocrit (Şekil 1A), belirlemek için bir hematokrit spinner döndürüldü (% Yağ konsantrasyonunun (g / L) = (creamatocrit ) -0,59) /0.146 (Şekil 1B); Enerji değeri (kcal / L) = 290 + (66.8 * creamatocrit (%) (Şekil 1C) 19. Süt protein konsantrasyonu Bio-Rad DC protein deneyi (Şekil 2) kullanılarak belirlendi. Creamatocrit hiçbir fark yoktu (p = 0,674), yağ konsantrasyonu (p = 0,674), enerji değeri (p = 0,674), oanne diyet (tek yönlü ANOVA) dayalı r protein konsantrasyonu (p = 0.127).
Şekil 1. Süt creamatocrit, yağ konsantrasyon ve enerji değeri. Süt örnekleri Hamilelik ve emzirme boyunca diyetler (n = 5), Yüksek protein (n = 5) Kontrolü Wistar barajlardan sütten toplanan veya Yüksek Prebiyotik Lif (n = 4) bulundu. Creamatocrit ölçümler (A) süt yağı konsantrasyonu (B) ve enerji değeri (C) hesaplamak için kullanılmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
2. Toplam süt protein konsantrasyonu Şekil. Süt örnekleri toplamak idi(n = 5), Yüksek protein (n = 5) Kontrolü Wistar barajlardan sütten de ed veya Yüksek Prebiyotik Lif (n = 4) hamilelik ve emzirme süresince diyetler. Toplam protein konsantrasyonu Bio-Rad DC protein deneyi kullanılarak belirlendi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa etmek Çıkar çatışması var. Tüm hayvan deneyleri CCAC onaylı protokoller çerçevesinde yapılmıştır.
Acknowledgments
Bu eserler Doğa Bilimleri ve Kanada'nın Mühendislik Araştırma Konseyi (RGPIN 238382-2011) ve Sağlık Araştırması (MOP115076) Kanada Enstitüleri hibe yoluyla destek verdi. Heather Paul Doğa Bilimleri ve Kanada'nın Mühendislik Araştırma Konseyi Lisansüstü Burs ve Alberta yeniliklerin Health Solutions burs tarafından desteklenmiştir. Megan Hallam Doğal Bilimler ve Mühendislik Araştırma Konseyi Lisansüstü Bursu, bir Frederick Banting ve Charles Best Kanada Yüksek Lisans Bursu ve bir Alberta Çocuk Hastanesi Araştırma Enstitüsü Eğitim Genetik Ödülü, Çocuk Gelişimi ve Sağlık tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment - Milking | |||
| 1 ml syringes | BD-Canada | 309602 | |
| 25 G needles | BD-Canada | 305122 | |
| 18 G needles | BD-Canada | 305196 | |
| 50 μl Microdispenser Capillary Tubes | Fisher Scientific | 21-169D | |
| Oxytocin (20 USP Units/ml) | Bimeda-MTC | 1OXY015 | |
| PPC Vet Isoflurane Inhalation Anesthetic, 250 ml | Fresenius Kabi | M60302 | Used on the order of a veterinarian |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Dukal | 853 | |
| Absorbent Bench Underpad | VWR | 82020-845 | |
| Maxi-Therm Hyper/Hypothermia Blanket | Cincinnati Sub-Zero | 274 | |
| Rodent Anesthesia Machine with Vaporizer | Benson Medical Industries Inc. | Subject to individual laboratory needs | |
| Animal Masks | Benson Medical Industries Inc. | 50100/50102 | |
| Microcentrifuge Tubes | Axygen | MCT-060-C | |
| ChroMini Professional Trimmer | Wahl | ||
| Equipment - Creamatocrit | |||
| StatSpin SafeCrit Plastic Microhematocrit Tubes (Untreated) | Fisher Scientific | 22-274-914 | |
| Critoseal Capillary Tube Sealant Tray | VWR | 470161-478 | |
| StatSpin CritSpin Microhematocrit Centrifuge | Beckman Coulter, Inc | X00-004999-001 |
References
- Izumi, H., Kosaka, N., Shimizu, T., Sekine, K., Ochiya, T., Takase, M. Time-dependent expression profiles of microRNAs and mRNAs in rat milk whey. PLoS ONE. 9 (2), e0088843 (2014).
- Hsieh, C. C., Hernández-Ledesma, B., Fernández-Tomé, S., Weinborn, V., Barile, D., de Moura Bell, J. M. Milk Proteins, Peptides, and Oligosaccharides: Effects against the 21st Century Disorders. BioMed Res. Int. , (2015).
- Rogier, E. W., et al. Lessons from mother: Long-term impact of antibodies in breast milk on the gut microbiota and intestinal immune system of breastfed offspring. Gut Microbes. 5 (5), 663-668 (2014).
- Keen, C. L., Lönnerdal, B., Clegg, M., Hurley, L. S. Developmental changes in composition of rat milk: trace elements, minerals, protein, carbohydrate and fat. J. of Nutr. 111 (2), 226-236 (1981).
- Cabrera-Rubio, R., Collado, M. C., Laitinen, K., Salminen, S., Isolauri, E., Mira, A. The human milk microbiome changes over lactation and is shaped by maternal weight and mode of delivery. Am. J. Clin. Nutr. 96 (3), 544-551 (2012).
- Hallam, M. C., Barile, D., Meyrand, M., German, J. B., Reimer, R. A. Maternal high-protein or high-prebiotic-fiber diets affect maternal milk composition and gut microbiota in rat dams and their offspring. Obesity. 22 (11), 2344-2351 (2014).
- Munch, E. M., et al. Transcriptome Profiling of microRNA by Next-Gen Deep Sequencing Reveals Known and Novel miRNA Species in the Lipid Fraction of Human Breast Milk. PLoS ONE. 8 (2), e50564 (2013).
- Li, M., Sloboda, D. M., Vickers, M. H. Maternal obesity and developmental programming of metabolic disorders in offspring: Evidence from animal models. Exp Diabetes Res. 2011, (2011).
- Ellis, P. J. I., et al. Thrifty metabolic programming in rats is induced by both maternal undernutrition and postnatal leptin treatment, but masked in the presence of both: implications for models of developmental programming. BMC Genomics. 15, 49 (2014).
- Gomez-Gallago, C., et al. A method to collect high volumes of milk from mice (Mus musculus). An. Vet. Murcia. 29, 55-61 (2013).
- Wang, C. D., Chu, P. S., Mellen, B. G., Shenai, J. P. Creamatocrit and the nutrient composition of human milk. J. Perinatol. 19 (5), 343-346 (1999).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab. Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- Godbole, V. Y., Grundleger, M. L. Composition of rat milk from day 5 to 20 of lactation and milk intake of lean and preobese zucker pups. J. Nutr. 111 (3), 480-487 (1981).
- Del Prado, M., Delgado, G., Villalpando, S. Maternal lipid intake during pregnancy and lactation alters milk composition and production and litter growth in rats. J. Nutr. 127 (3), 458-462 (1997).
- Nicholas, K. R., Hartmann, P. E. Milk secretion in the rat: progressive changes in milk composition during lactation and weaning and the effect of diet. Comp. Biochem. Physiol. A. Comp. Physiol. 98 (3-4), 533-542 (1991).
- Azara, C. R. P., et al. Ethanol intake during lactation alters milk nutrient composition and growth and mineral status of rat pups. Biol. Res. 41 (3), 317-330 (2008).
- Keen, C. L., Lönnerdal, B., Sloan, M. V., Hurley, L. S. Effects of milking procedure on rat milk composition. Physiol. Behav. 24 (3), 613-615 (1980).
- Romeu-Nadal, M., Castellote, A. I., Lòpez-Sabater, M. C. Effect of cold storage on vitamins C and E and fatty acids in human milk. Food Chem. 106 (1), 65-70 (2008).
- Lucas, A., Gibbs, J. A., Lyster, R. L., Baum, J. D. Creamatocrit: simple clinical technique for estimating fat concentration and energy value of human milk. Br. Med. J. 1 (6119), 1018-1020 (1978).
- Furtado, K., Andrade, F. Comparison of the beneficial and adverse effects of inhalable and injectable anaesthetics in animal models: a mini-review. OA Anaesthetics. 1 (2), 20 (2013).
- Hausman Kedem, M., et al. The effect of advanced maternal age upon human milk fat content. Breastfeed. Med. 8 (1), 116-119 (2013).
- Mandel, D., Lubetzky, R., Dollberg, S., Barak, S., Mimouni, F. B. Fat and energy contents of expressed human breast milk in prolonged lactation. Pediatrics. 116 (3), e432-e435 (2005).
