Introduction
זיהוי של מולקולות הקשורות לאזורים הגנומי ספציפיים של העניין נדרש להבין את מנגנוני רגולציה של פונקציות הגנומי כגון שעתוק ורגולציה אפיגנטיים. למרות כמה טכניקות פותחו לאנליזה ביוכימית של אזורים הגנומי ספציפיים 1-7, הם לא בשימוש נרחב בשלב זה בגלל הבעיות שלהם הפנימיות כגון יישום מוגבל (למשל, רק ללוקוסים גבוה עותק מספר או לוקוסים עם חזרות) ו נדרשו זמן ומאמצים רבים מדי.
על מנת לבצע את הניתוח ביוכימי של אזורים הגנומי ספציפיים בקלות, פיתחנו שתי טכנולוגיות immunoprecipitation הכרומטין מוקד ספציפי (שבב), כלומר insertional השבב (iChIP) 8-13 ומהונדס שבב תיווך מולקולת ה- DNA מחייב (enChIP) 14-17 . בiChIP, מוקד של העניין מתויג על ידי רצפי הכרת החדרה של חלבון קושר DNA אקסוגני כגון לקסא המוקד מבודד לאחר מכן על ידי טיהור זיקה באמצעות החלבון קושר DNA מתויג. מתחמים חוזר palindromic קצר interspaced באופן קבוע בenChIP, מהונדס מולקולות ה- DNA מחייבת, כגון חלבוני אבץ-אצבע, חלבוני שעתוק כמו activator (טל), והתקבץ (CRISPR), משמשים לתייג מוקד של עניין (איור 1). בהמשך לכך, אזור גנומי מבודד על ידי טיהור זיקה של מולקולות ה- DNA מחייבת המתויגות.
אחד היתרונות של enChIP על iChIP הוא שההכנסה של רצפי הכרה של חלבון קושר DNA אקסוגני היא לא הכרחית. המיקוד של לוקוסים באמצעות מתחמי CRISPR בהיקף של צורת catalytically פעילה של Cas9 (dCas9) וRNA מדריך (gRNA) הוא הרבה יותר קל מאשר המיקוד של אזורים אלה על ידי iChIP או enChIP באמצעות חלבוני טל ואבץ-אצבע. כאן, אנו מתארים פרוטוקול צעד-אחר-צעד לenChIP בשילוב עם ספקטרומטריית מסה ורצף RNA (RNA-Seq) לזהות מוקד-associaחלבוני טד וRNAs, בהתאמה.
Protocol
1. עיצוב של מולקולות ה- DNA מחייב תכנון הנדסי הכרת לוקוס היעד
- לenChIP באמצעות מתחמי CRISPR, להשתמש בכלי CRISPRdirect האינטרנט (http://crispr.dbcls.jp) לזהות רצפי יעד gRNA מועמד באזור הגנומי של עניין כפי שתואר קודם לכן 18. כלי אינטרנט זה מחזיר אתרים הגנומי 23 נ"ב של הטופס 5'-N-20 NGG 3 'בתוך אזור היעד.
- לסנתז gBlock כולל רצף אמרגן U6 והרצף של 5'-N 20 ב5'-N-20 NGG 3 'משתמש בשירותים מסחריים (ראה איור 2) 19,20. לsubcloning מטרות, כוללים אתרי אנזים ההגבלה מתאימים מחוץ לgBlock.
- הכנס את gBlock לוקטור מתאים כפי שתואר קודם לכן 16. כמה וקטורי retroviral לgBlocks זמינים (ראה חומרים).
- לenChIP באמצעות חלבוני טל, לתכנן חלבוני טל הכרת טארגלוקוסי et. צור פלסמידים קידוד חלבוני TAL באמצעות שירותים מסחריים. צור וקטורי ביטוי המכילים חלבוני טל התמזגו עם תג אחד או יותר כגון דגל 3 × כפי שתואר קודם לכן 15.
2. הקמת תאים לניתוח enChIP
- הגעה 3 × הדגל-dCas9 וgRNA (הליך המבוסס על CRISPR) או 3 × דגל-טל (הליך המבוסס על חלבוני טל) בתאים להיות מנותח כפי שתואר לעיל 14-17.
- השתמש transfection חולף אם יעילות transfection היא גבוהה. וקטור ביטוי המכיל 3 × הדגל-dCas9 ואמרגן CMV הוא זמין (ראה חומרים).
- לשקול הקמת transformants היציב בשיטות קונבנציונליות אם יעילות transfection החולפת היא נמוכה. בנוסף לוקטורי retroviral האמורים לgBlock, וקטורי retroviral של 3 × הדגל-dCas9 זמינים (ראה חומרים).
- אשר ביטוי של gRNA על ידי טכניקת RT-PCR סטנדרטי.
- לזיהוי כמותי של חלבוני אינטראקציה עם האזור הגנומי של עניין, לשקול שימוש בתיוג איזוטופ יציב על ידי חומצות אמינו בתרבית תאים (SILAC) ניתוח בשילוב עם enChIP (enChIP-SILAC).
הערה: מדיה לניתוח SILAC ניתן לרכוש מיצרנים מסחריים. SILAC הוא חזק באיתור אינטראקציות ספציפיות.- תרבות תאים במדיום כבד SILAC. הכן cultu תאיםאדום במדיום SILAC אור כביקורת שלילית. השתמש לפחות 5 10 × 7 תאים לכל מדיום SILAC (כבד או קל). לתיוג יעיל, מוסיף שני L ליזין-2HCl, 13 C 6 וL- ארגינין-HCl, 13 C 6, 15 N 4 בתקשורת SILAC כבדה. הערה: לפחות חמש חלוקות תא נחוצות לחלבוני תווית.
- לדוגמא, תאי התרבות אנושיים HT1080 fibrosarcoma יציבות להביע 3xFLAG-dCas9 וgRNA על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בתקשורת DMEM לSILAC וסרום שור העוברי dialyzed עם יזין-2HCl תוספת L- ארגינין-HCl (בינוני אור) או 13 C 6 L ליזין-2HCl בתוספת 13 C 6 15 N 4 L- ארגינין-HCl (בינוני כבד) (ראה חומרים) 16. הוסף 50 מ"ג של אור או L ליזין-2HCl כבד וL- ארגינין-HCl ב500 מיליליטר של מדיום.
- תאי Trypsinize וreplate לפני שהם הופכים ומחוברות, כך שתאים לשמור growt מעריכיח.
- תרבות תאים במדיום כבד SILAC. הכן cultu תאיםאדום במדיום SILAC אור כביקורת שלילית. השתמש לפחות 5 10 × 7 תאים לכל מדיום SILAC (כבד או קל). לתיוג יעיל, מוסיף שני L ליזין-2HCl, 13 C 6 וL- ארגינין-HCl, 13 C 6, 15 N 4 בתקשורת SILAC כבדה. הערה: לפחות חמש חלוקות תא נחוצות לחלבוני תווית.
הערה: ביטוי של חלבונים מתויגים אלה גם יכול להיות מאושר על ידי צביעה תאית עם אנטי-דגל-FITC וניתוח FACS הבא. פרוטוקול מכתים תאית ניתן להוריד מאתר הבית שלנו (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html).
3. Crosslinking של תאים עם פורמלדהיד
- לתאים בתרבית השעיה, העברה 2 × 10 7 תאים לבטא חלבוני 3xFLAG-טל או 3xFLAG-dCas9 תוספת gRNA ולהשעות ב 30 מיליליטר של מדיום תרבות הקבוע בצינור צנטריפוגות 50 מיליליטר. כאשר יותר תאים משמשים, להגדיל את הנפחים וכמויות של חומרים כימיים באופן יחסי. לניסויי SILAC, לערבב את התאים בתרבית בינונית כבד או בינוני אור (5 x 10 7 תאים כל אחד) ולחלק את הסכום הכולל של 1 x 10 8 תאים לתוך 5 צינורות המכילים 2 x 10 7 תאים.
- להוסיף 810 μl של פורמלדהיד 37% עד 30 מיליליטר של ההשעיה התא (ריכוז סופי 1%) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לתאים חסיד, ישירות לתקן תאים בצלחות תרבות על ידי הוספת 810 μl של פורמלדהיד 37% עד 30 מיליליטר של מדיום התרבות.
- להפסיק crosslinking ידי הוספת 3.1 מיליליטר של 1.25 M פתרון גליצין (ריכוז סופי 127 מ"מ), ולדגור על RT במשך 10 דקות.
- איסוף תאים על ידי צנטריפוגה (ז 300 × 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס). להשליך בזהירות פורמלדהיד supernatant כולל ולאחסן אותו בבקבוק פסולת מתאים.
- לתאים חסיד, לנתק את התאים עם מגרד תא וקציר בצינור מיליליטר 50, ולאסוף תאים כמתואר בשלב זה.
- לניסויי SILAC, לערבב את התאים בתרבית המנותק בינוני כבד או בינוני אור (5 x 10 7 תאים כל אחד), לחלק את סך של 1 x 10 8 תאים לתוך 5 צינורות המכילים 2 x 10 7 תאים, ולאסוף תאים כפי שמתואר בזה שָׁלָב.
- שטוף את התא גלולה עם 30 מיליליטר של PBS פעמיים לכל צינור. להשליך בזהירות את supernatant כולל פורמאלדהיד ולאחסן אותו בפסולת מתאימה bottle.Handle פסולת פורמלדהיד פי הנחיות בטיחות כימיות. אפשר להקפיא תאים הקבועים ומאוחסנים ב -80 ° C.
4. הכנת הכרומטין (מחיר 2 x 107 תאים)
- להשעות את התאים הקבועים ב 10 מיליליטר של חיץ תמוגה תא (10 מ"מ טריס (pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.5% IGEPAL CA-630, ו1 × מעכבי פרוטאז) ודגירה על קרח למשך 10 דקות.
- צנטריפוגה המדגם (ז × 830 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 8 דקות) וזורקים supernatant בזהירות.
- להשעות את גלולה ב 10 מיליליטר של חיץ תמוגה הגרעיני (10 מ"מ טריס (pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.5 M NaCl, 1% Triton X-100, 0.5% deoxycholate נתרן, lauroylsarcosine 0.5%, ומעכבי פרוטאז 1x). דגירה על קרח למשך 10 דקות ומערבולת כל דקות 2-3.
- צנטריפוגה המדגם (830 × גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 8 דקות) וזורקים supernatant בזהירות.
- שטוף את הכדור ב 10 מיליליטר של PBS. גלולה (חלק הכרומטין) ניתן לאחסן ב -80 ° C לאחר הקפאה מיידית בחנקן נוזלי.
5. Sonication של הכרומטין (מחיר 2 x 10 7 תאים)
- להשעות את חלק הכרומטין ב800 μl שלתמוגה חיץ שונה 3 (10 מעכבי פרוטאז מ"מ טריס (pH 8.0), 1 mM EDTA, 150 מ"מ NaCl, 0.1% deoxycholate נתרן, 0.1% SDS, ו1x) ולהעביר לתוך צינור 1.5 מיליליטר.
- Sonicate הכרומטין באמצעות sonicator (ראה חומרים) והתנאים הבאים: פלט: 3; החובה: 100% (רציפה); וזמן: ללא תשלום. לבצע 10-18 מחזורים של sonication במשך 10 שניות וקירור בקרח במשך 20 שניות. כדי להימנע מחימום יתר, דגירה על דגימות קרח למשך 2 דקות כל 5-6 מחזורים. כדי למנוע הקצפה, לשמור על העמדה של הקצה של חללית sonication 0.5 סנטימטרים מעל החלק התחתון של הצינור.
- צנטריפוגה המדגם ב( ז × 16,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות) ולהעביר את supernatant לתוך צינור 1.5 מיליליטר. הכרומטין sonicated ניתן לאחסן ב -80 ° C לאחר הקפאה מיידית בחנקן נוזלי.
6. הערכה של פיצול הכרומטין
- מערבבים 10 μl של הכרומטין המקוטע עם 85 μl של מים מזוקקים.
- הוסף 4 μl5 M NaCl ולדגור על 65 מעלות CO / N.
- הוסף 1 μl של 10 מ"ג / מיליליטר RNase ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות.
- הוסף 2 μl 0.5 M EDTA (pH 8.0), 4 μl של 1 M טריס (pH 6.8), וμl 1 של 20 מ"ג / מיליליטר proteinase K, ולאחר מכן לדגור על 45 מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות.
- נפרד 10 μl של המדגם על ידי אלקטרופורזה בג'ל agarose 1% שאינו מכיל צבעים מכתימים כמו SYBR ירוק.
- כתם ג'ל להעריך את חלוקת האורכים של הכרומטין המקוטע. תנאים שיוצרים אורך ממוצע של 0.5-2 KBP (טווח של .2-4 KBP) מומלצים.
- לטהר DNA מהדגימות שנותרו על ידי מיצוי פנול, כלורופורם או באמצעות ערכת חילוץ DNA (ראה חומרים). ה- DNA המטוהר יכול לשמש כDNA קלט להעריך את התשואות של ניתוחי enChIP (ראה 8.11).
7. הכנת Dynabeads Conjugated עם נוגדנים (מחיר 2 x 10 7 תאים)
- מִרֹאשׁלקלף שני צינורות 1.5 מיליליטר, אחד לטרום סליקה באמצעות IgG עכבר הרגיל והשני לדגירה עם אנטי-דגל Ab. להוסיף 150 μl של חרוזים מגנטיים G-מצומדות חלבון (ראה חומרים) על צינור אחד.
- מניחים את הצינורות על דוכן מגנט ולחכות 3 דקות. בטל supernatant ידי pipetting.
- להשעות את החרוזים 1 מיליליטר של PBS המכיל 0.01% Tween-20 (PBS-T). מניחים את הצינורות על דוכן מגנטי ולחכות 2 דקות. בטל supernatant ידי pipetting, ולאחר מכן לחזור על הצעד.
- להשעות את החרוזים 1 מיליליטר של PBS-T המכיל BSA 0.1%.
- הוסף 15 מיקרוגרם של IgG עכבר הרגיל או אנטי-הדגל Ab ולסובב על 4 מעלות CO / N.
- ספין למטה בקצרה, ואז למקם את הצינורות על דוכן מגנט ולחכות 3 דקות. בטל supernatant ידי pipetting.
- להשעות את החרוזים 1 מיליליטר של PBS-T. הפוך את המדגם מספר פעמים וספין למטה בקצרה. מניחים את הצינורות על דוכן מגנט ולהמתין 3 דקות, ואז להשליך את supernatant ידי pipetting. חזור על לשטוףעוד פעמיים עם PBS-T (כולל של שלושה שלבים לשטוף).
8. הכרומטין immunoprecipitation (מחיר 2 x 10 7 תאים)
- מערבבים את הכרומטין המקוטע הערוך 5.3) (כ -800 μl) עם חמישית מהנפח (כ -200 μl) של תמוגה חיץ שונה 3 המכיל 5% Triton X-100 (ריכוז סופי של 1% Triton X-100).
- מוסיף את פתרון הכרומטין לצינור שבו חרוזים מגנטיים חלבון G-מצומדות מצומדות עם העכבר רגיל IgG הוכנו. סיבוב על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
- מניחים את הצינור על דוכן מגנט ולחכות 3 דקות.
- מעבירים את supernatant לתוך הצינור שבו חרוזים מגנטיים חלבון G-מצומדות מצומדות עם אנטי-הדגל Ab הוכנו. סיבוב על 4 מעלות CO / N.
- מניחים את הצינור על דוכן מגנט ולחכות 3 דקות. בטל supernatant ידי pipetting.
- להשעות את החרוזים 1 מיליליטר של חיץ נמוך מלח (20 מ"מ טריס (pH 8.0), 2 מ"מ EDTA, 150 מ"מ NaCl, 1% TriX-100 טון, מעכבי פרוטאז 0.1% SDS, ו1x) ולסובב על 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מניחים את הצינור על דוכן מגנט ולחכות 3 דקות. בטל supernatant ידי pipetting וחזור על השלב לשטוף.
- שטוף את החרוזים עם חיץ מלח גבוה (20 מ"מ טריס (pH 8.0), 2 מ"מ EDTA, 500 מ"מ NaCl, 1% Triton X-100, מעכבי פרוטאז 0.1% SDS, ו1x) פעמיים.
- שטוף את החרוזים עם חיץ LiCl (10 מ"מ טריס (pH 8.0), 1 mM EDTA, 250 מ"מ LiCl, 0.5% IGEPAL CA-630, 0.5% deoxycholate נתרן, ומעכבי פרוטאז 1x) פעמיים.
- שטוף את החרוזים עם TBS-IGEPAL CA-630 (50 מ"מ טריס (pH 7.5), 150 מ"מ NaCl, מעכבי CA-630 IGEPAL, ופרוטאז 1x 0.1%) פעם אחת.
- להשעות את החרוזים 200 μl של חיץ elution (50 מ"מ טריס (pH 7.5), 150 מ"מ NaCl, 0.1% CA-630 IGEPAL, מעכבי פרוטאז 1x, ו -500 מיקרוגרם / מיליליטר 3 פפטיד × FLAG) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. מניחים את הצינור על דוכן מגנט ולחכות 3 דקות. מעבירים את supernatant לתוך צינור 1.5 מיליליטר חדש ולחזור על elutצעד יון.
- לטהר DNA מחלק קטן (למשל, 5%) של eluate ידי מיצוי פנול, כלורופורם או באמצעות ערכת חילוץ DNA (ראה חומרים). ה- DNA המטוהר יכול לשמש לPCR עם פריימר הספציפי קובע להעריך את התשואות של enChIP ניתוחים על ידי השוואה עם קלט DNA מוכן בשלב 6.7 כפי שתואר לעיל 14,16.
9. SDS-PAGE, מכתים, וניתוח ההמוני spectrometric
- מערבבים את eluate (400 μl) עם 1 מיליליטר של 2-propanol, 50 μl של נתרן אצטט 3M (pH 5.2), ו -5 μl של 20 מ"ג / מיליליטר גליקוגן. לזרז את הכרומטין בCO -20 ° / N.
- צנטריפוגה המדגם (ז × 16,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות) וזורקים supernatant. יש לשטוף את הכדור עם 1 מיליליטר של 70% אתנול ו צנטריפוגות שוב (ז 16,000 × ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות). בטל supernatant לחלוטין על ידי pipetting.
- להשעות את גלולה ב -40 μl של חיץ מדגם 2x (125 מ"מ טריס (pH 6.8), 10% 2-מרצדסaptoethanol, 4% SDS, 10% סוכרוז, ו0.004% bromophenol כחול). וורטקס למשך 5 דקות לפזר את גלולה לחלוטין, ולאחר מכן לדגור על 100 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי לפגל את החלבונים ולהפוך את crosslinking.
- לSDS-PAGE, לרוץ 40 μl של המדגם על הג'ל עד לצבוע מגיע 1 סנטימטר מתחת היטב. הערה: אנו משתמשים בדרך כלל 4-20 ג'לי שיפוע%, אך ניתן להשתמש ג'לי% אחר.
- כתם ג'ל עם כחול מבריק Coomassie או כתם כסף.
- חותך את הג'ל לתוך חמש חתיכות (2 גובה מ"מ).
- לבצע בעיכול ג'ל וניתוח ספקטרומטריה כפי שתואר לעיל 13-16.
- לניסויי SILAC עם 5 x 10 7 תאים כל אחד (סך של 1 x 10 8 תאים), להשעות גלולה מחמישה צינורות הראשוניים ב -40 μl של חיץ מדגם 2x (אין צורך בהיקף של עד).
10. טיהור של ניתוח RNA ו- RNA-Seq
- לטהר RNA לאחר enChIP, להוסיף 5 U / ml של RNase אינהיביטור (SEדואר חומרים) לכל פתרונות החיץ, למעט תמוגה חיץ שונה 3 וחיץ elution, ולכך יש להוסיף 40 U / ml של RNase מונעי.
- מערבבים את eluate (400 μl) עם 16 μl של 5 M NaCl ולדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
- הוסף 1 מיליליטר של מגיב החומצה-guanidinium-מבוסס פנול (ראה חומרים) לדוגמא. וורטקס במשך 15 שניות ולאחר מכן לדגור על RT במשך 5-15 דקות. צנטריפוגה המדגם במשך 15 דקות בגרם 12,000 × וRT.
- מעבירים את supernatant לצינור 1.5 מיליליטר חדש ולהוסיף 5 μl של p-bromoanisole. וורטקס במשך 15 שניות ולאחר מכן לדגור על RT במשך 3-5 דקות. צנטריפוגה המדגם של 10 דקות ב g 12,000 × וRT.
- מעבירים את supernatant (כ 1 מיליליטר) לתוך צינור 2 מיליליטר חדש ולהוסיף 1 מיליליטר של 2-propanol. להפוך את הצינור ולדגור על RT במשך 10 דקות. טען את התערובת על עמודה בערכת טיהור RNA (ראה חומרים). צנטריפוגה עמודת דקות 1 ב 12,000 × ז וRT.
- לִשְׁטוֹףהטור עם 400 μl של רנ"א הצפת לשטוף בערכת טיהור RNA (ראה חומרים).
- להוסיף 80 μl של DNase אני קוקטייל (תערובת של 5 μl של DNase אני (1 U / μl), 8 μl 10 × DNase אני הצפת תגובה, 3 μl מים RNase ללא DNase /, ו -64 μl של רנ"א הצפת לשטוף ב ערכת טיהור RNA (ראה חומרים)) לעמודה. דגירה המדגם ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ואז צנטריפוגות במשך 30 שניות ב12,000 × g וRT.
- לשטוף את העמודה עם 400 μl של רנ"א כביסה מוקדמת הצפת בערכת טיהור RNA (ראה חומרים) פעמיים.
- Elute RNA עם 50 μl של DNase / מים RNase ללא. RNA eluted יכול לשמש לקביעת רצף RNA.
Representative Results
בסך הכל, 1-30% מאזורים הגנומי היעד יכולים להיות מטוהרים באמצעות enChIP. איור 3 כוללים נתונים נציג המציגים את התשואות של enChIP ניתוחי מיקוד הטלומרים והאמרגן של אינטרפרון הגן (IFN) גורם-1 רגולציה (IRF-1). כדוגמאות לתוצאות טיפוסיות, טבלה 1 רשימות החלבונים הקשורים לאמרגן IRF-1 באופן IFNγ ספציפי זוהה על ידי enChIP-SILAC, טבלה 2 רשימות מחייבים חלבוני הטלומרים זוהו על ידי enChIP בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (enChIP-MS) , ולוח 3 רשימות RNAs קשורים עם הטלומרים זוהו על ידי enChIP-רנ"א-Seq.
איור 1. סקירה כללית של enChIP. CRISPR באמצעות enChIP (A, B) וטל (C, D, E אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. רצף של gBlock. אמרגן U6 (בשחור), ב נוקלאוטיד Gefore רצף המדריך (בכחול), רצף המדריך (spacer gRNA) (באדום), רצף הפיגום (בירוק), ורצף שליחות קטלנית (בכתום) מוצגים.
איור 3. תשואות של enChIP נציג ניתוחים. אחוז () תשומות ליעד לוקוס IRF-1 ומוקד Sox2 היעד הלא. אחוז (ב) תשומות להטלומרים היעד וγ-לווינים שאינם יעד. הנתונים הותאמו ושונים מפרסומים קודמים 15,16.
| קטגוריות | חלבונים |
| תַעֲתוּק | DDX1, PARP1, CKAP4, הומולוג Pescadillo, PURβ, פולימראז מופעל RNA השני P15 activator תעתיק, BTF3, Myb מחייב1A חלבון |
| deacetylation היסטון, רכיבי corepressor | RBBP4, PA2G4, TBL3 |
| Acetyltransferase | N-methyltransferase ארגינין חלבון 1 |
| topoisomerase DNA | 2α topoisomerase DNA |
| ההיסטונים | היסטון H2A.Z, H3.2 היסטון |
טבלת 1:. דוגמאות לחלבונים הקשורים לאזור האמרגן IRF-1 האנושי באופן IFNγ ספציפי זוהה על ידי enChIP-SILAC השולחן הותאם מפרסום קודם 16.
| קטגוריות | חלבונים |
| מחייבים חלבוני הטלומרים יונקים | PML, RPA, CDK1, PARP1, PCBP1 |
| הטלומרים-דוחלבוני nding בשמרים או אורגניזמים אחרים | IMP4 |
| חלבוני אינטראקציה עם הטלומרים מחייבים חלבונים [חלבון קושר הטלומרים קשורים] | DNA פולימראז α [Cdc13p] (POLA1), ARMC6 [TRF2], CTBP1 [FOXP2-POT1], exportin-5 [טרט], GNL3L [TRF1], exportin-1 [טרט], 14-3-3 [טרט] |
| חלבוני לוקליזציה לheterochromatin | BEND3 |
| חלבונים המסדירים סימנים אפיגנטיים | KDM5C |
| חלבוני מוטציות שמשפיעים על תפקוד הטלומרים | α DNA פולימרז (POLA1), HAT1, Nup133, CDK7, DPOE1, PRDX1, TYSY, גלוטמט-ציסטאין האנזים, מסוג glutaredoxin, SMRC1 |
טבלה 2:. דוגמאות לחלבונים הקשורים עם הטלומרים עכבר זוהו על ידי enChIP-MS השולחן הייתה adapteד מפרסום קודם 15.
| קטגוריות | RNAs |
| רכיבי טלומרז | Terc, Rmrp |
| Telomeric RNAs | טראס |
| scaRNAs | Scarna6, Scarna10, Scarna13, Scarna2 |
| H / ACA snoRNAs | Snora23, Snora74a, Snora73b, Snora73a |
| C / D snoRNAs | Snord17, Snord15a, Snord118 |
| lncRNA | Neat1 |
לוח 3: דוגמאות לRNAs קשורים עם הטלומרים עכבר זוהו על ידי enChIP-רנ"א-Seq השולחן הותאם מפרסום קודם 17..
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי קרן מדע טאקדה (TF); זכוכית קרן אסאהי; קרן Uehara הזיכרון (HF); Kurata זיכרון Hitachi מדע וטכנולוגית קרן (TF וHF); גרנט ב- סיוע למדענים צעירים (B) (# 25,830,131), גרנט ב- סיוע למחקר מדעי (ג) (# 15K06895) (TF); וגרנט ב- סיוע, גרנט ב- סיוע למחקר מדעי (ב) (# 15H04329), גרנט ב- סיוע למחקר גישוש (למחקר מדעי על "מחזור תמלול 'תחומי חדשניים (# 25,118,512 & # 15H01354) # 26650059) ו'הגנום תמיכה '(# 221S0002) (HF) ממשרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה של יפן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gBlock synthesis service | Life Technologies | Gene Synthesis by GeneArt | |
| gBlock synthesis service | IDT (Integrated DNA Technologies) | gBlocks Gene Fragments | |
| pSIR-neo | Addgene | 51128 | |
| pSIR-GFP | Addgene | 51134 | |
| pSIR-DsRed-Express2 | Addgene | 51135 | |
| pSIR-hCD2 | Addgene | 51143 | |
| TAL synthesis service | Life Technologies | GeneArt Precision TALs | |
| 3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1 | Addgene | 47948 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-puro | Addgene | 51240 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-IG | Addgene | 51258 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-I2 | Addgene | 51259 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-neo | Addgene | 51260 | |
| anti-FLAG M2 Ab | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| FITC-conjugated anti-FLAG M2 | Sigma-Aldrich | F4049 | |
| DMEM medium for SILAC | Life Technologies | 89985 | Other medium can be purchased from Life Technologies |
| Dialyzed FBS for SILAC | Life Technologies | 89986 | |
| L-Lysine-2HCl for SILAC | Life Technologies | 89987 | For Light medium |
| L-Arginine-HCl for SILAC | Life Technologies | 89989 | For Light medium |
| L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC | Life Technologies | 89988 | For Heavy medium |
| L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC | Life Technologies | 89990 | For Heavy medium |
| Complete, mini, EDTA-free | Roche Diagnostics | 4693159 | |
| Ultrasonic Disruptor UD-201 | Tomy Seiko | ||
| ChIP DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D5205 | |
| Dynabeads-Protein G | Life Technologies | DB10004 | |
| RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2611 | |
| Isogen II | Nippon Gene | 311-07361 | |
| Direct-zol RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2050 | |
| LTQ Orbitrap Velos | Thermo Fisher Scientific | A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis | |
| nanoLC | Advance, Michrom Bioresources | A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis | |
| HTC-PAL autosampler | CTC Analytics | A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis |
References
- Zhang, X. Y., Horz, W. Analysis of highly purified satellite DNA containing chromatin from the mouse. Nucleic Acids Res. 10, 1481-1494 (1982).
- Workman, J. L., Langmore, J. P. Nucleoprotein hybridization: a method for isolating specific genes as high molecular weight chromatin. Biochemstry. 24, 7486-7497 (1985).
- Boffa, L. C., Carpaneto, E. M., Allfrey, V. G. Isolation of active genes containing CAG repeats by DNA strand invasion by a peptide nucleic acid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 1901-1905 (1995).
- Jaskinskas, A., Hamkalo, B. A. Purification and initial characterization of primate satellite chromatin. Chromosome Res. 7, 341-354 (1999).
- Griesenbeck, J., Boeger, H., Strattan, J. S., Kornberg, R. D. Affinity purification of specific chromatin segments from chromosomal loci in yeast. Mol. Cell Biol. 23, 9275-9282 (2003).
- Ghirlando, R., Felsenfeld, G. Hydrodynamic studies on defined heterochromatin fragments support a 30-µm fiber having six nucleosomes per turn. J. Mol. Biol. 376, 1417-1425 (2008).
- Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
- Hoshino, A., Fujii, H. Insertional chromatin immunoprecipitation: a method for isolating specific genomic regions. J. Biosci. Bioeng. 108, 446-449 (2009).
- Fujita, T., Fujii, H. Direct idenification of insulator components by insertional chromatin immunoprecipitation. PLoS One. 6, e26109 (2011).
- Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions by insertional chromatin immunoprecipitation (iChIP) with a second-generation tagged LexA DNA-binding domain. Adv. Biosci. Biotechnol. 3, 626-629 (2012).
- Fujita, T., Fujii, H. Locus-specific biochemical epigenetics / chromatin biochemistry by insertional chromatin immunoprecipitation. ISRN Biochem. 2013, 913273 (2013).
- Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions retaining molecular interactions by the iChIP system using recombinant exogenous DNA-binding proteins. BMC Mol. Biol. 15, 26 (2014).
- Fujita, T., Kitaura, F., Fujii, H. A critical role of the Thy28-MYH9 axis in B cell-specific expression of the Pax5 gene in chicken B cells. PLoS One. 10, (2015).
- Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated proteins by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Biochem. Biophys. Res. Commun. 439, 132-136 (2013).
- Fujita, T., et al. Identification of telomere-associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP). Sci. Rep. 3, 3171 (2013).
- Fujita, T., Fujii, H. Identification of proteins associated with an IFNγ-responsive promoter by a retroviral expression system for enChIP using CRISPR. PLoS One. 9, e103084 (2014).
- Fujita, T., Yuno, M., Okuzaki, D., Ohki, R., Fujii, H. Identification of non-coding RNAs associated with telomeres using a combination of enChIP and RNA sequencing. PLoS One. 10, e0123387 (2015).
- Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. , (2014).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Esvelt, K. M., et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nat. Methods. 10, 1116-1121 (2013).
- Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152, 1173-1183 (2013).
- Wu, X., et al. Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 32, 670-676 (2014).
- Kuscu, C., Arslan, S., Singh, R., Thorpe, J., Adli, M. Genome-wide analysis reveals characteristics of off-target sites bound by the Cas9 endonuclease. Nat Biotechnol. 32, 677-683 (2014).
- Cencic, R., et al. Protospacer adjacent motif (PAM)-distal sequences engage CRISPR Cas9 DNA target cleavage. PLoS One. 9, 109213 (2014).
- O'Green, H., Henry, I. M., Bhakta, M. S., Meckler, J. F., Segal, D. J. A genome-wide analysis of Cas9 binding specificity using ChIP-seq and targeted sequence capture. Nucleic Acids Res. 43, 3389-3404 (2015).
- de Lange, T. Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres. Genes Dev. 19, 2100-2110 (2005).
