Introduction
관심의 특정 게놈 영역과 관련된 분자의 동정은 이러한 전사 및 후생 유전 학적 조절 게놈 기능 조절 메커니즘을 이해하기 위해 필요하다. 여러 기술들이 특정 게놈 영역 1-7의 생화학 적 분석을 위해 개발되었지만, 이들은 때문에 이러한 제한된 애플리케이션 (예에만 반복으로 높은 카피 수 궤적 또는 유전자좌에 대한)과 같은 그들의 본질적인 문제로,이 단계에서 널리 사용되지 너무 많은 시간과 노력이 필요합니다.
쉽게 특정 게놈 영역의 생화학 적 분석을 수행하기 위해, 우리는 14-17 개의 궤적 특정 염색질 면역 (칩) 기술, 즉 삽입 성 온칩 (iChIP) 8-13 및 설계 DNA 결합 분자 매개 칩 (enChIP)을 개발했다 . iChIP에서 관심의 궤적이 같은 렉스와 같은 외래 DNA 결합 단백질의 삽입 인식 서열에 의해 태그가A. 궤적은 다음 태그 DNA 결합 단백질을 이용하여 친 화성 정제에 의해 격리됩니다. enChIP에서, 아연 손가락 단백질, 전사 활성제와 같은 (TAL) 단백질과 같은 DNA 결합 분자를 설계하고, 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 회문 반복 (CRISPR) 단지는 (그림 1) 관심의 궤적을 태그하는 데 사용됩니다. 그 후, 게놈 영역은 태그 DNA 결합 분자의 친 화성 정제에 의해 격리됩니다.
iChIP 위에 enChIP의 장점 중 하나는 외래 DNA 결합 단백질의 인식 서열의 삽입이 필요하지 않다는 것이다. Cas9 (dCas9)의 촉매 비활성 형태로 구성된 CRISPR 건물 및 가이드 RNA (gRNA)를 사용하여 궤적의 타겟팅 TAL 아연 손가락 단백질을 사용하여 iChIP 또는 enChIP에 의해이 지역의 대상보다 훨씬 쉽다. 여기서, 우리는 질량 분석 및 RNA 서열과 결합 enChIP 단계별 프로토콜을 서술 (RNA-SEQ)는 궤적-소시아를 식별테드 단백질과 RNA를 각각.
Protocol
대상 궤적을 인식 엔지니어링 DNA 결합 분자의 1. 디자인
- CRISPR 착체를 사용 enChIP 들어, 앞서 설명한 바와 같이 18 관심 게놈 영역 후보 gRNA 표적 서열을 확인하기 CRISPRdirect 웹 도구 (http://crispr.dbcls.jp)를 사용한다. 이 웹 도구는 형태의 23 bp의 게놈 사이트를 반환 5'-N (20) NGG-3 '대상 지역 내.
- U6 프로모터 서열 및 5'-N (20)의 시퀀스를 사용하여 상용 서비스 5'-N 20 NGG-3 '을 포함 gBlock 합성 19, 20 (도 2 참조). 목적을 서브 클로닝, gBlock 외부 적당한 제한 효소 부위를 포함한다.
- 이전 16 설명 된대로 적절한 벡터에 gBlock를 삽입합니다. gBlocks에 대한 몇 가지 레트로 바이러스 벡터는 (자료 참조)을 사용할 수 있습니다.
- TAL 단백질을 사용 enChIP 들어 TARG 인식 TAL 단백질 설계등의 궤적. 상용 서비스를 사용 TAL 단백질을 암호화하는 플라스미드를 생성합니다. 앞서 설명한 바와 같은 15 × 3의 FLAG와 같은 하나 또는 그 이상의 태그들과 융합 TAL 단백질을 포함하는 발현 벡터를 생성한다.
enChIP 분석을위한 세포의 2. 설립
- 3 × FLAG-dCas9 및 gRNA (CRISPR 기반 절차) 또는 익스프레스 3 이전에 14 ~ 17 설명 된대로 × FLAG-TAL 세포 (TAL 단백질 기반의 절차가) 분석합니다.
- 형질 전환 효율이 높으면 일시적인 형질 감염을 사용한다. 3 × FLAG-dCas9 및 CMV 프로모터를 포함하는 발현 벡터 (자료 참조)를 사용할 수 있습니다.
- 일시적 트랜 스펙 션 효율이 낮은 경우에는 통상적 인 방법을 사용하여 안정한 형질 전환을 확립 고려한다. gBlock에 대한 상기 레트로 바이러스 벡터에 추가하여, 3 × FLAG-dCas9의 레트로 바이러스 벡터는 (자료 참조)을 사용할 수 있습니다.
- 표준 RT-PCR 기술에 의해 gRNA의 발현을 확인합니다.
- 관심의 게놈 영역과 상호 작용하는 단백질의 정량 확인을 위해, 세포 배양 (SILAC) enChIP (enChIP-SILAC)와 결합 분석에 아미노산에 의해 안정 동위 원소 표지의 사용을 고려한다.
참고 : SILAC 분석을위한 미디어는 상용 공급 업체에서 구입하실 수 있습니다. SILAC 특정 상호 작용을 검출하는 강력한입니다.- SILAC 무거운 배지에서 배양 세포. 세포 cultu 준비음성 대조군으로 SILAC 광 매체에 빨간색. (무거운 또는 빛) 각 SILAC 매체 적어도 5 × 10 7 세포를 사용합니다. 효율적인 라벨은 모두 L- 라이신 - 2HCl, 13 C 6, L 아르기닌 - 염산, SILAC 중공업 미디어 13 C 6, 15 N 4를 추가합니다. 참고 : 적어도 5 세포 분열이 라벨 단백질이 필요하다.
- 예를 들어, 안정적 라이신 2HCl 플러스 L- 아르기닌 - 염산 (라이트 배지) SILAC위한 DMEM 배지 및 투석 된 소 태아 혈청에서 37 ° C, 5 % CO 2에서 3xFLAG-dCas9 및 gRNA 발현 배양 인간 섬유 육종 HT1080 세포 또는 13 C 6 L- 라이신 - 2HCl 플러스 13 C 6 15 N 4 L 아르기닌 염산 (헤비 매체) (16) (자료 참조). 매체의 500 ml의 빛 또는 무거운 L- 라이신 - 2HCl과 L- 아르기닌 염산 50 mg을 추가합니다.
- 세포가 지수 growt을 유지하도록를 Trypsinize 및 replate 세포는 그들이 합류되기 전에시간.
- SILAC 무거운 배지에서 배양 세포. 세포 cultu 준비음성 대조군으로 SILAC 광 매체에 빨간색. (무거운 또는 빛) 각 SILAC 매체 적어도 5 × 10 7 세포를 사용합니다. 효율적인 라벨은 모두 L- 라이신 - 2HCl, 13 C 6, L 아르기닌 - 염산, SILAC 중공업 미디어 13 C 6, 15 N 4를 추가합니다. 참고 : 적어도 5 세포 분열이 라벨 단백질이 필요하다.
주 :이 태그 된 단백질의 발현과 같은 항 - FLAG-FITC 및 후속 FACS 분석으로 세포 염색에 의해 확인 될 수있다. 세포 내 염색을위한 프로토콜은 홈페이지 (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html)에서 다운로드 할 수 있습니다.
포름 알데히드와 세포의 3. 가교
- 현탁 배양 세포에서, 전사 2 × 107 3xFLAG-TAL 단백질 또는 3xFLAG-dCas9 플러스 gRNA을 발현하는 세포와 50 mL의 원심 분리 튜브에 일정한 배지 30 ㎖에 서스펜드. 이상의 셀이 사용될 때, 비례 시약의 양 및 양을 증가시킨다. SILAC 실험에, 무거운 매체 또는 광 매체 (5 × 107 세포 당)에서 배양 세포를 혼합하여 2 × 107 세포를 함유하는 튜브 (5)에 1 × 108 세포의 총 나눈다.
- 세포 현탁액 (1 % 최종 농도)의 30 mL의 37 % 포름 알데히드의 810 μl를 첨가하고 5 분 동안 37 ℃에서 배양한다. 부착 세포에 직접 배지 30 ㎖에 37 % 포름 알데히드 810 μl를 첨가하여 배양 접시에 세포를 고정한다.
- 1.25 M 글리신 용액 (최종 농도 127 mM)을 3.1 mL를 첨가하여 가교를 중지실온에서 10 분 동안 품어.
- 원심 분리 (4 ℃에서 5 분 300 ×의 G)에 의해 세포를 수집합니다. 조심스럽게 상층 액을 포함하여 포름 알데히드를 무시하고, 적절한 폐기 용기에 보관하십시오.
- 부착 세포의 경우, 50 ㎖ 튜브에서 셀 스크레이퍼로 세포를 수확 분리하고,이 단계에 기재된 바와 같이 세포를 수집한다.
- SILAC 실험에, 무거운 매체 또는 광 매체 (5 × 107 세포 당)로 배양 분리 세포를 혼합 2 × 107 세포를 함유하는 5 튜브에 1 × 108 세포의 전체를 분할하고, 이것에 기재된 바와 같이 세포를 수집 단계.
- 튜브에 두 번 PBS의 30 mL를 세포 펠렛을 씻으십시오. 조심스럽게 포름 알데히드를 포함하여 상층 액을 제거하고 화학 물질 안전 지침에 따라 포름 알데히드 폐기물 bottle.Handle 적절한 폐기에 저장합니다. 고정 된 세포는 동결 및 -80 ℃에서 저장 될 수있다.
염색질 4. 준비 (당 2 × 107 세포)
- 세포 용해 완충 용액 10 ㎖ (10 mM 트리스 (PH 8.0), 1 mM의 EDTA, 0.5 % IGEPAL의 CA-630, 그리고 1 × 프로테아제 억제제)에 고정 된 세포를 중단하고 10 분 동안 얼음 위에서 배양한다.
- 원심 분리기 샘플 (8 분 4 ° C에서 830 ×의 g)을 조심스럽게 상층 액을 버린다.
- 핵 용해 완충액 10ml에 펠릿을 정지 (10 mM 트리스 (PH 8.0), 1 mM의 EDTA, 0.5 M의 NaCl, 1 % 트리톤 X-100, 0.5 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 0.5 % lauroylsarcosine 및 1X 프로테아제 억제제). 10 분 동안 얼음에 품어 모든 2 ~ 3 분 소용돌이.
- (830 ×을 샘플을 원심 분리기 8 분 4 ° C에서 g)을 조심스럽게 상층 액을 버린다.
- PBS 10ml에 펠렛을 씻으십시오. 펠렛 (염색질 분획)을 액체 질소에서 즉시 냉동 후 -80 ℃에서 저장 될 수있다.
염색질 5. 초음파 처리 (2 × 10 7 세포 당)
- 800 μL의 염색질 부분을 일시 중단변성 용해 완충액 3 (10 mM 트리스 (PH 8.0), 1 mM의 EDTA, 150 mM의 염화나트륨, 0.1 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 0.1 % SDS, 및 1X 프로테아제 억제제) 및 1.5 ㎖의 튜브에 옮긴다.
- 출력 : (원료 참조) 초음파기를 이용하여 염색질 및 다음의 조건 (3)을 초음파 처리; 의무 : 100 % (연속) 시간 : 무료. 10 초 동안 초음파의 10-18 사이클을 수행하고 20 초 동안 얼음에 냉각. 과도한 난방을 피하기 2 분마다 5 ~ 6주기 동안 얼음에 샘플을 품어. 발포 방지하기 위해, 0.5 cm 튜브 바닥 상기 초음파 프로브의 선단의 위치를 유지한다.
- 원심 분리기에서 샘플 (10 분 동안 4 ℃에서 16,000 ×의 g) 및은 1.5 ML 튜브에 뜨는을 전송합니다. 초음파 염색질은 액체 질소에서 즉시 냉동 후 -80 ℃에서 저장 될 수있다.
염색질 조각화 6. 평가
- 증류수 85 μL와 조각난 염색질의 10 μl를 섞는다.
- 4 μl를 추가5 M의 NaCl 65 ° CO / N에 품어.
- 10 ㎎ / ㎖의 RNase의 1 μl를 추가하고 45 분 동안 37 ° C에서 품어.
- 의 0.5 M EDTA (pH 8.0), 1 M 트리스 (PH 6.8)의 4 μL, 20 mg을 1 μL / ㎖ 테 K 2 μl를 추가하고 1.5 시간 동안 45 ℃에서 배양한다.
- 이러한 SYBR 그린과 같은 염색 염료를 포함하지 않는 1 % 아가 로스 겔에서 전기 영동에 의해 분리 된 샘플 10 μL.
- 단편화 된 염색질의 길이의 분포를 평가하는 겔을 염색. 0.5 KBP (0.2-4 KBP의 범위)의 평균 길이를 생성 조건이 좋습니다.
- 페놀 - 클로로포름 추출에 의해 또는 DNA 추출 키트 (자료를 참조)를 사용하여 나머지 샘플로부터 DNA를 정제 하였다. 정제 된 DNA는 enChIP 분석의 수율 (8.11 참조)를 추정하기 위해 입력 DNA로 사용할 수있다.
항체와 Dynabeads 공역 7. 준비 (2 × 10 7 세포 당)
- 사전두 개의 1.5 ml의 튜브, 정상 마우스의 IgG를 사용하여 미리 청소 하나는 안티 - 플래그 Ab의와 배양을위한 다른 깎다. 각각의 튜브에 단백질 G - 복합 자석 구슬 150 μl를 (자료 참조)를 추가합니다.
- 자석 스탠드에 튜브를 넣고 3 분을 기다립니다. 피펫으로 상층 액을 버린다.
- PBS는 0.01 % 트윈 20 (PBS-T)를 함유하는 1 ㎖의 비드를 중단. 자기 스탠드에 튜브를 넣고 2 분 동안 기다립니다. 피펫으로 상층 액을 버리고, 다음 단계를 반복합니다.
- 0.1 % BSA를 포함하는 PBS-T에 1 ㎖ 구슬을 정지.
- 정상 마우스의 IgG 또는 안티 - 플래그 Ab의 15 μg의 추가 4 ° CO / N로 회전.
- 다음, 간단히 스핀 다운 자석 스탠드에 튜브를 넣고 3 분을 기다립니다. 피펫으로 상층 액을 버린다.
- PBS-T에 1 ㎖ 구슬을 정지. 샘플을 여러 번 전환 간단히 스핀 다운. 다음 피펫으로 상층 액을 버리고, 자석 스탠드에 튜브를 넣고 3 분을 기다립니다. 세탁을 반복PBS-T (세 세척 단계의 총)을 두 번 더.
8. 염색질 면역 침전 (2 × 10 7 세포 당)
- 부피의 1/5 5 % 트리톤 X-100 (1 % 트리톤 X-100의 최종 농도)를 함유하는 개질 된 용해 완충액 (3)의 (약 200 μL)에 5.3에서 제조 단편화 염색질) (약 800 μL)을 혼합한다.
- 일반 마우스 IgG가 결합 단백질 G - 복합 자석 구슬을 준비했다있는 튜브로 염색질 솔루션을 추가합니다. 1 시간 동안 4 ° C에서 회전합니다.
- 자석 스탠드에 튜브를 넣고 3 분을 기다립니다.
- 안티 - 플래그 Ab의와 결합 단백질 G - 복합 자석 구슬을 준비했다있는 튜브에 뜨는을 전송합니다. 4 ° CO / N로 돌립니다.
- 자석 스탠드에 튜브를 넣고 3 분을 기다립니다. 피펫으로 상층 액을 버린다.
- 저염 완충액 (20 mM 트리스 (PH 8.0), 2 mM의 EDTA, 150 mM의 염화나트륨, 1 % 트라이 1 ㎖에 구슬을 정지톤 X-100, 0.1 % SDS, 및 1X 프로테아제 억제제)과 5 분 동안 4 ℃에서 회전한다. 자석 스탠드에 튜브를 넣고 3 분을 기다립니다. 피펫으로 상층 액을 제거하고 세척 단계를 반복합니다.
- 두 배 높은 소금 버퍼 (20 mM 트리스 (PH 8.0), 2 mM의 EDTA, 500 mM의 NaCl을, 1 % 트리톤 X-100, 0.1 % SDS, 및 1X 프로테아제 억제제)와 구슬을 씻으십시오.
- 두번의 LiCl 완충액 (10 mM 트리스 (PH 8.0), 1 mM의 EDTA, 250 mM의 LiCl을, 0.5 % IGEPAL CA-630을, 0.5 % 나트륨 데 옥시 콜레이트 및 1X 프로테아제 억제제)과 비드를 세척 하였다.
- 한 번 TBS-IGEPAL CA-630 (50 mM 트리스 (PH 7.5), 150 mM의 NaCl을, 0.1 % IGEPAL의 CA-630, 및 1X 프로테아제 억제제)와 구슬을 씻으십시오.
- 용출 완충액 200 μL의 구슬을 정지 (50 mM 트리스 (PH 7.5), 150 mM의 염화나트륨, 0.1 % IGEPAL의 CA-630, 1X 프로테아제 억제제, 및 500 μg의 / ㎖ × 3 FLAG 펩티드)과는 37 ° C에서 배양 20 분. 자석 스탠드에 튜브를 넣고 3 분을 기다립니다. 새로운 1.5 ML 튜브에 뜨는을 전송하고 엘 루트를 반복이온 공정.
- 페놀 - 클로로포름 추출에 의해 또는 DNA 추출 키트를 사용하여 용출의 DNA를 작은 부분에서 (예를 들면, 5 %)로 정제 (자료를 참조). 정제 된 DNA는 특정 프라이머 enChIP는 이전에 설명한 바와 같이 단계 (14, 16)에서 제조 한 6.7 입력 된 DNA와 비교하여 분석 수율을 추정하는 설정으로 PCR에 사용될 수있다.
9. SDS-PAGE, 염색 및 질량 분석
- 1 2- 프로판올 용액, 3M 아세트산 나트륨 (PH 5.2) 50 μL, 20 ㎎ / ㎖의 5 μL의 글리코겐과 용출 (400 μL)를 혼합한다. -20 ° CO / N에서 염색질을 침전.
- 원심 분리기 샘플 (30 분 4 ℃에서 16,000 ×의 g) 및 상층 액을 버린다. (10 분간 4 ℃에서 16,000 ×의 g)을 70 % 에탄올과 원심 분리기 다시 1 ㎖와 펠렛을 씻어. 피펫에 의해 완전히 상층 액을 버린다.
- 배의 샘플 버퍼 (125 mM 트리스 (PH 6.8), 10 % (2) - 용병의 40 μL에 펠렛을 일시 중단aptoethanol, 4 % SDS, 10 % 수 크로즈, 및 0.004 % 브로 모 페놀 블루). 5 분 동안 소용돌이를 완전히 펠렛을 용해하고 단백질을 변성하고, 가교를 반대로 30 분 동안 100 ° C에서 배양.
- 염료가 잘 1cm 이하에 도달 할 때까지에 대해 SDS-PAGE, 겔 시료 40 μL를 실행. 참고 : 보통 4~20% 구배 겔을 사용하지만, 다른 % 겔이 사용될 수있다.
- 쿠마 브릴리언트 블루 또는 실버 얼룩 젤 얼룩.
- 다섯 개 (2 mm 높이)에 젤을 잘라.
- 앞서 설명한 바와 같이 13-16 겔 소화 질량 분석에서 수행한다.
- 5 × 10 7 세포 각 (1 × 10 8 세포의 총)와 SILAC 실험의 경우, 2 배 샘플 버퍼의 40 μL의 초기 다섯 튜브 (그것을 확장 할 필요가 없습니다)에서 펠렛을 일시 중지합니다.
RNA와 RNA-서열 분석 (10) 정제
- enChIP 후 RNA를 정화하기 위해,의 RNase 억제제의 5 U / ㎖를 추가 (SE완충 용액의 모든 전자 물질), 변성 용해 버퍼 (3) 및 용출 완충액의 RNase 억제제를 제외하는 40 U / ㎖를 추가한다.
- 5 M NaCl을 16 μL로 용출액 (400 μL)를 혼합하고 2 시간 동안 65 ° C에서 품어.
- 샘플 산 - 구 아니 디늄 - 페놀 계 시약 1 ㎖를 (자료 참조)를 추가합니다. 다음 15 초 동안 소용돌이와는 5 ~ 15 분 동안 실온에서 품어. 12,000 × g에서 및 RT에서 15 분 동안 샘플을 원심 분리기.
- 새로운 1.5 ML 튜브에 뜨는을 전송하고 P-bromoanisole의 5 μl를 추가합니다. 다음 15 초 동안 소용돌이와는 3 ~ 5 분 동안 실온에서 품어. 12,000 × g에서 및 RT에서 10 분 동안 샘플을 원심 분리기.
- 새로운 2 ㎖의 튜브에 상청 (약 1ml)에 전송하고, 2- 프로판올 1 ㎖를 추가한다. 튜브를 전환하고 10 분 동안 RT에서 배양한다. (자료 참조) RNA 정제 키트의 컬럼에 혼합물을로드합니다. 12,000 ×에서 1 분 동안 열을 원심 분리기 g 및 RT.
- 빨래RNA 정제 키트에서 RNA 세척 버퍼 400 μL (자료 참조) 열입니다.
- DNase의 I (1 U / μL), 10 ×의 DNase I 반응 버퍼의 8 μL, DNase의 /의 RNase없는 물 3 μL,와 RNA 세척 버퍼의 64 μL의 5 μL의 DNase의 나는 칵테일의 80 μl를 추가 (혼합물 컬럼 RNA 정제 키트 (자재) 참조). 15 분 동안 37 ℃에서 샘플을 인큐베이션 한 후 12,000 × g 및 RT에서 30 초간 원심 분리기.
- 두 번 RNA 정제 키트에서 RNA 예비 세탁 버퍼 400 μL (자료 참조) 컬럼을 씻으십시오.
- DNase의 /의 RNA 분해 효소가없는 물을 50 μL와 RNA를 용출시킨다. 용출 된 RNA는 RNA 서열에 대해 사용될 수있다.
Representative Results
전반적으로, 대상 게놈 영역 1-30 %의. enChIP을 사용하여 정제 3 enChIP의 수율을 보여주는 대표적인 데이터를 포함도 할 수는 텔로미어와 인터페론 (IFN) 규제 요인 1 (IRF-1) 유전자의 프로모터를 대상으로 분석한다. 전형적인 결과, 표 1의 예로서 enChIP-SILAC 표에 의해 식별 IFNγ 특정 방식 IRF-1 프로모터와 연관 단백질 2에는, 질량 스펙트럼과 결합 enChIP 의해 식별 텔로미어 - 결합 단백질 (enChIP-MS) 그리고 표 3 enChIP-RNA-SEQ 의해 식별과 연관된 텔로미어의 RNA.
enChIP 1. 개요를 그림. enChIP 사용 CRISPR (A, B)와 TAL (C, D, E 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
gBlock 그림 2. 순서. U6 프로모터 (검은 색), G 염기 B는 efore 가이드 시퀀스 (파란색), 가이드 순서 (빨간색) (gRNA 스페이서), (녹색) 비계 순서, 및 (오렌지) 터미네이터 서열이 표시됩니다.
대표 enChIP 분석 3. 수익률 그림. 타겟 IRF-1 궤적과 비 표적 Sox2이 궤적에 대한 (A) 백분율 입력한다. 타겟 텔로미어 및 비 표적 γ-위성 대 (B)의 백분율 입력한다. 그림은 적응 이전 간행물 (15, 16)에서 수정되었습니다.
| 카테고리 | 단백질 |
| 전사 | DDX1, PARP1, CKAP4, Pescadillo의 동족체, PURβ, 활성화 된 RNA 중합 효소 II 전사 활성제 P15, BTF3, MYB가 결합단백질 1A |
| 히스톤 탈 아세틸 화, corepressor 구성 요소 | RBBP4, PA2G4, TBL3 |
| 아세틸 | 단백질 아르기닌 N-메틸화 된 1 |
| DNA 토포 아이소 머라 | DNA 토포 아이소 머라 제의 2α |
| 히스톤 | 히스톤 H2A.Z, 히스톤 H3.2 |
표 1. enChIP-SILAC 의해 식별 IFNγ 특정 방식으로 인간 IRF-1 프로모터 영역과 연관된 단백질의 예는 테이블 (16)로부터 이전에 발행하도록 구성되었다.
| 카테고리 | 단백질 |
| 포유류 텔로미어 결합 단백질 | PML, RPA, CDK1, PARP1, PCBP1 |
| 텔로미어-BI효모에서 찾아내는 단백질 또는 다른 생물 | IMP4 |
| 와 상호 작용하는 단백질 텔로미어가 결합 단백질 [관련 텔로미어 결합 단백질] | DNA 중합 효소 (α) (POLA1) Cdc13p] ARMC6 [(TRf2), CTBP1 [FOXP2-POT1] exportin-5 [3 급], GNL3L [TRF1] exportin -1- [TERT, 14-3-3 [TERT] |
| 이질에 현지화 단백질 | BEND3 |
| 단백질은 후생 유전 학적 마크를 조절 | KDM5C |
| 그 돌연변이 텔로미어의 기능에 영향을 미치는 단백질 | DNA 중합 효소 (α) (POLA1), HAT1, Nup133, CDK7, DPOE1, PRDX1, TYSY, 글루타민산 염 시스테인 리가, glutaredoxin, SMRC1 |
표 2. enChIP-MS에 의해 식별 마우스 텔로미어와 관련된 단백질의 예로는 표 adapte왔다이전 발행 15 D.
| 카테고리 | RNA를 |
| 텔로 머라 제의 구성 요소 | TERC, Rmrp |
| 텔로미어 RNA를 | TERRAs |
| scaRNAs | Scarna6, Scarna10, Scarna13, Scarna2 |
| H / ACA snoRNAs | Snora23, Snora74a, Snora73b, Snora73a |
| C / D snoRNAs | Snord17, Snord15a, Snord118 |
| lncRNA | Neat1 |
표 3 :. enChIP이-RNA-서열 표는 이전 발행 17에서 적응 된 식별 마우스 텔로미어와 관련된 RNA를 예.
Acknowledgments
이 작품은 다케다 과학 재단 (TF)에 의해 지원되었다; 아사히 글라스 재단; 우에하라 기념 재단 (HF); 쿠라타 기념 히타치 과학 기술 재단 (TF 및 HF); 부여 - 에이드의 젊은 과학자를위한 (B) (# 25830131), 그랜트 - 에이드의 과학 연구 (C) (# 15K06895) (TF)에 대한; 및 보조금 에이드의 혁신 분야 '전사주기'에 대한 과학 연구를위한 (# 25118512 & # 15H01354), 그랜트 - 에이드의 과학 연구 (B) (# 15H04329)에 대한 그랜트 - 에이드의 탐색 적 연구 ( # 26650059)과 일본의 교육부, 문화, 스포츠, 과학 기술에서 '게놈 지원'(# 221S0002) (HF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gBlock synthesis service | Life Technologies | Gene Synthesis by GeneArt | |
| gBlock synthesis service | IDT (Integrated DNA Technologies) | gBlocks Gene Fragments | |
| pSIR-neo | Addgene | 51128 | |
| pSIR-GFP | Addgene | 51134 | |
| pSIR-DsRed-Express2 | Addgene | 51135 | |
| pSIR-hCD2 | Addgene | 51143 | |
| TAL synthesis service | Life Technologies | GeneArt Precision TALs | |
| 3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1 | Addgene | 47948 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-puro | Addgene | 51240 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-IG | Addgene | 51258 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-I2 | Addgene | 51259 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-neo | Addgene | 51260 | |
| anti-FLAG M2 Ab | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| FITC-conjugated anti-FLAG M2 | Sigma-Aldrich | F4049 | |
| DMEM medium for SILAC | Life Technologies | 89985 | Other medium can be purchased from Life Technologies |
| Dialyzed FBS for SILAC | Life Technologies | 89986 | |
| L-Lysine-2HCl for SILAC | Life Technologies | 89987 | For Light medium |
| L-Arginine-HCl for SILAC | Life Technologies | 89989 | For Light medium |
| L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC | Life Technologies | 89988 | For Heavy medium |
| L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC | Life Technologies | 89990 | For Heavy medium |
| Complete, mini, EDTA-free | Roche Diagnostics | 4693159 | |
| Ultrasonic Disruptor UD-201 | Tomy Seiko | ||
| ChIP DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D5205 | |
| Dynabeads-Protein G | Life Technologies | DB10004 | |
| RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2611 | |
| Isogen II | Nippon Gene | 311-07361 | |
| Direct-zol RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2050 | |
| LTQ Orbitrap Velos | Thermo Fisher Scientific | A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis | |
| nanoLC | Advance, Michrom Bioresources | A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis | |
| HTC-PAL autosampler | CTC Analytics | A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis |
References
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