Introduction
De identificatie van moleculen geassocieerd met specifieke genomische gebieden van belang is vereist om de regulatiemechanismen van genomische functies zoals transcriptie en epigenetische regulering begrijpen. Hoewel verschillende technieken ontwikkeld voor biochemische analyse van specifieke genomische gebieden 1-7, zijn deze niet op grote schaal gebruikt in dit stadium vanwege hun intrinsieke problemen zoals beperkte toepassing (bijvoorbeeld alleen bij hoge kopieaantal loci of loci met herhalingen) en te veel tijd en inspanningen nodig.
Om de biochemische analyse van specifieke genomische gebieden gemakkelijk uit te voeren, hebben we twee locus-specifieke chromatine immunoprecipitatie (ChIP) technologieën, namelijk insertionele chip (ichip) 8-13 en gemanipuleerde DNA-bindende-molecuul bemiddelde chip (enChIP) ontwikkeld 14-17 . In ichip, wordt een meetkundige plaats gelabeld door het inbrengen herkenningssequenties van een exogeen DNA-bindend eiwit zoals LexA. De locus wordt vervolgens geïsoleerd door affiniteitszuivering met de gelabeld DNA-bindend eiwit. In enChIP, gemanipuleerde DNA-bindende moleculen, zoals zinkvinger eiwitten, transcriptie-activator-achtige (TAL) proteïnen, en geclusterde regelmatig interspaced korte palindroom repeats (CRISPR) complexen worden gebruikt om een meetkundige plaats taggen (figuur 1). Vervolgens wordt het genomische regio geïsoleerd door affiniteitszuivering van het gelabelde DNA-bindende moleculen.
Een van de voordelen van enChIP dan ichip is dat insertie van herkenningssequenties van een exogeen DNA-bindende eiwit niet noodzakelijk. Targeting loci met CRISPR complexen bestaande uit een katalytisch inactieve vorm van Cas9 (dCas9) en een gids RNA (gRNA) is veel gemakkelijker dan de gerichtheid van deze regio's door ichip of enChIP met TAL en zink-vinger eiwitten. Hier beschrijven we een stap-voor-stap protocol voor enChIP gecombineerd met massaspectrometrie en RNA-sequencing (RNA-Seq) naar locus-vereniging te identificerented eiwitten en RNAs, respectievelijk.
Protocol
1. Ontwerp van Engineered DNA-bindende moleculen bewust van de Target Locus
- Voor enChIP gebruik CRISPR complexen, gebruik dan de CRISPRdirect webtool (http://crispr.dbcls.jp) voor kandidaat gRNA doelwit sequenties in de genomische regio van belang beschreven, zoals eerder 18 identificeren. Deze webtool keert 23 bp genomische plaatsen van de vorm 5'-N 20 NGG-3 'binnen het doelgebied.
- Synthetiseren een gBlock inclusief U6 promotersequentie en de sequentie van 5'-N 20 in 5'-N 20 NGG-3 'met andere voorzieningen (zie figuur 2) 19,20. Voor subklonering doeleinden, onder meer geschikte restrictie-enzym plaatsen buiten de gBlock.
- Plaats de gBlock in een geschikte vector zoals eerder beschreven 16. Verscheidene retrovirale vectoren voor gBlocks zijn beschikbaar (zie Materials).
- Voor enChIP gebruik TAL eiwitten, ontwerpen TAL eiwitten herkennen van de target loci. Genereren van plasmiden die coderen TAL eiwitten met behulp van commerciële diensten. Genereer expressievectoren die de TAL eiwitten gefuseerd met één of meer tags zoals 3 x FLAG zoals eerder beschreven 15.
2. Vaststelling van Cellen voor de enChIP Analyse
- Versneld 3 × FLAG-dCas9 en de gRNA (CRISPR-gebaseerde procedure) of 3 × FLAG-TAL (TAL basis van eiwitten procedure) in de cellen worden geanalyseerd zoals eerder beschreven 14-17.
- Gebruik transiënte transfectie wanneer de transfectie efficiency hoog. Een expressievector die 3 × FLAG-dCas9 en de CMV-promotor is beschikbaar (zie Materials).
- Overwegen om stabiele transformanten met gebruikelijke werkwijzen wanneer de transiënte transfectie-efficiëntie is laag. Naast de eerder genoemde retrovirale vectoren voor gBlock, retrovirale vectoren van 3 x FLAG-dCas9 beschikbaar (zie Materialen).
- Bevestigt expressie van het gRNA van standaard RT-PCR-techniek.
- Voor kwantitatieve identificatie van eiwitten interactie met de genomische regio van belang, overweeg dan het gebruik van een stabiele isotoop labeling van aminozuren in celcultuur (SILAC) analyse gecombineerd met enChIP (enChIP-SILAC).
Opmerking: middelen voor het SILAC analyse kan worden gekocht bij commerciële leveranciers. SILAC is krachtig in het opsporen van specifieke interacties.- Cultuur cellen in SILAC zwaar medium. Bereid cellen Culturood in SILAC licht medium als een negatieve controle. Gebruik minimaal 5 x 10 7 cellen per SILAC medium (zwaar of licht). Voor een efficiënte labeling, voeg zowel L-lysine-2HCl, 13 C 6 en L-arginine-HCl, 13 C 6, 15 N 4 in de SILAC Heavy media. Opmerking: Minstens vijf celdelingen noodzakelijk label eiwitten.
- Zo cultuur menselijke fibrosarcoom HT1080 cellen die stabiel tot expressie 3xFLAG-dCas9 en gRNA bij 37 ° C en 5% CO2 in DMEM media SILAC en gedialyseerd foetaal runderserum met Lysine-2HCl plus L-Arginine-HCl (Light gemiddeld) of 13 C 6 L-lysine-2HCl plus 13 C 6 15 N 4 L-Arginine-HCl (Heavy gemiddeld) (zie Materials) 16. Voeg 50 mg lichte of zware L-Lysine en L-2HCl-Arginine-HCl in 500 ml medium.
- Trypsinize en replate cellen voordat ze confluent, zodat de cellen te behouden exponentiële growth.
- Cultuur cellen in SILAC zwaar medium. Bereid cellen Culturood in SILAC licht medium als een negatieve controle. Gebruik minimaal 5 x 10 7 cellen per SILAC medium (zwaar of licht). Voor een efficiënte labeling, voeg zowel L-lysine-2HCl, 13 C 6 en L-arginine-HCl, 13 C 6, 15 N 4 in de SILAC Heavy media. Opmerking: Minstens vijf celdelingen noodzakelijk label eiwitten.
Opmerking: Expressie van deze gemerkte eiwitten kunnen ook worden bevestigd door intracellulaire kleuring met anti-FLAG-FITC en een daaropvolgende FACS-analyse. Een protocol voor intracellulaire kleuring kan worden gedownload van onze homepage (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html).
3. verknoping van cellen met Formaldehyde
- Voor cellen in suspensie cultuur, overdracht 2 x 10 7 cellen die 3xFLAG-TAL eiwitten of 3xFLAG-dCas9 plus gRNA en schorten in 30 ml van de reguliere kweekmedium in een 50 ml centrifugebuis. Wanneer er meer cellen worden gebruikt, stijgen de volumes en hoeveelheden reagentia proportioneel. Voor SILAC experimenten, meng de cellen gekweekt in zware medium of licht middel (5 x 10 7 cellen elk) en verdeel de in totaal 1 x 10 8 cellen in 5 buisjes die 2 x 10 7 cellen.
- Voeg 810 ul van 37% formaldehyde aan 30 ml van de celsuspensie (eindconcentratie 1%) en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 min. Voor hechtende cellen rechtstreeks cellen in kweekschalen lossen door het toevoegen van 810 pi 37% formaldehyde aan 30 ml kweekmedium.
- Stop de verknoping door toevoeging van 3,1 ml van 1,25 M glycine-oplossing (eindconcentratie 127 mM), enincuberen bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
- Verzamel cellen door centrifugatie (300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C). Gooi voorzichtig de bovenstaande vloeistof, waaronder formaldehyde en bewaar het op een passende fles afval.
- Voor hechtende cellen los cellen met een cel schraper en oogst in een 50 ml buis en verzamel cellen zoals beschreven in deze stap.
- Voor SILAC experimenten, meng de losgemaakte cellen gekweekt in zwaar medium of licht middel (5 x 10 7 cellen elk), verdeel het totaal van 1 x 10 8 cellen in 5 buisjes die 2 x 10 7 cellen en verzamel cellen zoals beschreven in dit stap.
- Was de celpellet met 30 ml PBS twee keer per buis. Gooi voorzichtig de bovenstaande vloeistof, waaronder formaldehyde en bewaar het op een geschikte afval bottle.Handle de formaldehyde afval volgens chemische veiligheidsrichtlijnen. De gefixeerde cellen kunnen worden ingevroren en opgeslagen bij -80 ° C.
4. Voorbereiding van chromatine (per 2 x 107 cellen)
- Suspendeer de cellen gefixeerd in 10 ml cellysis buffer (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5% IGEPAL CA-630 en 1 x proteaseremmers) en incubeer op ijs gedurende 10 min.
- Centrifugeer het monster (830 x g bij 4 ° C gedurende 8 minuten) en de bovenstaande vloeistof voorzichtig.
- Suspendeer de pellet in 10 ml van nucleaire lysis buffer (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoxycholaat, 0,5% lauroylsarcosine en 1x proteaseremmers). Incubeer op ijs gedurende 10 min en vortex elke 2-3 min.
- Centrifugeer het monster (830 × g bij 4 ° C gedurende 8 minuten) en de bovenstaande vloeistof voorzichtig.
- Was de pellet in 10 ml PBS. De pellet (chromatine fractie) kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C onmiddellijk na invriezen in vloeibare stikstof.
5. Sonicatie van chromatine (per 2 x 10 7 cellen)
- Hang de chromatine fractie in 800 plgemodificeerde lysis buffer 3 (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,1% natriumdeoxycholaat, 0,1% SDS en 1x proteaseremmers) en overbrengen in een 1,5 ml buis.
- Ultrasone trillingen het chromatine met een sonicator (zie Materials) en de volgende voorwaarden: output: 3; duty: 100% (permanent); en tijd: gratis. Voer 10-18 cycli van sonicatie gedurende 10 seconden en koelen op ijs gedurende 20 sec. Om oververhitting te voorkomen, incubeer de monsters op ijs gedurende 2 minuten elke 5-6 cycli. Om schuimvorming te voorkomen, houdt de positie van de tip van de sonde ultrasoonapparaat 0,5 cm boven de bodem van de buis.
- Centrifugeer het monster (16.000 xg bij 4 ° C gedurende 10 min) en de supernatant over in een 1,5 ml buis. De gesoniceerd chromatine kan worden opgeslagen bij -80 ° C na onmiddellijke bevriezing in vloeibare stikstof.
6. Evaluatie van chromatine fragmentatie
- Meng 10 ul van de gefragmenteerde chromatine met 85 pl gedestilleerd water.
- Voeg 4 pivan 5 M NaCl en incubeer bij 65 ° CO / N.
- Voeg 1 pl van 10 mg / ml RNase A en incubeer bij 37 ° C gedurende 45 min.
- Voeg 2 pl 0,5 M EDTA (pH 8,0), 4 pi 1 M Tris (pH 6,8) en 1 pi 20 mg / ml Proteinase K, en incubeer bij 45 ° C gedurende 1,5 uur.
- Afzonderlijke 10 gl van het monster door elektroforese in een 1% agarose gel die kleuring kleurstoffen zoals SYBR Green bevat.
- Vlekken op de gel om de verdeling van de lengtes van de gefragmenteerde chromatine evalueren. Omstandigheden die een gemiddelde lengte van 0,5-2 kbp (bereik van 0,2-4 kbp) genereren aanbevolen.
- Zuiver DNA van de overige monsters met fenol-chloroform extractie of door een DNA-extractie kit (zie Materialen). Het gezuiverde DNA kan worden gebruikt als input DNA schatting van de opbrengsten aan enChIP analyses (zie 8,11).
7. Bereiding van Dynabeads met geconjugeerde antilichamen (per 2 x 10 7 cellen)
- Prepare twee 1,5 ml buizen, één voor pre-maaien met normale muis IgG en de andere voor incubatie met het anti-FLAG Ab. Voeg 150 ul Proteïne G geconjugeerde magnetische korrels (zie Materials) aan elke buis.
- Plaats de buizen op een magneet stand en wacht 3 min. Verwijder het supernatant door pipetteren.
- Suspendeer de kralen in 1 ml PBS met 0,01% Tween-20 (PBS-T). Plaats de buizen op een magnetische standaard en wacht 2 min. Verwijder het supernatant door pipetteren, en herhaal de stap.
- Suspendeer de kralen in 1 ml van PBS-T met 0,1% BSA.
- Voeg 15 ug normale muis IgG of anti-FLAG Ab en roteren bij 4 ° CO / N.
- Spin down kort en plaats de buizen op een magneet staan en wacht 3 min. Verwijder het supernatant door pipetteren.
- Suspendeer de kralen in 1 ml PBS-T. Omkeren het monster meerdere malen en spin down kort. Plaats de buizen op een magneet staan en wacht 3 minuten, dan is de bovenstaande vloeistof door pipetteren. Herhaal het wassentwee keer met PBS-T (totaal drie wasstappen).
8. Chromatine Immunoprecipitatie (per 2 x 10 7 cellen)
- Meng de gefragmenteerde chromatine bereid in 5,3) (ongeveer 800 ui) met een-vijfde van het volume (ongeveer 200 pl) van gemodificeerde lysisbuffer 3 met 5% Triton X-100 (eindconcentratie van 1% Triton X-100).
- Voeg de chromatine oplossing voor de buis waarin Proteïne G geconjugeerde magnetische korrels geconjugeerd met normale muis IgG werden bereid. Roteren bij 4 ° C gedurende 1 uur.
- Plaats de buis op een magneet staan en wacht 3 min.
- Breng de bovenstaande vloeistof in de buis waarin Proteïne G geconjugeerde magnetische korrels geconjugeerd met anti-FLAG Ab bereid. Draai bij 4 ° CO / N.
- Plaats de buis op een magneet staan en wacht 3 min. Verwijder het supernatant door pipetteren.
- Suspendeer de korrels in 1 ml buffer met laag zoutgehalte (20 mM Tris (pH 8,0), 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS en 1x proteaseremmers) en roteren bij 4 ° C gedurende 5 min. Plaats de buis op een magneet staan en wacht 3 min. Verwijder het supernatant door pipetteren en herhaal het wassen stap.
- Was de kralen met hoge zout buffer (20 mM Tris (pH 8,0), 2 mM EDTA, 500 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS en 1x proteaseremmers) tweemaal.
- Was de kralen met LiCl buffer (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 250 mM LiCl, 0,5% IGEPAL CA-630, 0,5% natriumdeoxycholaat en 1x proteaseremmers) tweemaal.
- Was de kralen met TBS-IGEPAL CA-630 (50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1% IGEPAL CA-630 en 1x proteaseremmers) eenmaal.
- Suspendeer de kralen in 200 ui elutiebuffer (50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1% IGEPAL CA-630, 1x proteaseremmers, en 500 ug / ml 3 x FLAG peptide) en incubeer bij 37 ° C 20 min. Plaats de buis op een magneet staan en wacht 3 min. Breng de bovenstaande in een nieuwe 1,5 ml buis en herhaal de elutkolomion stap.
- Zuiver DNA van klein gedeelte (bijvoorbeeld 5%) van het eluaat door middel van fenol-chloroform extractie of door een DNA-extractie kit (zie Materialen). Het gezuiverde DNA kan worden gebruikt voor PCR met specifieke primer sets voor het schatten van de opbrengst aan enChIP analyses door vergelijking met input-DNA bereid in Stap 6,7 zoals eerder beschreven 14,16.
9. SDS-PAGE, kleuring en massaspectrometrische analyse
- Meng het eluaat (400 pl) met 1 ml 2-propanol, 50 pl 3 M natriumacetaat (pH 5,2) en 5 ui 20 mg / ml glycogeen. Neerslaan van de chromatine bij -20 ° CO / N.
- Centrifugeer het monster (16.000 xg bij 4 ° C gedurende 30 minuten) en de bovenstaande vloeistof. Spoel het pellet met 1 ml 70% ethanol en opnieuw centrifugeren (16.000 x g bij 4 ° C gedurende 10 min). Verwijder het supernatant volledig door pipetteren.
- Suspendeer de pellet in 40 ul 2x monsterbuffer (125 mM Tris (pH 6,8), 10% 2-mercaptoethanol, 4% SDS, 10% sucrose, en 0,004% broomfenolblauw). Vortex gedurende 5 min op de korrel volledig op te lossen, en incubeer bij 100 ° C gedurende 30 min om de eiwitten te denatureren en omgekeerde verknoping.
- Voor SDS-PAGE, run 40 ul van het monster op de gel totdat de kleurstof bereikt 1 cm onder de put. Opmerking: We gebruiken meestal 4-20% gradiënt gelen, maar andere% gels worden gebruikt.
- Vlekken op de gel met Coomassie Brilliant Blue of zilver vlek.
- Snijd de gel in vijf stukken (2 mm hoogte).
- Voeren in gel spijsvertering en massaspectrometrische analyse zoals eerder 13-16 beschreven.
- Voor SILAC experimenten met 5 x 10 7 cellen elk (totaal 1 x 10 8 cellen), schorsen pellet van de eerste vijf buizen 40 ui 2x monsterbuffer (het is niet nodig op te schalen).
10. Zuivering van RNA en RNA-Seq Analysis
- Om het RNA na enChIP zuiveren, voeg 5 U / ml RNase Inhibitor (see Materials) om alle bufferoplossingen, behalve gemodificeerde lysisbuffer 3 en elutiebuffer, waaraan 40 U / ml RNase Inhibitor voegen.
- Meng het eluaat (400 pl) met 16 pl 5 M NaCl en incubeer bij 65 ° C gedurende 2 uur.
- Voeg 1 ml zuur guanidinium-fenol gebaseerde reagens (zie Materials) aan het monster. Vortex gedurende 15 seconden en vervolgens incuberen bij kamertemperatuur 5-15 min. Centrifugeer het monster gedurende 15 minuten bij 12.000 x g en kamertemperatuur.
- Breng het supernatant naar een nieuwe 1,5 ml buis en voeg 5 ul p-broomanisool. Vortex gedurende 15 seconden en vervolgens incuberen bij kamertemperatuur 3-5 min. Centrifugeer het monster gedurende 10 min bij 12.000 xg en RT.
- Breng de bovenstaande vloeistof (ongeveer 1 ml) in een nieuwe 2 ml buis en voeg 1 ml 2-propanol. Keer de buis en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Laad het mengsel op een kolom in een RNA-zuivering kit (zie Materials). Centrifugeer de kolom gedurende 1 min bij 12.000 x g en RT.
- Wassende kolom met 400 ui wasbuffer RNA in een RNA zuiveringskit (zie Materialen).
- Voeg 80 ul DNase I cocktail (mengsel van 5 gl DNase I (1 U / pl), 8 pi 10 x DNase I Reaction Buffer, 3 gl DNase / RNase-vrij water en 64 ui RNA Wash Buffer in een RNA zuiveringskit (zie Materialen)) naar de kolom. Incubeer het monster bij 37 ° C gedurende 15 minuten en centrifugeer gedurende 30 seconden bij 12.000 x g en kamertemperatuur.
- Was de kolom met 400 ul van RNA voorwas buffer in een RNA-zuivering kit (zie Materials) tweemaal.
- Elueer het RNA met 50 ui DNase / RNase-free water. De geëlueerde RNA kan worden gebruikt voor RNA-sequencing.
Representative Results
Kortom, kan 1-30% van het doel genoomgebieden worden gezuiverd met enChIP. Figuur 3 omvat representatieve data die de opbrengst van enChIP analyses richten telomeren en de promotor van de interferon (IFN) regulerende factor-1 (IRF-1) gen. Als voorbeelden van de typische resultaten, tabel 1 staan de eiwitten in verband met de IRF-1 promotor in een IFNy-specifieke wijze geïdentificeerd door enChIP-SILAC, Tabel 2 geeft de telomeer bindende eiwitten geïdentificeerd door enChIP gecombineerd met massaspectrometrie (enChIP-MS) en Tabel 3 vermeldt de RNA's geassocieerd met telomeren geïdentificeerd door enChIP-RNA-Seq.
Figuur 1. Overzicht van enChIP. enChIP met CRISPR (A, B) en TAL (C, D, E Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Volgorde van gBlock. De U6 promotor (in het zwart), de G nucleotide before de gids sequentie (in het blauw), de gids sequentie (gRNA spacer) (in het rood), het schavot volgorde (in het groen), en de terminatorsequentie (oranje) getoond.
Figuur 3. Opbrengsten van representatieve enChIP analyses. (A) Percentage ingangen voor het doel IRF-1 locus en de niet-target Sox2 locus. (B) Percentage ingangen voor het doel telomeren en non-target γ-satellieten. De cijfers zijn aangepast en gewijzigd ten opzichte van eerdere publicaties 15,16.
| Categorieën | Eiwitten |
| Transcriptie | DDX1, PARP1, CKAP4, Pescadillo homoloog, PURβ, geactiveerde RNA polymerase II transcriptie-activator p15, BTF3, Myb bindendeiwit 1A |
| Histondeacetylering, corepressor componenten | RBBP4, PA2G4, TBL3 |
| Acetyltransferase | Protein arginine N-methyltransferase 1 |
| DNA topoisomerase | DNA topoisomerase 2α |
| Histonen | Histon H2A.Z, histon H3.2 |
Tabel 1:. Voorbeelden van eiwitten geassocieerd met het humane IRF-1 promotorgebied in een IFNy-specifieke wijze geïdentificeerd door enChIP-SILAC is de tabel aangepast van een voorgaande publicatie 16.
| Categorieën | Eiwitten |
| Zoogdieren telomeren bindende eiwitten | PML, RPA, CDK1, PARP1, PCBP1 |
| Telomeer-binding eiwitten in gist of andere organismen | IMAP4 |
| Eiwitten interactie met telomeren bindend eiwitten [geassocieerd-telomeer bindend eiwit] | DNA polymerase α (POLA1) [Cdc13p], ARMC6 [TRF2], CTBP1 [FoxP2-POT1] exportin-5 [TERT] GNL3L [TRF1], exportin-1 [TERT], 14-3-3 [TERT] |
| Eiwitten te lokaliseren heterochromatine | BEND3 |
| Eiwitten die epigenetische merken | KDM5C |
| Eiwitten waarvan mutaties invloed telomeer functie | DNA polymerase α (POLA1), hat1, Nup133, Cdk7, DPOE1, PRDX1, TYSY, glutamaat-cysteïne ligase, glutaredoxin, SMRC1 |
Tabel 2:. Voorbeelden van eiwitten in verband met de muis telomeren geïdentificeerd door enChIP-MS De tafel heeft adapte geweestd uit een eerdere publicatie 15.
| Categorieën | RNA's |
| Telomerase componenten | TERC, Rmrp |
| Telomerische RNA's | Terras |
| scaRNAs | Scarna6, Scarna10, Scarna13, Scarna2 |
| H / ACA snoRNAs | Snora23, Snora74a, Snora73b, Snora73a |
| C / D snoRNAs | Snord17, Snord15a, Snord118 |
| lncRNA | Neat1 |
Tabel 3: Voorbeelden van RNA geassocieerd met muis telomeren geïdentificeerd door enChIP-RNA-Seq tabel werd aangepast van een voorgaande publicatie 17..
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Takeda Science Foundation (TF); de Asahi Glass Foundation; de Uehara Memorial Foundation (HF); de Kurata Memorial Hitachi Science and Technology Foundation (TF en HF); Grant-in-Aid for Young Scientists (B) (# 25.830.131), Grant-in-Steun voor Wetenschappelijk Onderzoek (C) (# 15K06895) (TF); en een Grant-in-Steun voor Wetenschappelijk Onderzoek inzake innovatieve Areas 'transcriptie Cycle' (# 25.118.512 & # 15H01354), Grant-in-Steun voor Wetenschappelijk Onderzoek (B) (# 15H04329), Grant-in-Steun voor Verkennend onderzoek ( # 26650059) en 'Genome Support' (# 221S0002) (HF) van het Ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie van Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gBlock synthesis service | Life Technologies | Gene Synthesis by GeneArt | |
| gBlock synthesis service | IDT (Integrated DNA Technologies) | gBlocks Gene Fragments | |
| pSIR-neo | Addgene | 51128 | |
| pSIR-GFP | Addgene | 51134 | |
| pSIR-DsRed-Express2 | Addgene | 51135 | |
| pSIR-hCD2 | Addgene | 51143 | |
| TAL synthesis service | Life Technologies | GeneArt Precision TALs | |
| 3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1 | Addgene | 47948 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-puro | Addgene | 51240 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-IG | Addgene | 51258 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-I2 | Addgene | 51259 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-neo | Addgene | 51260 | |
| anti-FLAG M2 Ab | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| FITC-conjugated anti-FLAG M2 | Sigma-Aldrich | F4049 | |
| DMEM medium for SILAC | Life Technologies | 89985 | Other medium can be purchased from Life Technologies |
| Dialyzed FBS for SILAC | Life Technologies | 89986 | |
| L-Lysine-2HCl for SILAC | Life Technologies | 89987 | For Light medium |
| L-Arginine-HCl for SILAC | Life Technologies | 89989 | For Light medium |
| L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC | Life Technologies | 89988 | For Heavy medium |
| L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC | Life Technologies | 89990 | For Heavy medium |
| Complete, mini, EDTA-free | Roche Diagnostics | 4693159 | |
| Ultrasonic Disruptor UD-201 | Tomy Seiko | ||
| ChIP DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D5205 | |
| Dynabeads-Protein G | Life Technologies | DB10004 | |
| RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2611 | |
| Isogen II | Nippon Gene | 311-07361 | |
| Direct-zol RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2050 | |
| LTQ Orbitrap Velos | Thermo Fisher Scientific | A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis | |
| nanoLC | Advance, Michrom Bioresources | A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis | |
| HTC-PAL autosampler | CTC Analytics | A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis |
References
- Zhang, X. Y., Horz, W. Analysis of highly purified satellite DNA containing chromatin from the mouse. Nucleic Acids Res. 10, 1481-1494 (1982).
- Workman, J. L., Langmore, J. P. Nucleoprotein hybridization: a method for isolating specific genes as high molecular weight chromatin. Biochemstry. 24, 7486-7497 (1985).
- Boffa, L. C., Carpaneto, E. M., Allfrey, V. G. Isolation of active genes containing CAG repeats by DNA strand invasion by a peptide nucleic acid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 1901-1905 (1995).
- Jaskinskas, A., Hamkalo, B. A. Purification and initial characterization of primate satellite chromatin. Chromosome Res. 7, 341-354 (1999).
- Griesenbeck, J., Boeger, H., Strattan, J. S., Kornberg, R. D. Affinity purification of specific chromatin segments from chromosomal loci in yeast. Mol. Cell Biol. 23, 9275-9282 (2003).
- Ghirlando, R., Felsenfeld, G. Hydrodynamic studies on defined heterochromatin fragments support a 30-µm fiber having six nucleosomes per turn. J. Mol. Biol. 376, 1417-1425 (2008).
- Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
- Hoshino, A., Fujii, H. Insertional chromatin immunoprecipitation: a method for isolating specific genomic regions. J. Biosci. Bioeng. 108, 446-449 (2009).
- Fujita, T., Fujii, H. Direct idenification of insulator components by insertional chromatin immunoprecipitation. PLoS One. 6, e26109 (2011).
- Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions by insertional chromatin immunoprecipitation (iChIP) with a second-generation tagged LexA DNA-binding domain. Adv. Biosci. Biotechnol. 3, 626-629 (2012).
- Fujita, T., Fujii, H. Locus-specific biochemical epigenetics / chromatin biochemistry by insertional chromatin immunoprecipitation. ISRN Biochem. 2013, 913273 (2013).
- Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions retaining molecular interactions by the iChIP system using recombinant exogenous DNA-binding proteins. BMC Mol. Biol. 15, 26 (2014).
- Fujita, T., Kitaura, F., Fujii, H. A critical role of the Thy28-MYH9 axis in B cell-specific expression of the Pax5 gene in chicken B cells. PLoS One. 10, (2015).
- Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated proteins by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Biochem. Biophys. Res. Commun. 439, 132-136 (2013).
- Fujita, T., et al. Identification of telomere-associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP). Sci. Rep. 3, 3171 (2013).
- Fujita, T., Fujii, H. Identification of proteins associated with an IFNγ-responsive promoter by a retroviral expression system for enChIP using CRISPR. PLoS One. 9, e103084 (2014).
- Fujita, T., Yuno, M., Okuzaki, D., Ohki, R., Fujii, H. Identification of non-coding RNAs associated with telomeres using a combination of enChIP and RNA sequencing. PLoS One. 10, e0123387 (2015).
- Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. , (2014).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Esvelt, K. M., et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nat. Methods. 10, 1116-1121 (2013).
- Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152, 1173-1183 (2013).
- Wu, X., et al. Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 32, 670-676 (2014).
- Kuscu, C., Arslan, S., Singh, R., Thorpe, J., Adli, M. Genome-wide analysis reveals characteristics of off-target sites bound by the Cas9 endonuclease. Nat Biotechnol. 32, 677-683 (2014).
- Cencic, R., et al. Protospacer adjacent motif (PAM)-distal sequences engage CRISPR Cas9 DNA target cleavage. PLoS One. 9, 109213 (2014).
- O'Green, H., Henry, I. M., Bhakta, M. S., Meckler, J. F., Segal, D. J. A genome-wide analysis of Cas9 binding specificity using ChIP-seq and targeted sequence capture. Nucleic Acids Res. 43, 3389-3404 (2015).
- de Lange, T. Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres. Genes Dev. 19, 2100-2110 (2005).
