Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

enChIPによって特定のゲノム領域と関連する分子の同定の単離

Published: January 20, 2016 doi: 10.3791/53478
Automatic Translation
1, 1
1Chromatin Biochemistry Research Group, Combined Program on Microbiology and Immunology, Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University

Introduction

興味のある特定のゲノム領域に関連する分子の同定は、このような転写およびエピジェネティック制御などのゲノム機能の調節のメカニズムを理解するために必要です。いくつかの技術は、特定のゲノム領域1-7の生化学的分析のために開発されてきたが、それらは、ため、このような制限されたアプリケーション（例えば、唯一の反復を有する高コピー数の遺伝子座または遺伝子座など）と、それらの本質的な問題のため、この段階では広く使用されていませんあまりにも多くの時間と努力が必要です。

簡単に特定のゲノム領域の生化学的解析を実行するために、我々は2遺伝子座特異的クロマチン免疫沈降（チップ）技術、すなわち挿入チップ（iChIP）8-13と設計のDNA結合分子によって媒介されるチップ（enChIP）14-17を開発しました 。 iChIPでは、関心対象の遺伝子座は、レックスのような外因性のDNA結合タンパク質の認識配列を挿入することによってタグ付けされA.軌跡は、その後、タグ付けされたDNA結合タンパク質を用いたアフィニティー精製によって単離します。 enChIPでは、このようなジンクフィンガータンパク質、転写活性化因子のような（TAL）タンパク質などのDNA結合分子を、設計、およびクラスタ化された定期的interspaced短い回文繰り返し（CRISPR）錯体は、（ 図1）は、対象の座をタグ付けするために使用されています。続いて、ゲノム領域は、タグ付けされたDNA結合分子の親和性精製によって単離されます。

iChIP enChIP上の利点の一つは、外来性DNA結合タンパク質の認識配列の挿入が必要ないことです。 Cas9の触媒的に不活性な形（dCas9）からなるCRISPR錯体とガイドRNA（gRNA）を使用して遺伝子座の標的化TAL、亜鉛フィンガータンパク質を使用してiChIPまたはenChIPにより、これらの領域の標的よりもはるかに簡単です。ここでは、遺伝子座アソシアを識別するために、（RNA-SEQ）質量分析およびRNAの配列決定と組み合わせenChIPのためのステップバイステップのプロトコルを記述テッドタンパク質およびRNAを、それぞれ。

Protocol

ターゲット軌跡を認識エンジニアDNA結合分子の1デザイン

  1. CRISPR複合体を使用してenChIPについては、以前に18として記述関心のゲノム領域における候補gRNA標的配列を同定するためにCRISPRdirect Webツール（http://crispr.dbcls.jp）を使用します。このWebツールは、対象領域内に'形式5'-N 20 NGG-3の23 bpのゲノムのサイトを返します。
  2. U6プロモーター配列及び5'-N 20の配列商用サービスを使用して、5'-N 20 NGG-3 'を含むgBlock合成19,20（ 図2参照）。目的をサブクローニングするために、gBlockの外に適切な制限酵素部位を含みます。
  3. 以前に16を説明したように適当なベクターにgBlockを挿入します。 gBlocksためのいくつかのレトロウイルスベクターは、（材料を参照）があります。
  4. TALタンパク質を使用してenChIPため、TARGを認識TALタンパク質を設計ら座。商用サービスを使用してTALタンパク質をコードするプラスミドを生成します。先に記載15のような3×FLAGのような1つ以上のタグと融合したTALタンパク質を含む発現ベクターを生成します。

enChIP解析のための細胞の樹立2。

  1. 以前に14〜17のように分析する細胞に3×FLAG-dCas9とgRNA（CRISPRベースの手順）または3×FLAG-TAL（TALのタンパク質ベースの手順）を発現します。
    1. トランスフェクション効率が高い場合、一過性トランスフェクションを使用してください。 3×FLAG-dCas9とCMVプロモーターを含む発現ベクターは、（材料を参照）が利用可能です。
    2. 一過性のトランスフェクション効率が低い場合、従来の方法を使用して安定した形質転換体を確立考えます。 gBlockする上述のレトロウイルスベクターに加えて、3×FLAG-dCas9のレトロウイルスベクターは、（材料を参照）があります。
    2. 14〜17記載の抗FLAG抗体（AB）を用いたイムノブロット分析により、トランスフェクトされた細胞で3xFLAG-dCas9または3xFLAG-TALタンパク質の発現を確認してください。
    注：これらのタグ化タンパク質の発現は、抗FLAG-FITCおよびその後のFACS分析と細胞内染色によって確認することができます。細胞内染色のためのプロトコルは、弊社ホームページ（http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html）からダウンロードすることができます。
  2. 標準的RT-PCR法によりgRNAの発現を確認してください。
  3. 興味のあるゲノム領域と相互作用するタンパク質を定量的に同定するために、enChIP（enChIP-SILAC）と組み合わせた細胞培養（SILAC）分析におけるアミノ酸による安定同位体標識の使用を検討してください。
    注：SILAC分析のためのメディアは、市販業者から購入することができます。 SILACは、特異的な相互作用を検出するのに強力です。
    1. SILAC重い培地で細胞を培養します。細胞を準備cultu陰性対照としてSILAC光媒体中の赤。 （重鎖または軽）各SILAC媒体の少なくとも5×10 7個の細胞を使用してください。効率的な標識のために、両方のL-リジン2HCl、13 C 6およびL-アルギニン塩酸、SILAC重い培地で13 C 6、15 N 4を追加します 。注：少なくとも5の細胞分裂は、タンパク質を標識するために必要です。
      1. 例えば、培養ヒト線維肉腫HT1080細胞を安定的に37℃で3xFLAG-dCas9とgRNAを表現し、SILACのためのDMEM培地中で5％のCO 2およびリジン- 2HClプラスL-アルギニン塩酸（ライト中）とウシ胎児血清を透析または13 C 6 L-リジン-2HClプラス13 C 6〜15 N 4 L-アルギニン塩酸（ヘビーミディアム）16（材料を参照してください ）。培地500mlに光や重いL-リジン-2HClおよびL-アルギニン塩酸50mgを追加します。
      2. 細胞が指数growtを維持するようにトリプシン処理およびreplate細胞は、それらがコンフルエントになる前にH。

ホルムアルデヒドで細胞を3架橋

  1. 懸濁培養細胞の場合、転送2×10 7 3xFLAG-TALタンパク質を発現する細胞または3xFLAG-dCas9プラスgRNA、50mlの遠心管中で、通常の培養液30mlに懸濁します。より多くの細胞が使用される場合、比例的な試薬の容積及び量を増加させます。 SILAC実験のために、重い媒体や光培地で培養した細胞（5×10 7細胞ずつ）混合し、2×10 7個の細胞を含む5チューブに1×10 8個の細胞の合計を分割します。
  2. 細胞懸濁液（最終濃度1％）の30 mlの37％ホルムアルデヒドの810マイクロリットルを加え、5分間37℃でインキュベートします。接着細胞については、直接培養培地の30 mlの37％ホルムアルデヒドの810マイクロリットルを添加することにより、培養皿で細胞を固定します。
  3. 1.25 Mグリシン溶液（最終濃度127 mM）の3.1mlのを追加することにより、架橋を停止し、室温で10分間インキュベートします。
  4. 遠心分離（4℃で5分間、300×g）と細胞を収集します。慎重にホルムアルデヒドを含む上清を破棄し、適切な廃棄ボトルに保管します。
    1. 接着細胞の場合は、50mlチューブ中の細胞スクレーパーと収穫して細胞を剥離し、この手順で説明したように細胞を収集します。
    2. SILAC実験のために、重い媒体や光培地で培養し分離した細胞（5×10 7細胞ずつ）混ぜ、2×10 7個の細胞を含む5チューブに1×10 8個の細胞の合計を分割し、これに記載されているように細胞を採取ステップ。
  5. チューブあたり二回のPBS 30mlで細胞ペレットを洗浄します。慎重にホルムアルデヒドを含む上清を破棄し、化学物質の安全性ガイドラインに従ってホルムアルデヒド廃棄物bottle.Handle適切な廃棄物に保管してください。固定した細胞を凍結し、-80℃で保存することができます。

クロマチンの4準備（あたり2×107細胞 ）

  1. 細胞溶解緩衝液（10mMトリス（pH8.0）、1mMのEDTA、0.5％IGEPAL CA-630、および1×プロテアーゼ阻害剤）の10 mlの固定細胞を懸濁し、氷上で10分間インキュベートします。
  2. 遠心分離サンプル（8分間、4℃で830×gで）、慎重に上清を捨てます。
  3. 核溶解緩衝液（10mMトリス（pH8.0）、1mMのEDTA、0.5 MのNaCl、1％トリトンX-100、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、0.5％ラウロイルサルコシン、および1×プロテアーゼ阻害剤）10mlにペレットを懸濁します。 10分間氷上でインキュベートし、2〜3分ごとにボルテックス。
  4. 遠心分離サンプル（830× 8分間4℃でグラム）と慎重に上清を捨てます。
  5. 10mlのPBSでペレットを洗浄します。ペレット（クロマチンの画分）を液体窒素中で即時凍結した後、-80℃で保存することができます。

クロマチン5.超音波処理（2×10 7個の細胞あたり）

  1. 800μlの中でクロマチン画分を一時停止修正された溶解緩衝液3（10mMトリス（pH8.0）、1mMのEDTA、150mMのNaCl、0.1％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％SDS、及び1×プロテアーゼ阻害剤）、及び1.5 mlチューブに移します。
  2. 出力：超音波処理装置を用いて、クロマチン（材料を参照）、以下の条件超音波処理3。デューティ：100％（連続）。時刻：無料。 10秒間の超音波処理の10-18サイクルを実行し、20秒間、氷上で冷却します。過度の加熱を避けるために、2分ごとに5~6サイクルの間、氷上でサンプルをインキュベートします。発泡回避するために、0.5センチメートルチューブの底上記超音波処理プローブの先端の位置をキープ。
  3. 遠心分離（4℃で10分間16,000×g）でサンプルを1.5 mlチューブに上清を移します。超音波処理し、クロマチンを液体窒素中で即座に凍結した後、-80℃で保存することができます。

クロマチン断片化の6評価

  1. 蒸留水85μlの断片化クロマチンの10μLを混合します。
  2. 4μLを追加5 MのNaClと65°のCO / Nでインキュベートします。
  3. 10mg / mlのRNase Aの1μl添加し、45分間37℃でインキュベートします。
  4. 、0.5 M EDTA（pH8.0）を2μl加え、1Mトリス（pHは6.8）の4μL、および20 mg / mlのプロテ​​イナーゼKを1μl、その後、1.5時間45℃でインキュベートします。
  5. 例えば、SYBRグリーンなどの染料を染色含まない1％アガロースゲルで電気泳動による試料の別々の10μlの。
  6. 断片化クロマチンの長さの分布を評価するために、ゲルを染色。 0.5〜2 kbpの（0.2-4 kbpの範囲）の平均長を生成する条件が推奨されています。
  7. フェノール-クロロホルム抽出により、またはDNA抽出キット（材料を参照）を使用して、残りの試料からDNAを精製します。精製されたDNAは、（8.11を参照）enChIP分析の収率を推定するために、入力DNAとして使用することができます。

抗体によるダイナビーズ共役の7.製造（2×10 7個の細胞あたり）

  1. 前抗FLAG抗体とのインキュベーションのために正常マウスIgGおよび他を使用して、2つの1.5ミリリットルチューブ、事前クリアのための1つを削減します。各チューブに（材料を参照）プロテインG結合磁性ビーズ150μlのを追加します。
  2. マグネットスタンドにチューブを置き、3分間待ちます。ピペットで上清を捨てます。
  3. 0.01％のTween-20（PBS-T）を含む1mlのPBS中のビーズを一時停止します。磁気スタンドにチューブを置き、2分間待ちます。ピペットで上清を捨て、ステップを繰り返します。
  4. 0.1％BSAを含むPBS-T 1ml中のビーズを一時停止します。
  5. 正常マウスIgGまたは抗FLAG抗体15μgのを追加し、4°CO / Nで回転します。
  6. その後、簡単にスピンダウンマグネットスタンドにチューブを置き、3分間待ちます。ピペットで上清を捨てます。
  7. PBS-T 1ml中のビーズを一時停止します。サンプル数回転倒し、簡単にスピンダウン。その後、ピペットで上清を捨て、マグネットスタンドにチューブを置き、3分間待ちます。洗濯を繰り返してPBS-T（3回の洗浄工程の合計）でさらに2回。

8.クロマチン免疫沈降（2×10 7個の細胞あたり）

  1. ボリュームの五分の一の5％トリトンX-100（1％トリトンX-100の最終濃度）を含む改変溶解バッファー3の（約200μL）と5.3で製造した断片化クロマチン）（約800μl）を混ぜます。
  2. 正常マウスIgGと結合させ、プロテインG結合磁性ビーズを準備されたチューブにクロマチン溶液を加えます。 1時間4℃で回転させます。
  3. マグネットスタンドにチューブを置き、3分間待ちます。
  4. 抗FLAG抗体とコンジュゲートプロテインG結合磁性ビーズを準備されたチューブに上清を移します。 4°CO / Nで回転します。
  5. マグネットスタンドにチューブを置き、3分間待ちます。ピペットで上清を捨てます。
  6. 低塩緩衝液（20mMトリス（pH8.0）を1mlのビーズをサスペンド、2mMのEDTA、150mMのNaCl、1％トリトンX-100、0.1％SDS、及び1×プロテアーゼ阻害剤）、5分間、4℃で回転します。マグネットスタンドにチューブを置き、3分間待ちます。ピペットで上清を捨て、洗浄ステップを繰り返します。
  7. 二倍の高塩緩衝液（20 mMトリス（pHは8.0）、2mMのEDTA、500mMのNaCl、1％トリトンX-100、0.1％SDS、及び1×プロテアーゼ阻害剤）でビーズを洗浄します。
  8. 二回（10mMトリス（pH8.0）、1mMのEDTA、250mMの塩化リチウム、0.5％IGEPAL CA-630、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、および1×プロテアーゼ阻害剤）のLiCl緩衝液でビーズを洗浄します。
  9. 一度（50 mMトリス（pHは7.5）、150mMのNaCl、0.1％IGEPAL CA-630、および1×プロテアーゼ阻害剤）TBS-IGEPAL CA-630でビーズを洗浄します。
  10. 溶出緩衝液200μl（50 mMトリス（pHは7.5）、150mMのNaCl、0.1％IGEPAL CA-630、1×プロテアーゼ阻害剤、および500 / mlの3×FLAGペプチド）中のビーズをサスペンドし、37℃でインキュベート20分。マグネットスタンドにチューブを置き、3分間待ちます。新しい1.5 mlチューブに上清を移し、ELUTを繰り返しますイオンステップ。
  11. フェノール-クロロホルム抽出により、またはDNA抽出キット（材料を参照）を用いて溶出液の小部分（例えば、5％）からのDNAを精製します。精製されたDNAは、enChIPの収率を推定するために、特定のプライマーセットでPCRに使用することができ、入力DNA 14,16以前説明したように、ステップ6.7で調製と比較することにより分析します。

9. SDS-PAGE、染色、および質量分析

  1. 2-プロパノール、1mlの3M酢酸ナトリウム（pHは5.2）、および20 mg / mlのグリコーゲンの5μlと50μlの溶出液（400μl）を混ぜます。 -20°のCO / Nでクロマチンを沈殿させます。
  2. 遠心サンプル（4℃で30分間16,000×g）で、上清を捨てます。再び70％エタノールおよび遠心分離機の1ミリリットル（4℃で10分間16,000×g）でペレットを洗浄します。ピペットで完全に上清を捨てます。
  3. 2Xサンプルバッファー（125 mMトリス（pHは6.8）40μlの、10％の2-傭兵でペレットを中断aptoethanol、4％SDS、10％スクロース、および0.004％ブロモフェノールブルー）。完全にペレットを溶解するために5分間ボルテックスし、次いで、タンパク質を変性させ、架橋を逆に30分間、100℃でインキュベートします。
  4. 色素はよく以下1cmに達するまで、SDS-PAGE、ゲル上でサンプルを40μlを実行します。注：は、通常、4-20％勾配ゲルを使用し、それ以外％ゲルを使用することができます。
  5. クマシーブリリアントブルーまたは銀染色でゲルを染色します。
  6. 5個（2ミリメートルの高さ）にゲルをカットします。
  7. 先に説明したようにゲル13-16消化および質量分析で行います。
  8. 5×10 7細胞それぞれ（1×10 8細胞の合計）とSILAC実験のために、2倍の試料緩衝液40μlの中で最初の5チューブ（それがスケールアップする必要はありません）からのペレットを一時停止します。

RNAおよびRNA-のSeq解析の10精製

  1. enChIP後、RNAを精製するために、RNA分解酵素阻害剤の5 U / mlのを追加（SE緩衝液のすべてに電子材料）は、修正された溶解バッファー3と溶出バッファーを除いたRNアーゼ阻害剤の40 U / mlのを追加します。
  2. 5 M NaClを16μlの溶出液（400μl）を混合し、2時間65℃でインキュベートします。
  3. サンプルに（材料を参照）は、酸グアニジニウム - フェノール系試薬の1ミリリットルを追加します。 15秒間ボルテックスした後、5〜15分間室温でインキュベートします。 12,000×gで、室温で15分間サンプルを遠心します。
  4. 新しい1.5 mlチューブに上清を移し、P-ブロモアニソールの5μlを添加します。 15秒間ボルテックスした後、3〜5分間室温でインキュベートします。 12,000×gで、室温で10分間サンプルを遠心します。
  5. 新しい2 mlチューブに上清（約1ml）を転送し、2-プロパノールの1ミリリットルを追加します。チューブを反転し、室温で10分間インキュベートします。 （材料を参照）、RNA精製キットでカラムに混合物をロードします。 12,000×で1分間カラムを遠心 GおよびRT。
  6. ウォッシュRNA精製キット中のRNA洗浄緩衝液400μlの有するカラム（材料を参照してください）​​。
  7. DNアーゼIカクテルの80μlのDNアーゼの5μlに（混合物I（1 U /μl）を、10×DNアーゼI反応バッファー8μlの、3 DNアーゼ/​​μlのRNaseフリー水、および中のRNA洗浄バッファー64μLを追加カラムへのRNA精製キット（材料）を参照）。 15分間37℃でサンプルをインキュベートした後、12,000×gで、室温で30秒間遠心します。
  8. 二回のRNA精製キット中のRNA予洗バッファー400μlの（材料を参照）でカラムを洗浄します。
  9. DNアーゼ/​​ RNaseフリー水50μlのRNAを溶出。溶出したRNAは、RNAの配列決定のために使用することができます。

Representative Results

全体的に、対象のゲノム領域1〜30％がenChIPを用いて精製することができる。 図3は、enChIPの収量を示す代表的なデータを含んでテロメアとインターフェロン（IFN）調節因子-1（IRF-1）遺伝子のプロモーターを標的と分析しています。典型的な結果としては、例えば、 表1 enChIP-SILACで識別されるIFNγ特異的にIRF-1プロモーターに関連するタンパク質、 表2質量分析（enChIP-MS）と組み合わせenChIPで識別テロメア結合タンパク質として、 、および表3 enChIP-RNA-、配列番号で識別されるテロメアに関連付けられたRNA。

図1
enChIPの1. 概要図 。 CRISPR（A、B）とTAL（C、D、Eを用い enChIP この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
gBlockの図2のシーケンス。U6プロモーター（黒）、GヌクレオチドBガイド配列（青）、（赤）ガイド配列（gRNAスペーサー）、（緑色）足場配列、および（オレンジ色）ターミネーター配列EFORE示されています。

図3
代表enChIP 3.収量を分析図 。 （A）対象IRF-1遺伝子座および非標的Sox2の遺伝子座のためのパーセントを入力。ターゲットテロメアと非標的γ-衛星の（B）の割合を入力。数値は適応し、前の出版物15,16から変更されています。

カテゴリー タンパク質
転写 DDX1、PARP1、CKAP4、Pescadilloホモログ、PURβ、
活性化されたRNAポリメラーゼII転写活性化P15、
BTF3、のMyb結合タンパク質1A
ヒストン脱アセチル化、
コリプレッサーコンポーネント		 RBBP4、PA2G4、TBL3
アセチルトランスフェラーゼタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ1のN
DNAトポイソメラーゼ DNAトポイソメラーゼ2α
ヒストンヒストンH2A.Z、ヒストンH3.2

表1：enChIP-SILAC で識別されるIFNγ特異的に人間のIRF-1プロモーター領域に関連するタンパク質の例の表は、以前の出版物16から適応されています。

カテゴリー タンパク質
哺乳類テロメア結合タンパク質 PML、RPA、CDK1、PARP1、PCBP1
テロメア-BI酵母におけるndingタンパク質
または他の生物		 IMP4
テロメア結合と相互作用するタンパク質
タンパク質【関連テロメア結合タンパク質] 		DNAポリメラーゼα（POLA1）[Cdc13p]、
ARMC6【TRF2]、CTBP1 [FOXP2-POT1]、
エクス-5 [TERT]、GNL3L [TRF1]、
エクス-1 [TERT]、14-3-3 [TERT]
ヘテロクロマチンに局在化するタンパク質 BEND3
エピジェネティックなマークを調節するタンパク質 KDM5C
その変異テロメア機能に影響を及ぼすタンパク質 DNAポリメラーゼα（POLA1）、HAT1、Nup133、
CDK7、DPOE1、PRDX1、TYSY、
グルタミン酸システインリガーゼ、グルタレドキシン、SMRC1

表2：enChIP-MS により同定したマウステロメアに関連するタンパク質の例には、表は、adapteされています以前の出版物15からD。

カテゴリー RNAを
テロメラーゼコンポーネント TERC、Rmrp
テロメアのRNA TERRAs
scaRNAs Scarna6、Scarna10、Scarna13、Scarna2
H / ACAのsnoRNA Snora23、Snora74a、Snora73b、Snora73a
C / DのsnoRNA Snord17、Snord15a、Snord118
lncRNA Neat1

表3：enChIP-RNA-、 配列番号で識別されるマウスのテロメアと関連するRNAの例の表は、以前の出版物17から適応されています。

Acknowledgments

この作品は、武田科学財団（TF）によってサポートされていました。旭硝子財団。上原記念財団（HF）。倉田記念日立科学技術財団（TFとHF）。費補助金若手（B）（＃25830131）、費補助金基盤研究（C）（＃15K06895）（TF）のため、そして費補助金革新的なエリア「転写サイクル」に関する科学研究費（＃25118512＆＃15H01354）、費補助金基盤研究（B）（＃15H04329）のため、萌芽研究（ ＃26650059）、日本の文部科学省、文化、スポーツ、科学技術から「ゲノム支援」（＃221S0002）（HF）。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
gBlock synthesis service Life Technologies Gene Synthesis by GeneArt
gBlock synthesis service IDT (Integrated DNA Technologies) gBlocks Gene Fragments
pSIR-neo Addgene 51128
pSIR-GFP Addgene 51134
pSIR-DsRed-Express2 Addgene 51135
pSIR-hCD2 Addgene 51143
TAL synthesis service Life Technologies GeneArt Precision TALs
3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1 Addgene 47948
3×FLAG-dCas9/pMXs-puro Addgene 51240
3×FLAG-dCas9/pMXs-IG Addgene 51258
3×FLAG-dCas9/pMXs-I2 Addgene 51259
3×FLAG-dCas9/pMXs-neo Addgene 51260
anti-FLAG M2 Ab Sigma-Aldrich F1804
FITC-conjugated anti-FLAG M2 Sigma-Aldrich F4049
DMEM medium for SILAC Life Technologies 89985 Other medium can be purchased from Life Technologies
Dialyzed FBS for SILAC Life Technologies 89986
L-Lysine-2HCl for SILAC Life Technologies 89987 For Light medium
L-Arginine-HCl for SILAC Life Technologies 89989 For Light medium
L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC Life Technologies 89988 For Heavy medium
L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC Life Technologies 89990 For Heavy medium
Complete, mini, EDTA-free Roche Diagnostics 4693159
Ultrasonic Disruptor UD-201 Tomy Seiko
ChIP DNA Clean & Concentrator Zymo Research D5205
Dynabeads-Protein G Life Technologies DB10004
RNasin Plus RNase Inhibitor Promega N2611
Isogen II Nippon Gene 311-07361
Direct-zol RNA Miniprep kit Zymo Research R2050
LTQ Orbitrap Velos Thermo Fisher Scientific A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis
nanoLC Advance, Michrom Bioresources A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis
HTC-PAL autosampler CTC Analytics A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, X. Y., Horz, W. Analysis of highly purified satellite DNA containing chromatin from the mouse. Nucleic Acids Res. 10, 1481-1494 (1982).
  2. Workman, J. L., Langmore, J. P. Nucleoprotein hybridization: a method for isolating specific genes as high molecular weight chromatin. Biochemstry. 24, 7486-7497 (1985).
  3. Boffa, L. C., Carpaneto, E. M., Allfrey, V. G. Isolation of active genes containing CAG repeats by DNA strand invasion by a peptide nucleic acid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 1901-1905 (1995).
  4. Jaskinskas, A., Hamkalo, B. A. Purification and initial characterization of primate satellite chromatin. Chromosome Res. 7, 341-354 (1999).
  5. Griesenbeck, J., Boeger, H., Strattan, J. S., Kornberg, R. D. Affinity purification of specific chromatin segments from chromosomal loci in yeast. Mol. Cell Biol. 23, 9275-9282 (2003).
  6. Ghirlando, R., Felsenfeld, G. Hydrodynamic studies on defined heterochromatin fragments support a 30-µm fiber having six nucleosomes per turn. J. Mol. Biol. 376, 1417-1425 (2008).
  7. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
  8. Hoshino, A., Fujii, H. Insertional chromatin immunoprecipitation: a method for isolating specific genomic regions. J. Biosci. Bioeng. 108, 446-449 (2009).
  9. Fujita, T., Fujii, H. Direct idenification of insulator components by insertional chromatin immunoprecipitation. PLoS One. 6, e26109 (2011).
  10. Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions by insertional chromatin immunoprecipitation (iChIP) with a second-generation tagged LexA DNA-binding domain. Adv. Biosci. Biotechnol. 3, 626-629 (2012).
  11. Fujita, T., Fujii, H. Locus-specific biochemical epigenetics / chromatin biochemistry by insertional chromatin immunoprecipitation. ISRN Biochem. 2013, 913273 (2013).
  12. Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions retaining molecular interactions by the iChIP system using recombinant exogenous DNA-binding proteins. BMC Mol. Biol. 15, 26 (2014).
  13. Fujita, T., Kitaura, F., Fujii, H. A critical role of the Thy28-MYH9 axis in B cell-specific expression of the Pax5 gene in chicken B cells. PLoS One. 10, (2015).
  14. Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated proteins by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Biochem. Biophys. Res. Commun. 439, 132-136 (2013).
  15. Fujita, T., et al. Identification of telomere-associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP). Sci. Rep. 3, 3171 (2013).
  16. Fujita, T., Fujii, H. Identification of proteins associated with an IFNγ-responsive promoter by a retroviral expression system for enChIP using CRISPR. PLoS One. 9, e103084 (2014).
  17. Fujita, T., Yuno, M., Okuzaki, D., Ohki, R., Fujii, H. Identification of non-coding RNAs associated with telomeres using a combination of enChIP and RNA sequencing. PLoS One. 10, e0123387 (2015).
  18. Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. , (2014).
  19. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
  20. Esvelt, K. M., et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nat. Methods. 10, 1116-1121 (2013).
  21. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152, 1173-1183 (2013).
  22. Wu, X., et al. Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 32, 670-676 (2014).
  23. Kuscu, C., Arslan, S., Singh, R., Thorpe, J., Adli, M. Genome-wide analysis reveals characteristics of off-target sites bound by the Cas9 endonuclease. Nat Biotechnol. 32, 677-683 (2014).
  24. Cencic, R., et al. Protospacer adjacent motif (PAM)-distal sequences engage CRISPR Cas9 DNA target cleavage. PLoS One. 9, 109213 (2014).
  25. O'Green, H., Henry, I. M., Bhakta, M. S., Meckler, J. F., Segal, D. J. A genome-wide analysis of Cas9 binding specificity using ChIP-seq and targeted sequence capture. Nucleic Acids Res. 43, 3389-3404 (2015).
  26. de Lange, T. Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres. Genes Dev. 19, 2100-2110 (2005).

Tags

分子生物学、問題107、チップ、クロマチン免疫沈降法、遺伝子座特異的チップ、enChIP、人工DNA結合分子によって媒介されるチップ、クロマチン、エピジェネティクス、ゲノム機能
enChIPによって特定のゲノム領域と関連する分子の同定の単離
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fujita, T., Fujii, H. Isolation of… More

Fujita, T., Fujii, H. Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP. J. Vis. Exp. (107), e53478, doi:10.3791/53478 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter