Introduction
A identificação de moléculas associadas com as regiões genómicas específicas de interesse é necessária para compreender os mecanismos de regulação das funções genómicas, tais como transcrição e regulação epigenética. Embora tenham sido desenvolvidas várias técnicas para análise bioquímica de regiões genômicas específicas 1-7, eles não são amplamente utilizados nesta fase por causa de seus problemas intrínsecos, tais como aplicação limitada (por exemplo, apenas para-elevado número de cópias ou loci loci com repetições) e muito tempo e esforço necessário.
Para realizar a análise bioquímica de regiões genômicas específicas facilmente, nós desenvolvemos duas tecnologias específicas do locus de cromatina imunoprecipitação (chip), nomeadamente insercional chip (Ichip) 8-13 e engenharia mediada por molécula de ligação a DNA ChIP (enChIP) 14-17 . Em Ichip, um lugar de interesse é marcado por sequências de reconhecimento de inserção de uma proteína de ligação de DNA exógeno, como LexA. O locus é então isolado através de purificação por afinidade, utilizando a proteína de ligação de ADN marcado. Em enChIP, modificadas moléculas de ligação a ADN, tais como proteínas de dedos de zinco, proteínas (Tal) de activador do tipo de transcrição, e agrupados regularmente interspaced repetições palindr�icas curtas (CRISPR) complexos, são utilizados para marcar um local de interesse (Figura 1). Subsequentemente, a região genómica que é isolado através de purificação por afinidade das moléculas de ligação de ADN marcados.
Uma das vantagens de enChIP sobre ichip é que a inserção de sequências de reconhecimento de uma proteína de ligação do ADN exógeno não é necessário. Segmentação de loci CRISPR usando complexos que consistem em uma forma cataliticamente inactivo de Cas9 (dCas9) e um guia de RNA (gRNA) é muito mais fácil do que a segmentação dessas regiões por iChip ou enChIP utilizando proteínas TAL e zinc-finger. Aqui, descrevemos um protocolo passo-a-passo para enChIP combinada com a espectrometria de massa e sequenciação de RNA (RNA-Seq) para identificar lócus associa-proteínas e RNAs ted, respectivamente.
Protocol
1. Projeto de Engineered moléculas de DNA-binding Reconhecendo o alvo Locus
- Para enChIP usando complexos CRISPR, use a ferramenta web CRISPRdirect (http://crispr.dbcls.jp) para identificar sequências alvo gRNA candidato na região genômica de interesse descrito como anteriormente 18. Esta ferramenta da web retorna locais genómicos 23 pb da forma 5'-N 20 NGG-3 ', na região de alvo.
- Sintetizar um gBlock incluindo a sequência de promotor U6 e a sequência de 5'-N 20 em 5'-N 20 NGG-3 ', utilizando serviços comerciais (ver Figura 2) 19,20. Para fins de subclonagem, incluem sítios de enzimas de restrição adequados fora do gBlock.
- Inserir o gBlock num vector apropriado tal como previamente descrito 16. Vários vetores retrovirais para gBlocks estão disponíveis (ver Materiais).
- Para enChIP utilizando proteínas TAL, projetar proteínas TAL reconhecendo a target loci. Gerar plasmídeos que codificam proteínas TAL usando serviços comerciais. Gerar vectores de expressão que contêm as proteínas fundidas TAL com uma ou mais marcas, tais como 3 × marcar como previamente descrito 15.
2. Criação de Células para Análise enChIP
- Express 3 × FLAG-dCas9 e o gRNA (procedimento baseia-CRISPR) ou 3 × FLAG-Tal (à base de proteínas procedimento TAL) nas células a serem analisadas conforme descrito anteriormente 14-17.
- Use transfecção transiente, se a eficiência de transfecção é alta. Um vector de expressão contendo 3 × FLAG-dCas9 e o promotor CMV está disponível (ver Materiais).
- Considerar a criação de transformantes estáveis usando métodos convencionais, se a eficiência de transfecção transitória é baixa. Para além dos vectores retrovirais acima mencionados para gBlock, vectores retrovirais de 3 × FLAG-dCas9 estão disponíveis (ver Materiais).
- Confirmar a expressão do gRNA pela norma técnica de RT-PCR.
- Para a identificação quantitativa de proteínas que interagem com a região genômica de interesse, considere o uso de uma rotulagem isótopo estável por aminoácidos em cultura de células (SILAC) análise combinada com enChIP (enChIP-SILAC).
Nota: Os Meios para a análise SILAC podem ser adquiridos de fornecedores comerciais. SILAC é poderosa para detectar interacções específicas.- Células de cultura em SILAC meio pesado. Prepare células cultuvermelho em meio luz SILAC como controle negativo. Utilize pelo menos 5 × 10 7 células para cada meio SILAC (leve ou pesada). Para a rotulagem eficiente, adicione tanto L-Lisina-2HCl, 13 C 6 e L-Arginina-HCl, 13 C 6, 15 N 4 na mídia SILAC pesados. Nota: Pelo menos cinco divisões celulares são necessárias para proteínas de etiquetas.
- Por exemplo, células de cultura humanas fibrossarcoma HT1080 que expressam estavelmente 3xFLAG-dCas9 e um gRNA a 37 ° C e 5% de CO 2 em meio DMEM durante SILAC e soro fetal de bovino dialisado com Lisina-2HCl mais L-arginina-HCl (média de luz) ou 13 C 6 L-Lisina-2HCl mais 13 C 6 15 N 4 L-Arginina-HCl (meio-pesado) (veja Materiais) 16. Adicionam-se 50 mg de leve ou pesada de L-Lisina-2HCl e L-Arginina-HCl em 500 ml de meio.
- Células Trypsinize e replate antes de se tornarem confluentes, de modo que as células manter growt exponencialh.
- Células de cultura em SILAC meio pesado. Prepare células cultuvermelho em meio luz SILAC como controle negativo. Utilize pelo menos 5 × 10 7 células para cada meio SILAC (leve ou pesada). Para a rotulagem eficiente, adicione tanto L-Lisina-2HCl, 13 C 6 e L-Arginina-HCl, 13 C 6, 15 N 4 na mídia SILAC pesados. Nota: Pelo menos cinco divisões celulares são necessárias para proteínas de etiquetas.
Nota: A expressão destas proteínas marcadas também podem ser confirmadas por coloração intracelular com anti-FLAG-FITC e uma análise de FACS subsequente. Um protocolo para a coloração intracelular pode ser baixado do nosso homepage (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html).
3. A ligação cruzada de células com formaldeído
- Para as células em cultura em suspensão, de transferência de 2 x 10 7 células que expressam proteínas 3xFLAG-Tal ou 3xFLAG-dCas9 mais gRNA e suspender em 30 ml de meio de cultura regular em um tubo de centrífuga de 50 ml. Quando são usadas mais células, aumentar os volumes e as quantidades de reagentes proporcionalmente. Para as experiências de SILAC, misturar as células cultivadas em meio pesado ou médio da luz (5 x 10 7 células cada) e dividir o total de 1 x 10 células em 8 5 tubos contendo 2 x 10 7 células.
- Adicionar 810 ul de 37% de formaldeído a 30 ml de suspensão celular (concentração final 1%) e incuba-se a 37 ° C durante 5 min. Para as células aderentes, fixar directamente as células em placas de cultura pela adição de 810 ul de 37% de formaldeído a 30 ml de meio de cultura.
- Pare a reticulação por adição de 3,1 ml de 1,25 M de solução de glicina (127 mM de concentração final), eincubar à TA durante 10 min.
- Recolher as células por centrifugação (300 x g durante 5 min a 4 ° C). Cuidadosamente descarte o sobrenadante incluindo formaldeído e armazená-lo em um frasco adequado de lixo.
- Para as células aderentes, separar as células com um raspador de células e colheita em um tubo de 50 ml, e recolher as células, tal como descrito neste passo.
- Para as experiências de SILAC, misturar as células isoladas em cultura em meio pesado ou meio de luz (5 x 10 7 células cada), dividir o total de 1 x 10 8 células em 5 tubos contendo 2 x 10 7 células, e recolher as células tal como descrito no presente passo.
- Lava-se a pelete de células com 30 ml de PBS duas vezes por tubo. Cuidadosamente descarte o sobrenadante incluindo formaldeído e armazená-lo em um recipiente adequado de resíduos bottle.Handle o formaldeído de acordo com as diretrizes de segurança de produtos químicos. As células fixadas podem ser congeladas e armazenadas a -80 ° C.
4. Preparação da Cromatina (por 2 x 107 células)
- Suspender as células fixadas em 10 ml de tampão de lise celular (Tris 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM, 0,5% de IGEPAL CA-630, e 1 × inibidores da protease) e incubar em gelo durante 10 min.
- Centrifugar a amostra (830 x g a 4 ° C durante 8 min) e o sobrenadante cuidadosamente descartar.
- Suspende-se o sedimento em 10 ml de tampão de lise nuclear (Tris 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM, NaCl 0,5 M, 1% de Triton X-100, desoxicolato de sódio a 0,5%, 0,5% lauroilsarcosina, e inibidores da protease 1x). Incubar em gelo durante 10 min e agitar no vortex todos os 2-3 minutos.
- Centrifugar a amostra (830 × g a 4 ° C durante 8 min) e o sobrenadante cuidadosamente descartar.
- Lava-se a pelete em 10 ml de PBS. O sedimento (fracção cromatina) pode ser armazenada a -80 ° C, após o congelamento imediato em azoto líquido.
5. Sonication de cromatina (por 2 x 10 7 células)
- Suspender a fracção cromatina em 800 ul detampão de lise modificada 3 (Tris 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM, NaCl 150 mM, desoxicolato de sódio a 0,1%, 0,1% SDS e inibidores de protease 1x) e transferir para um tubo de 1,5 ml.
- Sonicar a cromatina utilizando um sonicador (ver Materiais) e as seguintes condições: a saída: 3; dever: 100% (contínua); e tempo: livre. Realizar 10-18 ciclos de ultra-sons durante 10 segundos e arrefecimento em gelo durante 20 seg. Para evitar o aquecimento excessivo, incubar as amostras em gelo durante 2 minutos a cada 5-6 ciclos. Para evitar a formação de espuma, manter a posição da ponta da sonda de ultra-sons de 0,5 cm acima do fundo do tubo.
- Centrifugar a amostra a (16000 x g a 4 ° C durante 10 min) e transferir o sobrenadante para um tubo de 1,5 ml. A cromatina sonicado pode ser armazenado a -80 ° C, após o congelamento imediato em azoto líquido.
6. Avaliação da cromatina Fragmentação
- Misturar 10 ul da cromatina fragmentada com 85 ul de água destilada.
- Adicione 4 ulde NaCl 5 M e incuba-se a 65 ° CO / N.
- Adicionar 1 mL de 10 mg / ml de RNase A e incubar a 37 ° C durante 45 min.
- Adicionar 2 ul de EDTA 0,5 M (pH 8,0), 4 pi de 1 M de Tris (pH 6,8), e 1 uL de 20 mg / ml de Proteinase K, e, em seguida, incuba-se a 45 ° C durante 1,5 h.
- Separada de 10 ul da amostra por electroforese em um gel de agarose a 1% que não contém corantes de coloração tais como SYBR verde.
- Corar o gel para avaliar a distribuição dos comprimentos da cromatina fragmentada. Condições que geram um comprimento médio de 0,5-2 kpb (gama de 0,2-4 kpb) são recomendados.
- Purifica-se o ADN das amostras restantes por extracção com fenol-clorofórmio ou utilizando um kit de extracção de ADN (ver Materiais). O ADN purificado pode ser utilizado como o ADN de entrada para estimar os rendimentos de análises enChIP (ver 8.11).
7. Preparação de Dynabeads conjugado com anticorpos (por 2 x 10 7 células)
- Prépare duas 1,5 ml tubos, um para pré-limpeza utilizando IgG de rato normal e outra para incubação com o anti-FLAG Ab. Adicionar 150 ul de proteína G-conjugado esferas magnéticas (ver Materiais) para cada tubo.
- Colocar os tubos em um carrinho ímã e esperar por 3 min. Descartar o sobrenadante por pipetagem.
- Suspender as pérolas em 1 ml de PBS contendo 0,01% de Tween-20 (PBS-T). Colocar os tubos em um suporte magnético e esperar por 2 min. Desprezar o sobrenadante por pipetagem, em seguida, repita o passo.
- Suspender as pérolas em 1 ml de PBS-T contendo 0,1% de BSA.
- Adiciona-se 15 ug de IgG de rato normal ou anti-FLAG Ab e girar a 4 ° CO / N.
- Spin down brevemente, em seguida, colocar os tubos em um carrinho ímã e esperar por 3 min. Descartar o sobrenadante por pipetagem.
- Suspender as pérolas em 1 ml de PBS-T. Inverta as várias vezes de amostra e girar rapidamente. Colocar os tubos em um carrinho ímã e esperar por 3 min, em seguida, descartar o sobrenadante por pipetagem. Repita a lavagemmais duas vezes com PBS-T (um total de três passos de lavagem).
8. imunoprecipitação da cromatina (por 2 x 10 7 células)
- Misture a cromatina fragmentada preparado em 5.3) (aproximadamente 800 ul) com um quinto do volume (aproximadamente 200 ul) de tampão de lise modificada contendo 3 5% de Triton X-100 (concentração final de 1% de Triton X-100).
- Adicionar a solução da cromatina para o tubo em que contas magnéticas conjugadas com Proteína G conjugadas com IgG de ratinho normal foram preparados. Girar a 4 ° C durante 1 h.
- Colocar o tubo em um carrinho ímã e esperar por 3 min.
- Transferir o sobrenadante para dentro do tubo em que contas magnéticas conjugadas com Proteína G conjugadas com anti-FLAG Ab foram preparados. Girar a 4 ° CO / N.
- Colocar o tubo em um carrinho ímã e esperar por 3 min. Descartar o sobrenadante por pipetagem.
- Suspender as pérolas em 1 ml de tampão de baixa salinidade (20 mM de Tris (pH 8,0), EDTA a 2 mM, NaCl 150 mM, 1% de triton X-100, 0,1% de SDS, e 1x inibidores de protease) e rodar a 4 ° C durante 5 min. Colocar o tubo em um carrinho ímã e esperar por 3 min. Desprezar o sobrenadante por pipetagem e repita o passo de lavagem.
- Lavam-se as esferas com tampão de alto teor salino (Tris 20 mM (pH 8,0), EDTA a 2 mM, NaCl 500 mM, 1% de Triton X-100, 0,1% de SDS, e inibidores da protease 1x) duas vezes.
- Lavam-se as esferas com tampão de LiCl (10 mM de Tris (pH 8,0), EDTA 1 mM, 250 mM de LiCl, 0,5% de IGEPAL CA-630, desoxicolato de sódio a 0,5%, e inibidores de protease 1x) duas vezes.
- Lavam-se as esferas com TBS-IGEPAL CA-630 (Tris 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, IGEPAL CA-inibidores 630, e 1x de protease a 0,1%) uma vez.
- Suspender as pérolas em 200 ul de tampão de eluição (Tris a 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, 0,1% de IGEPAL CA-630, os inibidores da protease de 1x, e 500 ug / ml de 3 péptido × FLAG) e incubar a 37 ° C durante 20 min. Colocar o tubo em um carrinho ímã e esperar por 3 min. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 ml e repetir o Elutpasso ion.
- Purifica-se o ADN a partir de pequena porção (por exemplo, 5%) do eluato por extracção com fenol-clorofórmio ou utilizando um kit de extracção de ADN (ver Materiais). O ADN purificado pode ser utilizado para a PCR com conjuntos de iniciadores específicos para estimar os rendimentos de análises enChIP por comparação com o ADN de entrada, preparada na etapa 6.7, como descrito anteriormente 14,16.
9. SDS-PAGE, coloração e análise de espectrometria de massa
- Misturar o eluato (400 ul) com 1 ml de 2-propanol, 50 ul de acetato de sódio 3M (pH 5,2), e 5 ul de 20 mg / ml de glicogénio. Precipitar o cromatina a -20 ° CO / N.
- Centrifugar a amostra (16000 x g a 4 ° C durante 30 min) e desprezar o sobrenadante. Lavar o sedimento com 1 ml de etanol a 70% e centrifuga-se novamente (16000 x g a 4 ° C durante 10 min). Desprezar o sobrenadante completamente por pipetagem.
- Suspende-se o sedimento em 40 ul de tampão de amostra 2x (Tris 125 mM (pH 6,8), 10% de 2-mercaptoethanol, SDS a 4%, sacarose a 10%, e 0,004% de azul de bromofenol). Vortex durante 5 min para dissolver o sedimento completamente, e, em seguida, incuba-se a 100 ° C durante 30 minutos para desnaturar as proteínas e inverter a reticulação.
- Por SDS-PAGE, correr 40 ul da amostra no gel até o corante atinge 1 cm abaixo do poço. Nota: Normalmente, usamos 4-20% géis de gradiente, mas outros géis% pode ser usado.
- Manchar o gel com Coomassie Brilliant Blue ou prata.
- Corte o gel em cinco pedaços (2 mm de altura).
- Realiza-se em digestão em gel e análise espectrométrica de massa, tal como descrito anteriormente 13-16.
- Para as experiências de SILAC com 5 x 10 7 células cada (total de 1 x 10 8 células), suspender a pelete a partir dos cinco tubos iniciais em 40 ul de tampão de amostra 2x (não é necessário para intensificar).
10. A purificação de RNA e Análise de RNA-Seq
- Para purificar o ARN enChIP depois, adicionam-se 5 U / ml de ARNase Inibidor (SEe Materiais) para todas as soluções tampão, excepto tampão de lise modificada 3 e o tampão de eluição, para que adicionar 40 U / ml de RNase inibidor.
- Misturar o eluato (400 ul) com 16 ul de NaCl 5 M e incuba-se a 65 ° C durante 2 horas.
- Adicionar 1 ml de solução de ácido de guanidínio-fenol-base-(ver Materiais) para a amostra. Vortex durante 15 segundos e, em seguida incubar à temperatura ambiente durante 5-15 min. Centrifugar a amostra durante 15 min a 12.000 x g e RT.
- Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL e adicionar 5 uL de p-bromoanisole. Vortex durante 15 segundos e, em seguida incubar à temperatura ambiente durante 3-5 minutos. Centrifugar a amostra durante 10 min a 12.000 x g e RT.
- Transferir o sobrenadante (aproximadamente 1 ml) para um novo tubo de 2 mL e adicionar 1 ml de 2-propanol. Inverter o tubo e incubar à TA durante 10 min. Carregar a mistura numa coluna de um kit de purificação de RNA (ver Materiais). Centrifugar a coluna durante 1 min a 12.000 × g e RT.
- lavagema coluna com 400 mL de RNA Wash Buffer em um kit de purificação de RNA (ver Materiais).
- Adicionar 80 ul de ADNase I cocktail (mistura de 5 ul de DNase I (1 U / ul), 8 uL de 10 × ADNase I Tampão de Reacção, 3 ul de DNase / RNase isenta de água, e 64 ul de ARN do Tampão de Lavagem em um kit de purificação de RNA (ver Materiais)) para a coluna. Incubar a amostra a 37 ° C durante 15 min e em seguida centrifugar durante 30 segundos a 12.000 x g e RT.
- Lavar a coluna com 400 mL de RNA pré-lavagem tampão em um kit de purificação de RNA (ver Materiais) duas vezes.
- Elui-se o ARN com 50 ul de ADNase / ARNase isenta de água. O RNA eluído pode ser utilizado para a sequenciação de ARN.
Representative Results
Em geral, 1-30% de regiões genómicas alvo pode ser purificado utilizando enChIP. Figura 3 inclui dados representativos mostram os rendimentos em enChIP análises de telómeros direccionamento e o promotor do interferão (IFN) reguladora factor-1 (IRF-1) gene. Como exemplos de resultados típicos, Tabela 1 lista as proteínas associadas com o IRF-1 promotor de uma forma de IFNy específico identificado por enChIP-SILAC, Tabela 2 lista as proteínas se ligam a telómeros identificados por enChIP combinada com espectrometria de massa (enChIP-MS) e Tabela 3 lista os RNAs associadas com telômeros identificados por enChIP-RNA-Seq.
Figura 1. Visão geral do enChIP. enChIP usando CRISPR (A, B) e TAL (C, D, E Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Seqüência de gBlock. O promotor U6 (em preto), o G nucleotídeo bntes a sequência de guia (em azul), a sequência de guia (gRNA espaçador) (em vermelho), a sequência de suporte (em verde), e uma sequência de terminador (em laranja) são mostrados.
Figura 3. Rendimentos de análises enChIP representante. Insumos (A) Porcentagem para a meta de IRF-1 lócus ea Sox2 lócus não-alvo. Entradas (B) Porcentagem para os telômeros-alvo e não-alvo y-satélites. Os números foram adaptados e modificados a partir de publicações anteriores 15,16.
| Categorias | Proteínas |
| Transcrição | DDX1, PARP1, CKAP4, Pescadillo homólogo, PURβ, activado RNA polimerase II activador transcricional de p15, BTF3, Myb de ligação1A proteína |
| Desacetilação Histona, componentes corepressor | RBBP4, PA2G4, TBL3 |
| Acetiltransferase | Proteína arginina metiltransferase N-1 |
| DNA topoisomerase | DNA topoisomerase 2α |
| Histones | Histona H2A.Z, H3.2 histona |
Tabela 1:. Exemplos de proteínas associadas com o promotor de IRF-1 humano região de uma forma de IFNy específico identificado por enChIP-SILAC A tabela foi adaptada de uma publicação anterior 16.
| Categorias | Proteínas |
| Proteínas se ligam a telómeros de mamíferos | PML, RPA, CDK1, PARP1, PCBP1 |
| Telômero-binding proteínas em levedura ou outros organismos | IMP4 |
| As proteínas que interagem com o telómero de ligação proteínas [proteína de ligação dos telômeros associado] | DNA polimerase α (Pola1) [Cdc13p], ARMC6 [TRF2], CTBP1 [FoxP2-POT1], exportin-5 [terc], GNL3L [TRF1], exportin-1 [terc], 14-3-3 [terc] |
| Proteínas que localizam a heterochromatin | BEND3 |
| Proteínas reguladoras marcas epigenéticas | KDM5C |
| Proteínas cujas mutações afetam a função dos telômeros | Α DNA polimerase (Pola1), Hat1, Nup133, CDK7, DPOE1, PRDX1, TYSY, glutamato-cisteína-ligase, glutarredoxina, SMRC1 |
Tabela 2:. Exemplos de proteínas associadas com telômeros rato identificadas por enChIP-MS A tabela foi adapted de uma publicação anterior 15.
| Categorias | RNAs |
| Componentes da telomerase | Terc, rMRP |
| Telomeric RNAs | Terras |
| scaRNAs | Scarna6, Scarna10, Scarna13, Scarna2 |
| H / ACA snoRNAs | Snora23, Snora74a, Snora73b, Snora73a |
| C / D snoRNAs | Snord17, Snord15a, Snord118 |
| lncRNA | Neat1 |
Tabela 3: Exemplos de RNAs associadas com telômeros rato identificadas por enChIP-RNA-Seq A tabela foi adaptada de uma publicação anterior 17..
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação para a Ciência Takeda (TF); a Fundação Asahi Glass; o Memorial Foundation Uehara (HF); o Kurata Memorial Hitachi Ciência e Fundação de Tecnologia (FT e IC); Conceda-in-Aid para Jovens Cientistas (B) (# 25830131), Grant-in-Aid para a Investigação Científica (C) (# 15K06895) (TF); e um Grant-in-Aid para a Investigação Científica em 'Ciclo de transcrição' áreas inovadoras (# 25118512 & # 15H01354), Grant-in-Aid para a Investigação Científica (B) (# 15H04329), Grant-in-Aid para a Investigação exploratória ( # 26650059) e 'Genome Suporte' (# 221S0002) (HF) do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gBlock synthesis service | Life Technologies | Gene Synthesis by GeneArt | |
| gBlock synthesis service | IDT (Integrated DNA Technologies) | gBlocks Gene Fragments | |
| pSIR-neo | Addgene | 51128 | |
| pSIR-GFP | Addgene | 51134 | |
| pSIR-DsRed-Express2 | Addgene | 51135 | |
| pSIR-hCD2 | Addgene | 51143 | |
| TAL synthesis service | Life Technologies | GeneArt Precision TALs | |
| 3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1 | Addgene | 47948 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-puro | Addgene | 51240 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-IG | Addgene | 51258 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-I2 | Addgene | 51259 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-neo | Addgene | 51260 | |
| anti-FLAG M2 Ab | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| FITC-conjugated anti-FLAG M2 | Sigma-Aldrich | F4049 | |
| DMEM medium for SILAC | Life Technologies | 89985 | Other medium can be purchased from Life Technologies |
| Dialyzed FBS for SILAC | Life Technologies | 89986 | |
| L-Lysine-2HCl for SILAC | Life Technologies | 89987 | For Light medium |
| L-Arginine-HCl for SILAC | Life Technologies | 89989 | For Light medium |
| L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC | Life Technologies | 89988 | For Heavy medium |
| L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC | Life Technologies | 89990 | For Heavy medium |
| Complete, mini, EDTA-free | Roche Diagnostics | 4693159 | |
| Ultrasonic Disruptor UD-201 | Tomy Seiko | ||
| ChIP DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D5205 | |
| Dynabeads-Protein G | Life Technologies | DB10004 | |
| RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2611 | |
| Isogen II | Nippon Gene | 311-07361 | |
| Direct-zol RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2050 | |
| LTQ Orbitrap Velos | Thermo Fisher Scientific | A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis | |
| nanoLC | Advance, Michrom Bioresources | A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis | |
| HTC-PAL autosampler | CTC Analytics | A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis |
References
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