Introduction
Identifieringen av molekyler som är förknippade med specifika genomiska regioner av intresse är skyldig att förstå mekanismerna för reglering av genomiska funktioner som transkription och epigenetisk reglering. Även om flera tekniker har utvecklats för biokemisk analys av specifika genomregioner 1-7, är de inte används i stor utsträckning i detta skede på grund av sina inneboende problem, såsom begränsad tillämpning (t.ex. endast för hög kopietal loci eller loci med upprepningar) och för mycket tid och ansträngningar krävs.
För att kunna utföra biokemisk analys av specifika genomregioner lätt, har vi utvecklat två locus-specifika kromatin immunoprecipitation (chip) teknik, nämligen inser ChIP (Ichip) 13/08 och konstruerade DNA-bindande molekyl-medierad ChIP (enChIP) 14-17 . I Ichip, är ett ställe av intresse taggade uttryck genom att placera igenkänningssekvenser av en exogen DNA-bindande proteinet, såsom LexA. lokus isoleras därefter genom affinitetsrening med användning av den märkta DNA-bindande proteinet. I enChIP, manipulerade DNA-bindande molekyler, såsom zink-fingerproteiner, transkriptionsaktivator liknande (TAL) proteiner, och klustrade regelbundet mellanrum korta palindromiska upprepningar (crispr) komplex, används för att märka en plats av intresse (Figur 1). Därefter genomregion isolerades genom affinitetsrening av de märkta DNA-bindande molekyler.
En av fördelarna med enChIP över Ichip är att införande av igenkänningssekvenser av en exogen DNA-bindande proteinet är inte nödvändigt. Målinriktningen av loci med användning crispr komplex bestående av en katalytiskt inaktiv form av Cas9 (dCas9) och en guide-RNA (gRNA) är mycket enklare än målsökning av dessa regioner av Ichip eller enChIP använder TAL och zink-fingerproteiner. Här beskriver vi en steg-för-steg-protokoll för enChIP kombinerat med masspektrometri och RNA-sekvensering (RNA-SEQ) för att identifiera locus-Associated proteiner och RNA, respektive.
Protocol
1. Design av Engineered DNA-bindande molekyler erkänner mållokuset
- För enChIP använder crispr komplex, använder CRISPRdirect webbverktyget (http://crispr.dbcls.jp) för att identifiera kandidat gRNA målsekvenser i den genomiska regionen av intresse som beskrivs som tidigare 18. Detta webbverktyg returnerar 23 bp genomiska platser i formen 5'-N 20 NGG-3 "i målområdet.
- Syntetisera en gBlock inklusive U6 promotorsekvensen och sekvensen för 5'-N 20 i 5'-N 20 NGG-3 'med användning av kommersiella tjänster (se figur 2) 19,20. För subkloning ändamål innehålla lämpliga restriktionsenzymställen utanför gBlock.
- För in gBlock i en lämplig vektor som tidigare beskrivits 16. Flera retrovirusvektorer för gBlocks finns (se Material).
- För enChIP använder TAL proteiner, designa TAL proteiner som känner igen target loci. Generera plasmider som kodar för TAL proteiner med användning av kommersiella tjänster. Generera expressionsvektorer innehållande de TAL proteiner fuserade med en eller flera taggar såsom 3 × FLAG som tidigare beskrivits 15.
2. Upprättande av celler för enChIP Analysis
- Uttryck 3 × FLAG-dCas9 och gRNA (crispr baserade förfarandet) eller 3 × FLAG-TAL (TAL proteinbaserad procedur) i de celler som skall analyseras som beskrivits tidigare 14-17.
- Använd transient transfektion om transfektionseffektiviteten är hög. En expressionsvektor innehållande 3 × FLAG-dCas9 och CMV-promotorn är tillgänglig (se Material).
- Överväga att införa stabila trans med konventionella metoder om transient transfektion effektivitet är låg. Förutom de tidigare nämnda retrovirala vektorerna för gBlock, retrovirala vektorer 3 × FLAG-dCas9 är tillgängliga (se Material).
- Bekräfta uttryck av gRNA av standard RT-PCR-teknik.
- För kvantitativ identifiering av proteiner som interagerar med den genomiska regionen av intresse, överväga användning av en stabil isotop märkning av aminosyror i cellkultur (SILAC) analys i kombination med enChIP (enChIP-SILAC).
Obs: Media för SILAC analysen kan köpas från kommersiella leverantörer. SILAC är kraftfull i att upptäcka specifika interaktioner.- Kulturceller i SILAC tung medium. Förbered celler Culturött i SILAC ljus mediet som en negativ kontroll. Använd minst 5 x 10 7 celler för varje SILAC medium (tung eller lätt). För effektiv märkning, lägga både L-lysin-2HCl, 13 C 6 och L-arginin-HCl, 13 C 6, 15 N 4 i SILAC Tunga media. Obs: Minst fem celldelningar är nödvändiga för att märka proteiner.
- Exempelvis kultur humana fibrosarkom HT1080 celler som stabilt uttrycker 3xFLAG-dCas9 och en gRNA vid 37 ° C och 5% CO2 i DMEM-medium för SILAC och dialyserat fetalt bovint serum med Lysin-2HCl plus L-arginin-HCl (tända medium) eller 13 C 6 L-lysin-2HCl plus 13 C 6 15 N 4 L-arginin-HCI (Heavy medium) (se Material) 16. Tillsätt 50 mg av lätt eller tung L-lysin-2HCl och L-arginin-HCl i 500 ml medium.
- Trypsinize och förnyad utbredning celler innan de blir sammanflytande, så att celler upprätthålla exponentiell growttim.
- Kulturceller i SILAC tung medium. Förbered celler Culturött i SILAC ljus mediet som en negativ kontroll. Använd minst 5 x 10 7 celler för varje SILAC medium (tung eller lätt). För effektiv märkning, lägga både L-lysin-2HCl, 13 C 6 och L-arginin-HCl, 13 C 6, 15 N 4 i SILAC Tunga media. Obs: Minst fem celldelningar är nödvändiga för att märka proteiner.
Obs: Uttryckning av dessa märkta proteiner kan även bekräftas genom intracellulär färgning med anti-FLAG-FITC och en efterföljande FACS-analys. Ett protokoll för intracellulär färgning kan laddas ner från vår hemsida (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html).
3. Tvärbindning av celler med formaldehyd
- För celler i suspensionskultur, överförings 2 x 10 7 celler som exprimerar 3xFLAG-TAL proteiner eller 3xFLAG-dCas9 plus gRNA och suspendera i 30 ml normalt odlingsmedium i en 50 ml centrifugrör. När flera celler används, öka volymerna och mängder av reagens proportionellt. För SILAC experiment, blanda cellerna odlats i tung medium eller ljus medel (5 x 10 7 celler vardera) och dividera summan av 1 x 10 8 celler i 5 rör innehållande 2 x 10 7 celler.
- Lägg 810 pl av 37% formaldehyd till 30 ml av cellsuspensionen (slutkoncentration 1%) och inkubera vid 37 ° C under 5 minuter. För anhängare celler, direkt fixa celler i odlingsskålar genom att tillsätta 810 pl av 37% formaldehyd till 30 ml odlingsmedium.
- Stoppa tvärbindning genom tillsats av 3,1 ml av 1,25 M glycin-lösning (slutlig koncentration 127 mM) ochinkubera vid RT i 10 min.
- Samla cellerna genom centrifugering (300 x g under 5 min vid 4 ° C). Försiktigt kassera supernatanten inklusive formaldehyd och förvara den i en lämplig avfallsflaskan.
- För vidhäftande celler, lösgöra celler med en cellskrapa och skörd i en 50 ml-rör, och samla upp celler, såsom beskrivs i det här steget.
- För SILAC experiment, blanda de lösgjorda celler odlade i tung medium eller ljus medel (5 x 10 7-cell vardera), dividera det totala av 1 x 10 8 celler i 5 rör innehållande 2 x 10 7 celler, och samla upp celler, såsom beskrivs i detta steg.
- Tvätta cellpelleten med 30 ml PBS två gånger per rör. Försiktigt kassera supernatanten inklusive formaldehyd och förvara den i en lämplig avfalls bottle.Handle formaldehyd avfall enligt kemikaliesäkerhetsanvisningar. De fixerade cellerna kan frysas och förvaras vid -80 ° C.
4. Framställning av Chromatin (per 2 x 107-celler)
- Suspendera de fixerade cellerna i 10 ml cell-lys-buffert (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5% IGEPAL CA-630, och 1 × proteasinhibitorer) och inkubera på is under 10 minuter.
- Centrifugera provet (830 x g vid 4 ° C under 8 min) och kassera supernatanten försiktigt.
- Suspendera pelleten i 10 ml av kärn lysbuffert (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoxikolat, 0,5% lauroylsarkosin och 1x proteasinhibitorer). Inkubera på is under 10 min och vortexblanda varje 2-3 min.
- Centrifugera provet (830 × g vid 4 ° C under 8 min) och kassera supernatanten försiktigt.
- Tvätta pelleten i 10 ml PBS. Pelleten (kromatin fraktion) kan lagras vid -80 ° C efter omedelbar frysning i flytande kväve.
5. Sonication av Chromatin (per 2 x 10 7 celler)
- Suspendera kromatinet fraktionen i 800 | ilmodifierad lysbuffert 3 (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,1% natriumdeoxikolat, 0,1% SDS, och 1x proteasinhibitorer) och överför till en 1,5 ml rör.
- Sonikera kromatin med hjälp av en sonikator (se Material) och följande villkor: output: 3; tull: 100% (kontinuerlig); och tid: fri. Utför 10-18 cykler av sonikering under 10 sek och kylning på is under 20 sek. För att undvika överhettning, inkubera proverna på is under 2 minuter var 5-6 cykler. För att undvika skumning, hålla positionen för spetsen av sonikering sonden 0,5 cm ovanför botten av röret.
- Centrifugera provet vid (16 tusen x g vid 4 ° C under 10 min) och överför supernatanten till ett 1,5 ml rör. Det sonikerade kromatin kan lagras vid -80 ° C efter omedelbar frysning i flytande kväve.
6. Utvärdering av Chromatin Fragmentation
- Blanda 10 pl av den fragmenterade kromatin med 85 il destillerat vatten.
- Tillsätt 4 | ilav 5 M NaCl och inkubera vid 65 ° CO / N.
- Tillsätt 1 pl av 10 mg / ml RNas A och inkubera vid 37 ° C under 45 minuter.
- Tillsätt 2 | il 0,5 M EDTA (pH 8,0), 4 | il 1 M Tris (pH 6,8), och 1 | il av 20 mg / ml proteinas K, och sedan inkubera vid 45 ° C under 1,5 h.
- Separata 10 pl av provet genom elektrofores i en 1% agarosgel som inte innehåller färgande färgämnen såsom SYBR Green.
- Fläck gelén för att utvärdera fördelningen av längderna av den splittrade kromatin. Förhållanden som genererar en medellängd på 0,5-2 kbp (intervallet 0,2-4 kbp) rekommenderas.
- Rena DNA från de återstående proven genom fenol-kloroform-extraktion eller genom att använda en DNA-extraktion-kit (se Material). Det renade DNA kan användas som underlag DNA för att uppskatta utbyten av enChIP analyser (se 8.11).
7. Framställning av Dynabeads konjugerad med antikroppar (per 2 x 10 7 celler)
- Prepare två 1,5 ml rör, ett för pre-clearing användning av normalt mus IgG och den andra för inkubation med anti-FLAG Ab. Tillsätt 150 pl av protein G-konjugerade magnetiska pärlor (se Material) till varje rör.
- Placera rören på en magnet stå och vänta i 3 minuter. Kasta bort supernatanten genom pipettering.
- Suspendera pärlorna i 1 ml PBS innehållande 0,01% Tween-20 (PBS-T). Placera rören på ett magnetiskt ställ och vänta 2 min. Kassera supernatanten genom pipettering, och sedan upprepa steg.
- Suspendera pärlorna i 1 ml PBS-T innehållande 0,1% BSA.
- Tillsätt 15 mikrogram av normal mus-IgG eller anti-FLAG Ab och rotera vid 4 ° CO / N.
- Spinn ner en kort stund, sedan placera rören på en magnet stå och vänta i 3 minuter. Kasta bort supernatanten genom pipettering.
- Suspendera pärlorna i 1 ml PBS-T. Vänd prov flera gånger och spinn ner en kort stund. Placera rören på en magnet stå och vänta på 3 minuter, därefter kassera supernatanten genom pipettering. Upprepa tvättaytterligare två gånger med PBS-T (totalt tre tvättsteg).
8. Kromatin Immunoprecipitation (per 2 x 10 7 celler)
- Blanda den splittrade kromatin framställd i 5,3) (approximativt 800 | il) med en femtedel av volymen (ca 200 | j, l) av modifierat lysbuffert 3 innehållande 5% Triton X-100 (slutkoncentration av 1% Triton X-100).
- Lägg kromatinet lösningen till röret, i vilken protein G-konjugerade magnetiska kulor konjugerade med normal mus-IgG framställdes. Rotera vid 4 ° C under 1 timme.
- Placera röret på en magnet stå och vänta i 3 minuter.
- Överför supernatanten in i röret i vilket protein G-konjugerade magnetiska pärlor konjugerade med anti-FLAG-Ab framställdes. Rotera vid 4 ° CO / N.
- Placera röret på en magnet stå och vänta i 3 minuter. Kasta bort supernatanten genom pipettering.
- Suspendera pärlorna i 1 ml av buffert med låg salthalt (20 mM Tris (pH 8,0), 2 mM EDTA, 150 mM NaCI, 1% Tritons X-100, 0,1% SDS och 1 x proteasinhibitorer) och rotera vid 4 ° C under 5 minuter. Placera röret på en magnet stå och vänta i 3 minuter. Kassera supernatanten genom pipettering och upprepa tvättsteget.
- Tvätta pärlorna med buffert med hög salthalt (20 mM Tris (pH 8,0), 2 mM EDTA, 500 mM NaCI, 1% Triton X-100, 0,1% SDS och 1 x proteasinhibitorer) två gånger.
- Tvätta pärlorna med LiCl-buffert (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 250 mM LiCl, 0,5% IGEPAL CA-630, 0,5% natriumdeoxikolat, och 1x proteasinhibitorer) två gånger.
- Tvätta pärlorna med TBS-IGEPAL CA-630 (50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCI, 0,1% IGEPAL CA-630, och 1 x proteasinhibitorer) en gång.
- Suspendera pärlorna i 200 pl elueringsbuffert (50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCI, 0,1% IGEPAL CA-630, 1x proteasinhibitorer, och 500 | ig / ml 3 x FLAG-peptiden) och inkubera vid 37 ° C under 20 min. Placera röret på en magnet stå och vänta i 3 minuter. Överför supernatanten till ett nytt 1,5 ml rör och upprepa elutjon steg.
- Rena DNA från liten del (t.ex. 5%) av eluatet genom fenol-kloroform-extraktion eller genom att använda en DNA-extraktion-kit (se Material). Det renade DNA: t kan användas för PCR med specifika primeruppsättningar att uppskatta utbytena av enChIP analyser genom att jämföra med input DNA framställt i Steg 6,7 såsom beskrivits tidigare 14,16.
9. SDS-PAGE, Färgning och Masspektrometrisk analys
- Blanda eluatet (400 pl) med en ml 2-propanol, 50 fil 3 M natriumacetat (pH 5,2), och 5 | il av 20 mg / ml glykogen. Fällning kromatinet vid -20 ° CO / N.
- Centrifugera provet (16000 x g vid 4 ° C under 30 min) och kassera supernatanten. Skölj pelleten med 1 ml 70% etanol och centrifugera igen (16 tusen x g vid 4 ° C under 10 min). Kassera supernatanten fullständigt genom pipettering.
- Suspendera pelleten i 40 pl 2x provbuffert (125 mM Tris (pH 6,8), 10% 2-mercaptoethanol, 4% SDS, 10% sackaros och 0,004% bromfenolblått). Vortexa i 5 min för att upplösa pelleten fullständigt, och sedan inkubera vid 100 ° C under 30 min för att denaturera proteinerna och backtvärbindningen.
- För SDS-PAGE, köra 40 | il av provet på gelén tills färgen når 1 cm under brunnen. Obs: Vi använder vanligtvis 4-20% gradientgeler, men andra% geler kan användas.
- Fläck gelén med Coomassie Brilliant Blue eller silverfärgning.
- Skär gelen i fem stycken (2 mm höjd).
- Utför i gel matsmältningen och masspektrometrisk analys som beskrivits tidigare 13-16.
- För SILAC experiment med 5 x 10 7 celler vardera (totalt 1 x 10 8 celler), suspendera pelleten från de första fem rören i 40 pl 2x provbuffert (det är inte nödvändigt att skala upp).
10. Rening av RNA och RNA-Seq analys
- För att rena RNA efter enChIP, tillsätt 5 U / ml RNas-inhibitor (see Material) och alla de buffertlösningar, förutom modifierat lysbuffert 3 och elueringsbufferten, till vilken tillsätt 40 U / ml av RNas-inhibitor.
- Blanda eluatet (400 pl) med 16 pl 5 M NaCl och inkubera vid 65 ° C under 2 h.
- Tillsätt 1 ml av syra-guanidin-fenol-reagens (se Material) till provet. Vortex under 15 sekunder och sedan inkubera vid rumstemperatur under 5-15 min. Centrifugera provet i 15 minuter vid 12.000 x g och RT.
- Överför supernatanten till ett nytt 1,5 ml rör och tillsätt 5 pl av p-bromanisol. Vortexa i 15 sekunder och sedan inkubera vid RT i 3-5 min. Centrifugera provet för 10 min vid 12 tusen x g och RT.
- Överför supernatanten (ca 1 ml) in i ett nytt 2 ml-rör och tillsätt 1 ml 2-propanol. Vänd röret och inkubera vid RT i 10 min. Ladda blandningen på en kolonn i en RNA-reningskit (se Material). Centrifugera kolumnen för en min vid 12.000 x g och RT.
- Tvättakolonnen med 400 ul av RNA-tvättbuffert i en RNA-reningskit (se Material).
- Lägg 80 il DNas I cocktail (blandning av 5 il DNas I (1 U / ul), 8 pl 10 × DNas I Reaction Buffer, 3 il DNas / RNas-fritt vatten, och 64 pl RNA Wash Buffer i en RNA-reningskit (se Material)) till kolonnen. Inkubera provet vid 37 ° C under 15 minuter och centrifugera sedan i 30 sek vid 12 tusen x g och RT.
- Tvätta kolonnen med 400 ul av RNA-Förtvätt buffert i en RNA-reningskit (se Material) två gånger.
- Eluera RNA med 50 pl DNas / RNas-fritt vatten. Den eluerade RNA: t kan användas för RNA-sekvensering.
Representative Results
Sammantaget kan 1-30% av målgruppgenomregioner renas med hjälp av enChIP. Figur 3 innefattar representativa uppgifter som visar utbytena av enChIP analyser inriktning telomerer och promotorn av interferon (IFN) reglerande faktor-1 (IRF-1) genen. Som exempel på typiska resultat, Tabell 1 listar de proteiner associerade med IRF-1-promotorn i en IFNy specifikt sätt identifieras av enChIP-SILAC, Tabell 2 listar telomeren bindande proteinerna identifierade genom enChIP kombinerad med masspektrometri (enChIP-MS) och Tabell 3 visar RNA i samband med telomererna identifierats av enChIP-RNA-Seq.
Figur 1. Översikt över enChIP. enChIP användning crispr (A, B) och TAL (C, D, E Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Sekvens av gBlock. Den U6 promotor (i svart), G nukleotid böre styrsekvensen (i blått), är styrsekvensen (gRNA spacer) (i rött), ställningen sekvensen (i grönt), och terminatorsekvensen (orange) visas.
Figur 3. Utbyten av representativa enChIP analyser. (A) Andel ingångar för målet IRF-1 locus och icke-mål Sox2 locus. (B) Andel ingångar för målgrupp telomerer och utanför målgruppen y-satelliter. Siffrorna har anpassats och modifierats tidigare publikationer 15,16.
| Kategorier | Proteiner |
| Transkription | DDX1, PARP1, CKAP4, Pescadillo homolog, PURβ, aktiverad RNA-polymeras II transkriptionsaktivator p15, BTF3, myb bindandeprotein 1A |
| Histon deacetylering, corepressor komponenter | RBBP4, PA2G4, TBL3 |
| Acetyltransferas | Protein arginin N-metyltransferas 1 |
| DNA-topoisomeras | DNA topoisomeras 2α |
| Histoner | Histon H2A.Z, histon H3.2 |
Tabell 1:. Exempel på proteiner som är förknippade med den humana IRF-1-promotorregionen i en IFNy specifikt sätt identifieras av enChIP-SILAC Tabellen har anpassats från en tidigare publikation 16.
| Kategorier | Proteiner |
| Däggdjurs telomeren-bindande proteiner | PML, RPA, CDK1, PARP1, PCBP1 |
| Telomer-biENDE proteiner i jäst eller andra organismer | Imp4 |
| Proteiner som interagerar med telomer-bindande proteiner [associerade telomer-bindande protein] | DNA-polymeras α (POLA1) [Cdc13p], ARMC6 [TRF2], CTBP1 [FOXP2-POT1], exportin-5 [TERT], GNL3L [TRF1], exportin-1 [TERT], 14-3-3 [TERT] |
| Proteiner lokalisera till heterokromatin | BEND3 |
| Proteiner som reglerar epigenetiska märken | KDM5C |
| Proteiner vars mutationer påverkar telomer-funktion | DNA-polymeras α (POLA1), HAT1, Nup133, Cdk7, DPOE1, PRDX1, TYSY, glutamat-cystein ligas, glutaredoxin, SMRC1 |
Tabell 2:. Exempel på proteiner som är förknippade med mus telomererna identifierade genom enChIP-MS Tabellen har varit ADAPTEd från en tidigare publikation 15.
| Kategorier | RNA |
| Telomeras komponenter | TERC, Rmrp |
| Telomera RNA | Terras |
| scaRNAs | Scarna6, Scarna10, Scarna13, Scarna2 |
| H / ACA snoRNAs | Snora23, Snora74a, Snora73b, Snora73a |
| C / D snoRNAs | Snord17, Snord15a, Snord118 |
| lncRNA | Neat1 |
Tabell 3: Exempel på RNA i samband med mus telomererna identifierats av enChIP-RNA-Seq Tabellen har anpassats från en tidigare publikation 17..
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Takeda Science Foundation (TF); Asahi Glass Foundation; den Uehara Memorial Foundation (HF); den Kurata Memorial Hitachi Science and Technology Foundation (TF och HF); Grant-i-Stöd för unga forskare (B) (# 25830131), Grant-i-Stöd för vetenskaplig forskning (C) (# 15K06895) (TF); och en Grant-i-Stöd för vetenskaplig forskning om innovativa områden "Transcription Cycle" (# 25.118.512 & # 15H01354), Grant-i-Stöd för vetenskaplig forskning (B) (# 15H04329), Grant-i-Stöd för Exploratory Research ( # 26650059) och "Genome Support" (# 221S0002) (HF) från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik i Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gBlock synthesis service | Life Technologies | Gene Synthesis by GeneArt | |
| gBlock synthesis service | IDT (Integrated DNA Technologies) | gBlocks Gene Fragments | |
| pSIR-neo | Addgene | 51128 | |
| pSIR-GFP | Addgene | 51134 | |
| pSIR-DsRed-Express2 | Addgene | 51135 | |
| pSIR-hCD2 | Addgene | 51143 | |
| TAL synthesis service | Life Technologies | GeneArt Precision TALs | |
| 3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1 | Addgene | 47948 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-puro | Addgene | 51240 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-IG | Addgene | 51258 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-I2 | Addgene | 51259 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-neo | Addgene | 51260 | |
| anti-FLAG M2 Ab | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| FITC-conjugated anti-FLAG M2 | Sigma-Aldrich | F4049 | |
| DMEM medium for SILAC | Life Technologies | 89985 | Other medium can be purchased from Life Technologies |
| Dialyzed FBS for SILAC | Life Technologies | 89986 | |
| L-Lysine-2HCl for SILAC | Life Technologies | 89987 | For Light medium |
| L-Arginine-HCl for SILAC | Life Technologies | 89989 | For Light medium |
| L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC | Life Technologies | 89988 | For Heavy medium |
| L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC | Life Technologies | 89990 | For Heavy medium |
| Complete, mini, EDTA-free | Roche Diagnostics | 4693159 | |
| Ultrasonic Disruptor UD-201 | Tomy Seiko | ||
| ChIP DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D5205 | |
| Dynabeads-Protein G | Life Technologies | DB10004 | |
| RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2611 | |
| Isogen II | Nippon Gene | 311-07361 | |
| Direct-zol RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2050 | |
| LTQ Orbitrap Velos | Thermo Fisher Scientific | A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis | |
| nanoLC | Advance, Michrom Bioresources | A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis | |
| HTC-PAL autosampler | CTC Analytics | A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis |
References
- Zhang, X. Y., Horz, W. Analysis of highly purified satellite DNA containing chromatin from the mouse. Nucleic Acids Res. 10, 1481-1494 (1982).
- Workman, J. L., Langmore, J. P. Nucleoprotein hybridization: a method for isolating specific genes as high molecular weight chromatin. Biochemstry. 24, 7486-7497 (1985).
- Boffa, L. C., Carpaneto, E. M., Allfrey, V. G. Isolation of active genes containing CAG repeats by DNA strand invasion by a peptide nucleic acid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 1901-1905 (1995).
- Jaskinskas, A., Hamkalo, B. A. Purification and initial characterization of primate satellite chromatin. Chromosome Res. 7, 341-354 (1999).
- Griesenbeck, J., Boeger, H., Strattan, J. S., Kornberg, R. D. Affinity purification of specific chromatin segments from chromosomal loci in yeast. Mol. Cell Biol. 23, 9275-9282 (2003).
- Ghirlando, R., Felsenfeld, G. Hydrodynamic studies on defined heterochromatin fragments support a 30-µm fiber having six nucleosomes per turn. J. Mol. Biol. 376, 1417-1425 (2008).
- Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
- Hoshino, A., Fujii, H. Insertional chromatin immunoprecipitation: a method for isolating specific genomic regions. J. Biosci. Bioeng. 108, 446-449 (2009).
- Fujita, T., Fujii, H. Direct idenification of insulator components by insertional chromatin immunoprecipitation. PLoS One. 6, e26109 (2011).
- Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions by insertional chromatin immunoprecipitation (iChIP) with a second-generation tagged LexA DNA-binding domain. Adv. Biosci. Biotechnol. 3, 626-629 (2012).
- Fujita, T., Fujii, H. Locus-specific biochemical epigenetics / chromatin biochemistry by insertional chromatin immunoprecipitation. ISRN Biochem. 2013, 913273 (2013).
- Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions retaining molecular interactions by the iChIP system using recombinant exogenous DNA-binding proteins. BMC Mol. Biol. 15, 26 (2014).
- Fujita, T., Kitaura, F., Fujii, H. A critical role of the Thy28-MYH9 axis in B cell-specific expression of the Pax5 gene in chicken B cells. PLoS One. 10, (2015).
- Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated proteins by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Biochem. Biophys. Res. Commun. 439, 132-136 (2013).
- Fujita, T., et al. Identification of telomere-associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP). Sci. Rep. 3, 3171 (2013).
- Fujita, T., Fujii, H. Identification of proteins associated with an IFNγ-responsive promoter by a retroviral expression system for enChIP using CRISPR. PLoS One. 9, e103084 (2014).
- Fujita, T., Yuno, M., Okuzaki, D., Ohki, R., Fujii, H. Identification of non-coding RNAs associated with telomeres using a combination of enChIP and RNA sequencing. PLoS One. 10, e0123387 (2015).
- Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. , (2014).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Esvelt, K. M., et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nat. Methods. 10, 1116-1121 (2013).
- Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152, 1173-1183 (2013).
- Wu, X., et al. Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 32, 670-676 (2014).
- Kuscu, C., Arslan, S., Singh, R., Thorpe, J., Adli, M. Genome-wide analysis reveals characteristics of off-target sites bound by the Cas9 endonuclease. Nat Biotechnol. 32, 677-683 (2014).
- Cencic, R., et al. Protospacer adjacent motif (PAM)-distal sequences engage CRISPR Cas9 DNA target cleavage. PLoS One. 9, 109213 (2014).
- O'Green, H., Henry, I. M., Bhakta, M. S., Meckler, J. F., Segal, D. J. A genome-wide analysis of Cas9 binding specificity using ChIP-seq and targeted sequence capture. Nucleic Acids Res. 43, 3389-3404 (2015).
- de Lange, T. Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres. Genes Dev. 19, 2100-2110 (2005).
