Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

侧根诱导系统 doi: 10.3791/53481 Published: January 14, 2016
* These authors contributed equally

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

根系统是植物生长的关键,因为它确保锚固的水分吸收和养分从​​土壤。因为根系统的扩展主要是依赖于生产侧根,其起始和形成已被广泛研究。侧根开始在柱鞘细胞的特定子集,称为创始人电池 1。在大多数双子叶植物,如拟南芥 ,这些细胞都位于原生木质部极2,而在单子叶植物,如玉米,它们被发现在韧皮部磁极3。创办人细胞通过增加生长素应答4标记,接着通过特定的细胞周期基因表达例如 细胞周期蛋白B1; 1 / CYCB1; 1),之后,它们经历了第一轮的不对称背斜司5。经过一系列的协调背斜与平周分裂,一侧根原基形成的最终将成为一个一utonomous侧根。的位置和侧根起始定时是但是不可预见的,因为这些事件既不丰富也不同步。这妨碍了使用分子的方法,例如转录研究这一过程。

为了解决这个问题,一个侧根诱导系统(LRIS)已经开发6,7。在这个系统中,幼苗首先用N - 1-naphthylphthalamic酸(NPA),其抑制生长素运输和积累,从而阻断侧根开始8。通过随后转移至苗含有合成植物生长素-1-萘乙酸(NAA)培养基中,整个柱鞘层响应该升高的生长素水平从而大规模诱导侧根启动细胞分裂6。因此,这一制度导致了快速,同步和广泛的侧根灌顶,方便收集富含晚期的特定阶段根样本拉尔根系发育。随后,这些样品可以被用来确定在侧根形成的全基因组表达谱。该LRIS取得了约侧根开始拟南芥和玉米9-13,但需要已经显著的知识,这个系统应用到其他植物物种变得更基因组被测序更加明显,并且有越来越多的兴趣将知识传授给经济的重要种类。

这里, 拟南芥和玉米LRISs的详细方案给出。接着,使用该系统的一个例子是提供,通过说明如何从玉米LRIS获得转录数据可用于识别具有在不同的植物物种侧根发起期间的保守功能功能同系物。最后,指导方针,以优化LRIS其他植物物种提出了建议。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. 拟南芥 LRIS协议

注:该文是指“小”或“大”规模的实验。小规模的实验,如标记线的分析和组织学染色6,14,只需要少数样品。大规模的实验,如定量实时定量RT-PCR,微阵列9-11或RNA测序,需要样品的量越大。这样,的〜1000苗每个样品,使用由Vanneste 等人 11的量到根段的解剖后执行微阵列实验。

第1天

  1. 拟南芥种子消毒
    注意:选择的种子消毒以下步骤之一。它们中的任何适合的下一步骤的协议。气体灭菌(1.1.2)给出了消毒液(1.1.1)两个主要优点:它处理大量麻木的时候花费较少的时间种子呃,因为没有移液必须发生对单个样品;和灭菌的种子可以贮存更长的时间。但是,它需要一个干燥器和小心处理。
    1. 液体消毒
      1. 倾种子在微离心管的期望数量。在2 ml微离心管使用多达20毫克(〜800种子)在1.5ml管或40毫克(〜1600种子)。
      2. 加入1毫升70%的乙醇。反转或轻轻摇动2分钟。
      3. 更换70%的乙醇用1ml灭菌溶液15分钟。 (准备新鲜消毒液:3.85毫升次氯酸钠(次氯酸钠)股票(12%)(注意:使用通风橱),5微升吐温20,高达10毫升水倒置管几次,以确保所有的种子来。在与溶液接触。
      4. 在层流气流柜,替换用1ml无菌蒸馏水灭菌溶液和冲洗种子5次,每次5分钟,通过反复LY替换用1ml新鲜无菌蒸馏水。
    2. 气体消毒
      1. 倒在2 ml微离心管的种子的所需数目。有几个独立的线时,请使用单独的管子,并安排他们在一个塑料微型离心管中或支架打开。如果种子在一个管的数目超过500(12.5毫克),细分的种子在管的适当数量,以确保成功的灭菌。确保相邻的管帽不相互覆盖。配合在一起的盒子的盖子的底部,因为它需要在干燥器以及用于杀菌。
      2. 放置箱在碗干燥器的,以及一个玻璃烧杯(小心:使用通风柜)。
      3. (:使用通风柜小心)用100毫升12%的NaOCl填充该烧杯。放置在干燥器的盖子,但留下一个小孔,其中烧杯放置。
      4. 加入3毫升37%盐酸(发烟)(CAUTION:使用通风柜)的烧杯中通过小光圈和迅速关闭干燥器。该解决方案将泡了一段时间,由于氯2气的形成。离开系统封闭O / N(或至少8小时)。
      5. 除去干燥器的盖子。取出盒子的盖子盖上,避免在运输过程中受到污染。
      6. 把盒子中一个空气层流柜,取下盖子,并留下的种子进行约1小时,在室温,以允许气体释放。
        注意:种子可以安全地储存在干燥,密闭微离心管长达2周4℃。
  2. 侧根诱导拟南芥
    1. 侧根抑制(NPA处理)
      1. 准备在体外生长培养基。培养基含有半强度Murashige和Skoog盐混合物15,0.1 g / L的肌醇,10克/升蔗糖,和缓冲用0.5克/升2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)。
      2. 调节pH值至5.7使用1M KOH。添加植物组织琼脂8克/升和高压灭菌的培养基20分钟,在121℃。
      3. 准备新人民军的25毫米原液在二甲基亚砜(DMSO)(注意:使用手套)。在一个空气层流柜,冷却高压灭菌介质下降到约65℃(这是在该瓶子可以用手保持的温度),并添加25mM的NPA原液,得到10μM的NPA的终浓度。
      4. 轻轻摇动瓶子,持续10秒均质一旦加入。倾50毫升每平方培养皿介质(12厘米×12厘米)。
        注:如遇大规模的实验,应用尼龙网(20微米),以确保轻松传输。准备一个目(9厘米×9厘米)高压灭菌图1A)。当高压灭菌,应用网格,以使用无菌镊子图1B)的生长培养基中。用STE网格轻轻地推向生长培养基rilized drigalsky,以确保它是在与生长培养基图1B)的良好接触(注意:在无菌条件下工作)。
      5. 母猪在NPA-板的种子。
        注:如遇大规模的实验计划,母猪2致密,排列排50颗种子,以方便取样(见1.2.2.3)。
        1. 如果液体消毒,播种在用200微升吸管NPA-板的种子。切断3 - 为了4毫米的在无菌条件下(或尖端的灭菌前)的吸头端部,以便能够吸管种子。吸管上下几次重新悬浮的种子,然后吸管大约150微升无菌水,用10 - 20种子和等到种子沉积物在尖端的底部。 (注意:在无菌条件下工作)
          注意:当轻轻与尖端接触琼脂或网格,一滴水与种子将被从它图1C)释放。
        2. <li>在案件气体消毒,用高压灭菌toothpicks.Pinch牙签放入琼脂采取的种子,以保证表面发粘前播下种子。拿起使用牙签将种子逐个和分发的种子在平板上图1D)。或者,无菌水添加到种子,和母猪中1.2.1.5.1中描述(注意:工作在无菌条件下)。
      6. 密封与透气胶带将板在黑暗中存储它们板在4℃下至少2天,最大一周。这是必要的分层,并确保同步,并更有效的发芽。
        注意:可替换地,种子可以在播种前进行分层,浸渍在蒸馏水在微离心管中,其中需要较少的冰箱的空间。在这种情况下,储存管至少一周,在4℃,播种(见1.2.1.7)后,立即将板到生长室。
        第3天 移动板向生长室(连续光(110μE米-2 -1),21℃)5天(2天的发芽和生长的3天)在一个几乎垂直的位置(80到90度)以确保根生长上,而不是在介质。
        第八天
    2. 侧根感应(NAA处理)
      1. 在1.2.1.1和1.2.1.2所述准备相同的生长培养基。制备NAA的DMSO的50mM储备溶液(小心:使用手套)。冷却该高压灭菌介质下降到65℃,并添加NAA溶液在培养基中,以获得10微米的NAA的终浓度(注意:工作在无菌条件下)。
        1. 轻轻摇动瓶子,持续10秒均质一旦加入。倾50毫升每平方培养皿介质(12厘米×12厘米)。
      2. 从含有补充了10μM的NPA的那些SUP生长培养基平板转移苗执行完成与10μMNAA。
        1. 钩弯镊子的手臂下的幼苗子叶,轻轻地从板中删除。只有转移苗其根部增长完全与NPA-生长培养基,最好向下接触。
        2. 脱脂根在含有NAA的生长介质表面上一个小的距离。确保植物根与生长介质接触良好。如果需要的话,轻轻按下根部到生长培养基表面与镊子。
          注:如遇大规模的实验,删除不符合网和传输通过解除在网用镊子上部的两个角接触全苗。确保网格是在与含有NAA的培养基良好接触由掠过网格在琼脂表面上一个小的距离图1E)。
      3. 密封新板的透气胶带,并将其放置在生长室(CON连续的光(110μE米-2 -1),21℃)中进行诱导直到采样后的希望的时间一垂直位置。
        注意:如果一个大规模的实验中,使用解剖刀一次全部直接切根段上的网格和轻轻刮网的表面进行采样它们。

2. LRIS玉米协议

  1. 玉米籽粒分层
    1. 在黑暗中温育的玉米籽粒在4℃下至少1周。
      注:此协议一直使用B73玉米自交系发展。
  2. 玉米籽粒灭菌
    第1天
    注意:虽然玉米幼苗不必在无菌条件下将要生长,建议来灭菌的玉米籽粒并用无菌材料的工作,以防止在纸卷真菌生长系统。
    1. 放玉米核的必要数量在无菌玻璃烧杯中。
    2. 加入100毫升消毒液(6%次氯酸钠水溶液)(注意:使用通风橱)。
    3. 添加磁性搅拌棒并将该烧杯放在磁力搅拌器上以低搅拌速度(约250转)在RT 5分钟。
    4. 通过用100ml新鲜无菌水代替溶液冲洗五次5分钟。
  3. 播种玉米籽粒
    1. 戴上手套,以减少污染的危险性,并取纸巾卷。
    2. 撕下的手巾纸2延伸到两片(约92厘米×24厘米)的总长度,并把他们放在彼此顶部在清洁的表面( 图2A)。
    3. 折叠片材翻一番的长度(大约92厘米×12厘米)( 图2A)。
    4. 用镊子来自t相关的前10分发在内核约两厘米见方他的纸张整个长度,同时保持8厘米每个内核与8厘米之间的内空间自由两端图2B)。确保内核的胚根朝下且朝向纸( 图2B)。
    5. 轻轻摇动纸张上的长度,同时保持种子到位( 图2B)。为了便于滚动,它是可选的,以第一喷纸用无菌水。
    6. 把纸卷在大约6厘米直径和14厘米高度 (例如,加入250毫升离心管)灭菌玻璃管并将其放置在机架图2C)。
  4. 侧根诱导玉米
    1. 准备一个50毫米NPA储备液(溶于DMSO)(注意:使用手套)。
    2. 对于每个管,使50μM的NPA溶液中加入从50mM的NPA原液125微升至125毫升无菌水在无菌玻璃烧杯中。
    3. 搅拌均匀,倒入125个毫升50μM的NPA溶液在纸卷在管。纸卷将吸收的解决方案,并成为完全湿透。
      注意:当使用纸卷和管与其他尺寸,相应地调整音量。液体应达到中途的管,以确保有足够的摄取。
    4. 将纸卷系统在一个生长室三天(27℃,持续光照,相对湿度70%)。确保纸卷仍然通过增加额外的50微米的不良资产解决方案浸泡,由于溶液蒸发随着时间的推移( 图2D)。
      第4天
    5. 准备一个50毫米NAA储备液(溶于DMSO)(注意:使用手套)。
    6. 对于每个管中,加入从50毫萘乙酸库存125微升至125毫升无菌水在一灭菌的玻璃烧杯中制备50μM的萘乙酸溶液。
    7. 轻轻挤压了大部分剩余的不良资产解决方案从纸卷,然后将米在无菌水5分钟,以洗涤出来(小心:使用手套)。轻轻挤压出大部分的水从纸辊。重复此洗涤步骤三次。
    8. 搅拌均匀,倒在纸卷在管的50μMNAA的解决方案。确保它们完全浸透。
    9. 将纸卷系统中的生长室(27℃,持续光照,相对湿度70%)为诱导后所需的持续时间。
  5. 侧根诱导玉米不定冠根
    注:LRIS上述诱导侧根在主根。然而,在种植玉米等单子叶植物中,初生根和胚胎种子根,以及它们的侧根,是幼苗发育过程中主要是很重要的。在植物生长的稍后阶段,后胚胎不定根出现在杆和还开发侧根形成一个新的根系统 16。该LRIS也可使用D由下面的胚胎主根一些小的调整,LRIS促使这些胚胎后不定冠根侧根。
    1. 为了使纸卷,创建论文与两个分别在其外侧层的手巾纸,并萌发纸内的两个层的夹层。放置灭菌内核(见步骤2.1至2.2)在两片发芽纸之间。发芽纸相比,手巾纸,将是不容易通过根毛和侧根,这将使得纸张的开幕推出后更容易在穿透。另一方面,手毛巾纸的两个外层将有利于液体吸收。
    2. 将700毫升的玻璃试管辊和对他们倒无菌水,无不良资产。确保它们完全浸透。
    3. 在发芽生长柜中消毒内核(见步骤2.4.9)。
    4. 成长的幼苗,直到不定冠根开始出现(6天为B73)。确保纸辊由必要时加入无菌水保持湿润,在任何时候。
    5. 转移到4天(见步骤2.4.1至2.4.4)的25微米的NPA溶液,然后由一个类似的感应侧根开始的通过更换用清洗步骤之后的50微米的NAA溶液的NPA溶液(参见步骤2.4 0.5〜2.4.9)。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

执行侧根启动过程的LRIS中的应用比较转录

在LRIS的一个应用是在侧根形成不同物种的比较和基因表达谱的关系。比较转录方法创建查明参与了不同种类的侧根发育过程中的同源基因的可能性。侧根开始,它由从包含在一个已形成的根轴的细胞的子集形成一个新的器官,是由被子植物共享,以控制它们的根构造的主要机制。因此,很可能从它存在于一个共同的祖先现有途径和演变是保守整个进化过程。事实上,公共电位侧根引发监管部门一直在不同物种中发现<SUP> 17,18。

采样材料使用LRIS 拟南芥 玉米,和转录组分析

所述LRIS已经建立在两个不同的物种: 拟南芥和玉米10,13在这两个物种,决定只是NAA处理前采样的植物,并在诱导后不久,在开始时,或在生长素响应,如以及在的发作,或在中柱鞘的第一分歧。此外,荧光激活细胞分选19(FACS),使用拟南芥或玉米激光捕获显微镜20,21(LCM)来选择柱鞘细胞。 拟南芥中,2和6小时的时间点诱导后基于所述PDR5的转录表征:: GUS生长素应答和pCYCB1被选择1 :: GUS细胞周期标记线9(图3)。在玉米中,时间点2,3和诱导后4小时,细胞分裂活性的显微表征和几个细胞周期标记基因的表达,使用实时定量逆转录聚合酶链式反应(QRT-PCR)13的分析后挑选。 RNA从分离的细胞中提取并杂交于微阵列平台,如前所述10,13。

发现 拟南芥 CYCB1 的直系同源基因 1(AtCYCB1 1) 玉米

拟南芥中,所述标记线pCYCB1; 1 :: GUS已广泛应用于侧根开始期间跟踪中柱鞘的第一分歧。这种标记将是非常用玉米。 AtCYCB1的几个同源; 1被发现在玉米(www.maizesequence.org,所有肽,BLASTP,默认设置)。其中六人分别参加了在玉米LRIS后所执行的芯片和显示显著富集。最好的BLAST命中,GRMZM2G310115,表现出非常高的转录水平LRIS后,类似于所观察到拟南芥中为AtCYCB1; 1(图4)。

要检查单基因表达的LRIS中的应用

为了验证GRMZM2G310115作为AtCYCB1的一个很好的候选直系同源物; 1玉米侧根开始,实时定量RT-PCR检测在不同时间点拍摄的LRIS 13的过程中,进行样品。前N:如在上述方案中所述和收获在不同时间点的植物进行处理AA处理(NPA),和后2,3和4小时的NAA处理。此外,仅在水中生长的植物的材料,收获比较LRIS和中性状态之间的基因表达。收获后立即,对应于由5毫米和15毫米的根尖上述双目下进行解剖之间的区域根段。使用镊子,皮质从碑(其中包含中柱鞘)分离,RNA从两种组织萃取。进行代替的LCM最后这一步,因为它是更快速和便宜进行验证。使用以下各正向和反向的qRT-PCR引物,AGCAGGACGCAGTTGGAGAG和GAGCCGAGAGCACAGAAGAAAG,GRMZM2G310115被验证到被上调时LRIS,并且是特异于碑组织(图5)。此外,该实验表明,没有同步感应,侧根引发发生在一根在水中生长的离散事件是检测不到的,和说明本LRIS的需要以显示有关侧根起始过程差异基因表达。

图1
图1.侧根诱导系统的 拟南芥 (A)准备的尼龙网(20微米):切尼龙网(9厘米×9cm)中,把它包在铝箔并把它放在一个玻璃烧杯中进行高压灭菌。 (B)的应用尼龙网使用镊子的含NPA板(10μM)。然后使用无菌drigalski以消除气泡。 (C)上的尼龙播种网用吸管。 (D)上的尼龙播种网使用牙签。 (E)的转移尼龙筛网使用镊子一个含有NAA的板(10μM)。81 / 53481fig1large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2. 侧根诱导系统的玉米。   (A)中准备纸卷:代替两层纸(92厘米×24厘米,两片的长度)在彼此的顶部和折叠他们一倍的长度(92厘米×12厘米)。 二)把10消毒玉米籽粒的胚根朝下纸张为2厘米的顶部8厘米的interspacing。然后卷起的纸,而保持玉米籽粒到位。 (C)将在管的纸卷( 如250毫升离心管),并把它们放在机架中。 ( 四)壮大玉米幼苗三天在50微米NPA的解决方案(在27℃,持续光照,相对腐殖dity 70%)。 (E)左:只是转移到NAA之前苗;中东:刚刚转移到NAA和转让给NAA后第2天前横向切片机切片;右图 ​​:可见出现侧根转移到NAA后第5天苗请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3.侧根启动的刺激下经长期萘乙酸处理。(AF)时程表示在使用PDR5 :: GUS标志线的NAA处理的生长素应答。生长素响应,这是第一个事件触发侧根开始之一,启动NAA治疗开始后2小时。在上面板,整个幼苗的概况给出;较低的面板显示S在根尖的生长素应答。 (GM)的时间使用pCYCB1的NAA疗程; 1 :: GUS标志线。中GUS信号代表CYCB1的表达; 1基因,指示第一细胞分裂导致侧根形成的NAA治疗开始后开始6小时。在上面板,整个幼苗的概况给出;下图显示CYCB1;在根尖1的表达 (GUS染色根据Beeckman和恩格勒,1994年第22) 点击此处查看该图的放大版本。

图4
CYCB1 基因拟南芥 和玉米LRIS在 图4.表达谱   ( )AtCYCB1的芯片表达值; 1 LRIS过程中所描述的迪斯等人AtCYCB1的潜在的直向同源物的2008 10(B)的微阵列表达值;如由Jansen人的 1 LRIS期间。 2013 13 BLASTP得分是爆破AtCYCB1的蛋白质序列时所获得的评分 ; 1上的玉米基因组中。误差线表示标准偏差和**代表 P -值≤0.01。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5
GRMZM2G310115 图5 的表达及 玉米根系的LRIS在皮质的表达<EM> LRIS期间GRMZM2G310115玉米通过定量实时定量RT-PCR法对解剖碑和皮质样品进行评价。一份补充取样对生长在水草进行。值标准化为在水中的碑表达。误差线表示标准偏差和**(根据詹森等人 2013 13引物和参照基因)代表 P -值≤0.01。 请点击此处查看该图的放大版本。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

拟南芥 LRIS协议,它只能传输已经变得完全在与含NPA生长培养基接触的幼苗是重要的。这确保侧根开始被阻止在整个根长度。为了防止伤人传输过程中的小植株,弯曲钳子的臂能下的幼苗的子叶钩住。转让时,请确保幼苗根在与含NAA琼脂培养基充分接触。这可以通过掠过根在琼脂表面上一个小的距离来实现。这将确保一个有效的同步感应侧根萌生过的总根长。的根源可以种植没有他们的成长和侧根诱导产生负面影响曝光。

在玉米LRIS协议,重要的是内核的胚根朝下,朝向纸以确保根将增长ðownwards并附着在纸张在正确的侧面 16。 NPA后治疗3天,幼苗应该已经出现从内核用小拍,一个树根和种子根16。主根应大约长在进行侧根开始诱导前2厘米。此协议已被使用B73玉米自交系开发的,但在情况下具有不同的增长率玉米线,相应地调整温育时间。确保纸卷仍然通过增加定期50微米的不良资产解决方案时,液体蒸发随着时间的推移,否则NPA处理可能会发生低效率和不必要的早期侧根发育浸泡。系统本身可以防止根博览会的光,但光线并不是一个大问题,不会影响根系的生长和侧根的诱导。

替代方法为控制异步侧根都是使用的MEChanical弯曲23或 gravistimulation 24。这些系统的主要优点是,它们具有更“自然”的诱导相比,在LRIS激素治疗,但缺点是,它们在材料,可以在给定时间点收获量的限制,因为它们仅在较完整的感应在LRIS中柱鞘的每苗弯曲产生一个侧根起始事件。

拟南芥和玉米中使用的LRIS可以在多种植物中使用,虽然有利的条件需要优化。安装一个LRIS,两个重要的连续步骤必须实现:(1)阻断生长素运输和生长素(2)积累的以诱导侧根开始。生长系统应允许的化合物的有效和均匀的吸收和应允许幼苗良好发展。替代系统,固体介质( 拟南芥 )和纸卷(玉米),如液体培养,培,或aeroponics,可用于其它物种。在LRIS, 在第一阶段中,生长素运输的阻塞,可以通过添加生长素输送抑制剂来实现。虽然NPA导致侧根开始拟南芥和玉米,高效的块替代化合物,如2,3,5-三碘苯甲酸(TIBA) 对chlorophenoxyisobutyric酸(PCIB)可能会在其他物种更好地工作。类似的优化可以用于LRIS, 生长素治疗的第二步骤来完成。合成生长素NAA似乎是最适合用于LRIS。生长素前体吲哚-3-丁酸(IBA)可能是一个很好的选择,因为它也强烈诱导侧根和具有高的生物活性在不同的植物25,26。另一方面,天然生长素吲哚-3-乙酸(IAA)是不太稳定,更容易被代谢27,合理化根devel软件包的影响较弱例如玉米或稻25,26 opment中。合成生长素2,4-二氯苯氧乙酸(2,4D)累积高度在柱鞘细胞中,部分原因是因为它不是从细胞28导出的,损害适当侧根引发和诱导人工融合的结构。还其他化合物与生长素途径,如naxillin 12相互作用,已显示出诱导侧根开始在拟南芥和可以在其他物种进行测试。

在某些情况下,发芽是低效的NPA的存在下和一种可能选择第一发芽的种子在没有NPA,给幼苗随后转移到含NPA系统。这引起具有侧根感应有NAA和治疗,之前启动早侧根原基的可能的风险,因此,只进行采样期间的NPA的治疗,细长根部的区域是重要的。根据这一总体战略,一是笑ULD能够优化一个LRIS为几乎任何(种子)的植物,因此有一个简单的系统来研究侧根发育针对感兴趣的植物。侧根启始时间的进一步表征可通过标记线发生,例举拟南芥 。如果标记行是很难获得的,详细的组织学研究可以做,但这是费时和第一细胞分裂是不容易辨认。可替代地,细胞分裂标志物的表达分析可用于指示第一细胞分裂的定时。

该LRIS可用于不同的目的,例如转录组分析9-13,如在结果简要描述,以及组织学观察在侧根开始14在宏观和微观水平。不同类型的抽样,从机关到小区规模29,可能允许解开后的不同方面人生根。此外,LRIS可以用来监控不同化合物对侧根开始12,30的效果。最后,通过使用记者线,一个LRIS也可以用来在横向的基因表达和/或蛋白定位容易表征根系发育。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

作者什么都没有透露。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ARABIDOPSIS LRIS
Seeds
Arabidopsis seeds Col-0 ecotype
Gas sterilization of seeds
micro-centrifuge tubes 1.5 ml SIGMA-ALDRICH 0030 125.215 Eppendorf microtubes 3810X, PCR clean
micro-centrifuge tubes 2 ml SIGMA-ALDRICH 0030 120.094 Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes
hydrochloric acid Merck KGaA 1,003,171,000 37% (fuming) for analysis EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eu
glass desiccator SIGMA-ALDRICH Pyrex
glass beaker
plastic micro-centrifuge tubes box or holder
Bleach sterilization of seeds
ethanol Chem-Lab nv CL00.0505.1000 Ethanol, abs. 100% a.r. dilute to 70%
sodium hypochlorite (NaOCl) Carl Roth 9062.3 12%
Tween 20 SIGMA-ALDRICH P1379
sterile water
Growth medium
Murashige and Skoog salt mixture DUCHEFA Biochemie B.V. M0221-0050
myo-inositol SIGMA-ALDRICH I5125-100G
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) DUCHEFA Biochemie B.V. M1503.0100
sucrose VWR, Internation LLC 27483.294 D(+)-Sucrose Ph. Eur.
KOH Merck KGaA 1050211000 pellets for analysis (max. 0.002% Na) EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Plant Tissue Culture Agar LabM Limited MC029
Lateral root induction chemicals
N-1-naphthylphthalamic acid (NPA) DUCHEFA Biochemie B.V. No. N0926.0250 10 µM (Arabidopsis)
1-naphthalene acetic acid (NAA) DUCHEFA Biochemie B.V. No. N0903.0050 10 µM (Arabidopsis)
dimethylsulfoxide (DMSO) SIGMA-ALDRICH 494429-1L
Making a mesh for transfer
nylon mesh Prosep byba Synthetic nylon mesh 20 µm
Sowing and seedling handling
square petri dish plates GOSSELIN BP124-05 12 x 12 cm
50 ml DURAN tubes SIGMA-ALDRICH CLS430304 Corning 50 ml centrifuge tubes
drigalski Carl Roth K732.1
pipette
cut pipette tips Daslab 162001X Universal 200, cut off 5 mm of tip before autoclaving
breathable tape  3M Deutschland GmbH cat. no. 1530-1
tweezers Fiers nv/sa K342.1; K344.1 Dumont tweezers type a nr 5; Dumont tweezers type e nr 7
Growth conditions
growth room 21 °C, continuous light
Materials Company Catalog Comments
MAIZE LRIS
Seeds
Maize kernels B-73
Bleach sterilization of kernels
glass beaker
magnetic stirrer  Fiers nv/sa C267.1
sodium hypochlorite (NaOCl) Carl Roth 9062.3 12%
sterile water
Lateral root induction chemicals
N-1-naphthylphthalamic acid (NPA) DUCHEFA Biochemie B.V. No. N0926.0250 50 µM (maize primary root), 25 µM (maize adventitious root)
1-naphthalene acetic acid (NAA) DUCHEFA Biochemie B.V. No. N0903.0050 50 µM (maize)
dimethylsulfoxide (DMSO) SIGMA-ALDRICH 494429-1L
Sowing and seedling handling
paper hand towels Kimberly-Clark Professional* 6681 SCOTT Hand Towels - Roll / White; sheet size (24 x 46 cm)
seed germination paper Anchor Paper Company 10 X 15 38# seed germination paper
tweezers Fiers nv/sa K342.1; K344.1 Dumont tweezers type a nr 5; Dumont tweezers type e nr 7
250 ml (centrifuge) tubes SCHOTT DURAN 2160136 approx. 5.6 cm diameter and 14.7 cm height 
700 ml tubes DURAN GROUP 213994609 cylinders, round foot tube, D 60  x 250
rack for maize tubes, home made
sterile water
Growth conditions
growth cabinet 27 °C, continuous light, 70% relative humidity

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Van Norman, J. M., Xuan, W., Beeckman, T., Benfey, P. N. To branch or not to branch: the role of pre-patterning in lateral root formation. Development. 140, 4301-4310 (2013).
  2. Dolan, L., et al. Cellular organisation of the Arabidopsis thaliana root. Development. 119, 71-84 (1993).
  3. Bell, J. K., McCully, M. E. A histological study of lateral root initiation and development in Zea mays. Protoplasma. 70, 179-205 (1970).
  4. Benkova, E., et al. Local, efflux-dependent auxin gradients as a common module for plant organ formation. Cell. 115, 591-602 (2003).
  5. Beeckman, T., Burssens, S., Inzé, D. The peri-cell-cycle in Arabidopsis. J. Exp. Bot. 52, 403-411 (2001).
  6. Himanen, K., Boucheron, E., Vanneste, S., de Almeida Engler, J., Inzé, D., Beeckman, T. Auxin-mediated cell cycle activation during early lateral root initiation. Plant Cell. 14, 2339-2351 (2002).
  7. Jansen, L., Parizot, B., Beeckman, T. Inducible system for lateral roots in Arabidopsis thaliana and maize. Methods Mol Biol. 959, 149-158 (2013).
  8. Casimiro, I., et al. Auxin transport promotes Arabidopsis lateral root initiation. Plant Cell. 13, 843-852 (2001).
  9. Himanen, K., et al. Transcript profiling of early lateral root initiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 5146-5151 (2004).
  10. De Smet, I., et al. Receptor-like kinase ACR4 restricts formative cell divisions in the Arabidopsis root. Science. 322, 594-597 (2008).
  11. Vanneste, S., et al. Cell cycle progression in the pericycle is not sufficient for SOLITARY ROOT/IAA14-mediated lateral root initiation in Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 17, 3035-3050 (2005).
  12. De Rybel, B., et al. A role for the root cap in root branching revealed by the non-auxin probe naxillin. Nat. Chem. Biol. 8, 798-805 (2012).
  13. Jansen, L., et al. Comparative transcriptomics as a tool for the identification of root branching genes in maize. Plant Biotechnol. J. 11, 1092-1102 (2013).
  14. Parizot, B., et al. Diarch symmetry of the vascular bundle in Arabidopsis root encompasses the pericycle and is reflected in distich lateral root initiation. Plant Physiol. 146, 140-148 (2008).
  15. Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15, 473-497 (1962).
  16. Bellini, C., Pacurar, D. I., Perrone, I. Adventitious roots and lateral roots: similarities and differences. Annu Rev Plant Biol. 65, 639-666 (2014).
  17. Grunewald, W., Parizot, B., Inzé, D., Gheysen, G., Beeckman, T. Developmental biology of roots: One common pathway for all angiosperms? Int. J. Plant Dev. Biol. 1, 212-225 (2007).
  18. Parizot, B., Beeckman, T. Genomics of root development. Root Genomics and Soil Interactions. Crespi, M. 3-28 (2012).
  19. Bargmann, B. O., Birnbaum, K. D. Fluorescence activated cell sorting of plant protoplasts. Journal of visualized experiments : JoVE. (2010).
  20. Nakazono, M., Qiu, F., Borsuk, L. A., Schnable, P. S. Laser-capture microdissection, a tool for the global analysis of gene expression in specific plant cell types: identification of genes expressed differentially in epidermal cells or vascular tissues of maize. Plant Cell. 15, 583-596 (2003).
  21. Ludwig, Y., Hochholdinger, F. Laser microdissection of plant cells. Methods Mol Biol. 1080, 249-258 (2014).
  22. Beeckman, T., Engler, G. An easy technique for the clearing of histochemically stained plant tissue. Plant Mol. Biol. Rep. 12, 37-42 (1994).
  23. Ditengou, F. A., et al. Mechanical induction of lateral root initiation in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18818-18823 (2008).
  24. Lucas, M., Godin, C., Jay-Allemand, C., Laplaze, L. Auxin fluxes in the root apex co-regulate gravitropism and lateral root initiation. J. Exp. Bot. 59, 55-66 (2008).
  25. Wang, S., Taketa, S., Ichii, M., Xu, L., Xia, K., Zhou, X. Lateral root formation in rice (Oryza Sativa. L.): differential effects of indole-3-acetic acid and indole-3-butyric acid. Plant Growth Regul. 41, 41-47 (2003).
  26. Martinez-de la Cruz, E., Garcia-Ramirez, E., Vazquez-Ramos, J. M., Reyes de la Cruz, H., Lopez-Bucio, J. Auxins differentially regulate root system architecture and cell cycle protein levels in maize seedlings. J Plant Physiol. 176, 147-156 (2015).
  27. Beyer, E. M., Morgan, P. W. Effect of ethylene on uptake, distribution, and metabolism of indoleacetic acid-1-14C and -2-14C and naphthaleneacetic acid-1-14C. Plant Physiol. 46, 157-162 (1970).
  28. Delbarre, A., Muller, P., Imhoff, V., Guern, J. Comparison of mechanisms controlling uptake and accumulation of 2,4-dichlorophenoxy acetic acid, naphthalene-1-acetic acid, and indole-3-acetic acid in suspension-cultured tobacco cells. Planta. 198, 532-541 (1996).
  29. Bailey-Serres, J. Microgenomics: genome-scale, cell-specific monitoring of multiple gene regulation tiers. Annu Rev Plant Biol. 64, 293-325 (2013).
  30. Perez-Torres, C. A., et al. Phosphate availability alters lateral root development in Arabidopsis by modulating auxin sensitivity via a mechanism involving the TIR1 auxin receptor. Plant Cell. 20, 3258-3272 (2008).
侧根诱导系统<em&gt;拟南芥</em&gt;和玉米
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Crombez, H., Roberts, I., Vangheluwe, N., Motte, H., Jansen, L., Beeckman, T., Parizot, B. Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize. J. Vis. Exp. (107), e53481, doi:10.3791/53481 (2016).More

Crombez, H., Roberts, I., Vangheluwe, N., Motte, H., Jansen, L., Beeckman, T., Parizot, B. Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize. J. Vis. Exp. (107), e53481, doi:10.3791/53481 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter