Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

قمي استئصال نموذج الفأر لدراسة المبكر الثدييات تجديد القلب

Published: January 23, 2016 doi: 10.3791/53488
Automatic Translation
1, 2
1Center for Molecular Medicine, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2State Key Laboratory for Agrobiotechnology, College of Biological Science, China Agricultural University

Abstract

أمراض القلب والأوعية الدموية يصيب العالم كله بسبب تغيير نمط الحياة المركزة. تجديد القلب يحمل وعودا كبيرة لإصلاح وترميم العضلية التي فقدت بسبب الاصابة والمرض. وعلى النقيض من تجديد القلب القوي لبعض الفقاريات الدنيا، تظهر قلوب الثدييات الكبار عادة القدرة الحد الأدنى لتجديد القلب والإصلاح. ومع ذلك، فقد أثار الدراسات الحديثة أهمية علمية كبيرة مع النتيجة أنه بين يوم بعد الولادة 1-7 (P1 إلى P7)، يحتفظ قلب الفأر حديثي الولادة إمكانات التجدد كبيرة بعد استئصال القمي (أي بتر جراحية وتعرض اليسرى قمة البطين). واحد جدل كبير على هذا الاستنتاج قد يكون راجعا إلى الإجراءات المتعلقة جراحة المتنوعة المستخدمة في الجهود الرامية إلى تكرار أو توسيع بناء على هذه النتائج الهامة. هذه التعليمات يعرض حيوي المواد ومنهجية لاستئصال القمي في نموذج الفأر. الخطوات البارزة لهذه القوارض بقاؤهعملية جراحية ل تنطوي التخدير انخفاض حرارة الجسم، بضع الصدر، البتر الجراحي للبطين القلب قمة، وخياطة والانتعاش من الفئران. النهج الموصوف يمكن توسيع تطبيق استئصال نموذج الفأر القمي للأبحاث القلب والأوعية الدموية.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب الماوس عن طريق رعاية الحيوان واستخدام البرنامج في المعاهد الوطنية للصحة (NIH) مع عدد بروتوكول H0083R3. وافق NHLBI IACUC البروتوكول دون مسكنات.

1. انخفاض حرارة الجسم التخدير في الفئران حديثي الولادة

  1. تطهير اسفنجات والمعدات الجراحية في الأوتوكلاف قبل الجراحة. إعداد جميع المواد الجراحية والتبديل على الساخن حبة تعقيم 15-20 دقيقة مقدما لتصل إلى 240 درجة مئوية إلى 270 درجة مئوية.
  2. نقل جميع C57BL / 6 الجراء (P1 العمر) من الأم المرضعة لقفص الماوس نظيفة مع الفراش الطازجة والمواد التعشيش. مرة واحدة يتم اتخاذ الجراء إلى غرفة الجراحة، إجراء الجراحة قمي على وجه السرعة للحد من وقتهم أمضى فصل من الأم ويقلل من خطر التفكيك الأمهات.
  3. وضع الاسفنج على السرير الجليد ومن ثم وضع الجرو واحد على الاسفنجة الخاصة ب ~ 3 دقائق لتحقيق التخدير انخفاض حرارة الجسم. تأكيد التخدير عن طريق مراقبة ا ف بوكالة الطاقة النووية وتعذر الحركة ومعسر القدم الخلفية. التحقق من حالة حديثي الولادة في كثير من الأحيان لأن القليل جدا من الوقت لا تجعل تعذر الحركة الجرو وانقطاع التنفس، ومدة زائدة من التخدير يمكن أن تقلل من معدل البقاء على قيد الحياة 12.

2. بضع الصدر

  1. نقل الجرو من السرير الجليد إلى منطقة الفوق الجراحية واستخدام الشريط لشل في الذراعين والساقين، والذيل في موقف ضعيف.
  2. تطهير الصدر باستخدام betadine وتنظيفه باستخدام 70٪ وسادة الإعدادية الكحول بلطف.
  3. جعل شق الجلد عرضية على طول المنطقة بين الضلوع عليها من تجويف الصدر باستخدام Vannas الربيع مقص، ثم فظة تشريح العضلات الوربية عليها لتسهيل الوصول إلى القلب.
    ملاحظة: معدلات البقاء تتحسن عندما يتم تصغير فقدان الدم أثناء عملية جراحية.

3. البتر الجراحي للقلب بطيني أبيكس

  1. من جهة، وتطبيق الضغط بلطف على البطن إلى الداخل للظاهر للقمة القلب. امتصاص الدم في جميع أنحاء منطقة العمليات الجراحية مع تطبيقها ذات الرؤوس القطن المعقم لتصور واضح. لحديثي الولادة السيطرة الشام التي تديرها، الانتقال مباشرة إلى الخطوة 4 (خياطة واسترداد الفئران).
  2. تحت مصباح المكبرة واستخدام قطع القزحية مقص، نفذ بلطف استئصال تدريجي من البطين الأيسر (LV) حتى يتم كشفها غرفة LV. كن حذرا للحد من أجزاء مقطوعة من LV. ما يقرب من 15٪ استئصال ضروري لتحقيق التعرض الأمثل للغرفة LV.
  3. تأكد من أن القلب يعود إلى تجويف الصدر مرة واحدة يتعرض غرفة LV.

4. خياطة والاسترداد من الفئران

  1. خياطة الأضلاع والعضلات معا لختم تجويف الصدر باستخدام العقيمة الغرز البرولين 6-0، ثم قم بإغلاق بعناية باستخدام الغراء الجلد موقع شق الجلد.
  2. تدفئة الوليد تحت مصباح الحرارة ل~ 3 دقائق للانتعاش، ومن ثم تنظيف آثار الدماء والغراء باستخدام 70٪ وسادة الإعدادية الكحول befoإعادة إعادة تقديم لتتزاحم فيها. في محاولة لاستكمال العملية الجراحية كله في غضون 10 دقيقة لتقليل الوقت الذي يقضيه فصلها عن الأم يحسن البقاء على قيد الحياة الجرو بعد استئصال القمي.
  3. بعد كل جراحة، وضع الأدوات الجراحية في اتصال مع حبات من حبة تعقيم الساخن لمدة حوالي 20 ثانية لتعقيم كامل. السماح للأدوات الجراحية لتبريد لRT قبل كل عملية جراحية.
  4. بعد الانتهاء من العمليات الجراحية لجميع الجراء في القمامة، مزيج من الجراء مع أغطية فراش الأم والبراز قبل إعادتهم إلى عش الأم.
    ملاحظة: عموما، ICR / CD-1 الفئران هي أفضل الحاضنة الأمهات من C57BL / 6، ولكن حتى بين النساء المرضعات من نفس الخلفية الوراثية، وتختلف الغرائز تعزيز. إذا تغير الأم المرضعة من الضروري خفض معدل وفيات الأمهات عن طريق الإبدال، وإزالة الجراء P0 إلى الأم المرضعة ثم قم بإجراء استئصال القمي في P1. القيام بأي عملية صورية أو ص القمي فقطesection في لتر واحد من الجراء، لأن خلط الشام والجراء الجراحية يمكن أن تقلل من معدلات البقاء على قيد الحياة من المجموعة الجراحية من الجراء 6.

5. تحليل ما بعد الجراحة

  1. بعد يوم واحد من عملية جراحية، ومراقبة الجراء، تأكد من أنه لا يوجد فرق بين الشام والمجموعات الجراحية، والاعتماد على عدد من الجراء لقياس معدل البقاء على قيد الحياة. إذا تم إجراء العمليات الجراحية بشكل صحيح، يجب أن تكون معدلات البقاء على قيد الحياة مماثل، وأكثر من 60٪ في كل من الشام والمجموعات الجراحية.
  2. عزلة القلب والتثبيت.
    1. الموت ببطء الجراء في أيام 1 و 2 بعد الجراحة عن طريق قطع الرأس واليوم 21 بعد الجراحة التي كتبها CO2 مع ضمان الموت خلع عنق الرحم، ثم تنظيف الصدر باستخدام 70٪ الإعدادية الكحول.
    2. شق الجلد خط الوسط وعضلات الصدر ثم فتح الصدر.
    3. استئصال قلوب كامل من التجويف الصدري وإصلاح القلب كامل من كل عينة في 5 مل من 4٪ لامتصاص العرق O / N في RT.
  3. في اليوم التالي، ونقل العينات إلى 70٪ من الإيثانول. ويمكن تخزين العينات لمدة أسبوع قبل البارافين التضمين.
  4. شريحة أقسام البارافين 5 ميكرون سميكة من خلال البطين كامل وأداء الهيماتوكسيلين القياسية ويوزين (H & E) وماسون ثلاثي الألوان تلطيخ لدراسة استجابة التجدد 5 و 7. وعلى وجه التحديد، يتم استخدام H & E صمة عار لدراسة استبدال العضلات ويستخدم ماسون ثلاثي الألوان وصمة عار لدراسة ردود تليفي 5.
  5. حدد مجال الاهتمام وانشاء ثلاثة على الأقل بؤر لكل عينة يدويا باستخدام ماسح ضوئي الشريحة. صورة وتحليل الشرائح تلطيخ في 40 × التكبير وفقا لتعليمات الشركة الصانعة مع المعلمات الافتراضية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الموت الرحيم كانت الجراء الماوس 1 و 2 و 21 يوما استئصال ما بعد القمي، وجمعت قلوبهم لH & E وماسون ثلاثي الألوان وصمة عار. اللون الأزرق في ماسون ثلاثي الألوان وصمة عار يشير إلى ترسب النخابية المصفوفة خارج الخلية 5. مع نجاح استئصال القمي، تتشكل جلطة الدم بشكل فعال لختم LV يوم واحد استئصال ما بعد القمي، كما هو مبين في الشكل 1A. ويلاحظ وجود ارتشاف التدريجي لتجلط الدم وتليف القلب في وقت مبكر، والاستعاضة عنها أنسجة عضلة القلب يحدث حتى تجديد كامل للعضلة القلب يأخذ مكان 21 يوما بعد استئصال القمي (1B الشكل وC). ويظهر التحليل الصرفي لا فرق بين قلوب مقطوعة والشام التي تديرها في 21 يوما بعد العملية الجراحية (الشكل 1C وD).

الشكل 1
الشكل 1. الممثل H & E وللماسونثلاثي الألوان وصمة عار. عضلة القلب البطيني من قلوب الماوس حديثي الولادة 1 (A)، 2 (B)، أو 21 (C) أيام بعد استئصال القمي و 21 يوما بعد عملية صورية (D). لكل subfigure، شريط حجم اللوحة اليسرى هو 1 مم وشريط حجم اللوحة اليمنى هو 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

رعيت رسوم النشر لهذه المادة عن طريق هدية من أدوات العلوم الجميلة الدكتور جيان هوى.

Acknowledgments

الكتاب أشكر الدكاترة. جيمس هوكينز، زو شي يو وشوان تشو من الوطني للقلب والرئة والدم المعهد (NHLBI) لمساعدتها مع جراحة الماوس وإعداد وتلطيخ أقسام البارافين. المؤلفون ممتنون لهيئة التحرير NIH الزملاء للمساعدة التحريرية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors, 1.5 mm Fine Science Tools 12002-12
Vannas Spring Scissors - 2 mm Cutting Edge Fine Science Tools 15000-03 Iridectomy scissors
Hot Bead Sterilizer Fine Science Tools 18000-45
Iris Forceps, Straight, Serrated Fine Science Tools 11064-07
Iris Forceps, Curved, Serrated Fine Science Tools 11065-07
Shea Scissors - Curved/Blunt-Blunt/12cm Fine Science Tools 14105-12
Round Handled Suture Tying Forceps, Straight Fine Science Tools 18025-12
Round Handled Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15400-12
Fine Hemostat Fine Science Tools 13007-12
Magnifying Lamp Luxolamp Corp IM120 
Heating lamp Brandt Equipment llc 51152/3
6-0 Prolene sutures Ethicon 8889H
Skin glue-Vetbond Tissue Adhesive  3M  1469
Sterile Cotton Tipped Applicators Dynarex 4305
WEBCOL Alcohol Prep Pad Covidien 6818 Medium 2 PLY, 200/BOX, Satured with 70% Isopropyl Alcohol
Curity All Purpose Sponges Covidien 9024 Non-woven 4 PLY, 4"x4" (10.2cm×10.2cm)
Bench top protector sheet KIMTECH SCIENCE 7546 18" x 19.5" (45.72cm x 49.53cm) x 50
0.9% Sodium Chloride, 250ml Hospira Inc. NDC 0409-6138-22
Betadine Solution Swabsticks Purdue Products L.P. NDC 67618-153-03
Autoclave TOMY Digital Biology SX-700 HIGH-PRESSURE STEAM STERILIZER
Slide scanner HAMAMATSU NanoZoomer 2.0-RS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6, 231-239 (2014).
  2. Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 14, 529-541 (2013).
  3. Mahmoud, A. I., Porrello, E. R. Turning back the cardiac regenerative clock: lessons from the neonate. Trends Cardiovasc Med. 22, 128-133 (2012).
  4. Porrello, E. R., Olson, E. N. A neonatal blueprint for cardiac regeneration. Stem Cell Res. 13, 556-570 (2014).
  5. Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
  6. Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nat Protoc. 9, 305-311 (2014).
  7. Allen, T. C. Armed Forces Institute of Pathology. Hematoxylin and eosin. Laboratory methods in Histotechnology. Prophet, E. B., Mills, B., Arrington, J. B., Sobin, L. H. , American Registry of Pathology. Washington DC. 53-58 (1992).
  8. Andersen, D. C., Ganesalingam, S., Jensen, C. H., Sheikh, S. P. Do neonatal mouse hearts regenerate following heart apex resection? Stem cell reports. 2, 406-413 (2014).
  9. Kotlikoff, M. I., Hesse, M., Fleischmann, B. K. Comment on 'Do neonatal mouse hearts regenerate following heart apex resection?'. Stem cell reports. 3, 2 (2014).
  10. Sadek, H. A., et al. Multi-investigator letter on reproducibility of neonatal heart regeneration following apical resection. Stem cell reports. 3, 1 (2014).
  11. Andersen, D. C., Jensen, C. H., Sheikh, S. P., et al. Response to Sadek et al. and Kotlikoff et al. Stem cell reports. 3, 3-4 (2014).
  12. Phifer, C. B., Terry, L. M. Use of hypothermia for general anesthesia in preweanling rodents. Physiol Behav. 38, 887-890 (1986).
  13. Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat Biotechnol. 23, 845-856 (2005).
  14. Laflamme, M. A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. , 326-335 (2011).
  15. Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 13380-13385 (2012).
  16. Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).

Tags

الطب، العدد 107، تجديد القلب، بتر القمي، جراحة البقاء على قيد الحياة، وأمراض القلب، نموذج الفأر والتخدير انخفاض حرارة الجسم، والماوس حديثي الولادة، cardiomyocyte
قمي استئصال نموذج الفأر لدراسة المبكر الثدييات تجديد القلب
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiong, J., Hou, J. Apical Resection… More

Xiong, J., Hou, J. Apical Resection Mouse Model to Study Early Mammalian Heart Regeneration. J. Vis. Exp. (107), e53488, doi:10.3791/53488 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter