Abstract
心脑血管疾病困扰着整个世界，由于密集的生活方式的改变。心脏再生持有修复和恢复因受伤和疾病失去了心肌巨大潜力。相反，某些低等脊椎动物的强劲心脏再生，成年哺乳动物心脏通常显示为心脏的再生和修复能力最低。然而，最近的研究已经引起了相当大的科学兴趣地注意到，产后天之间1〜7（P1到P7），新生小鼠心脏保留显著再生潜能根尖切除术（ 即 ，手术截肢和左心室心尖曝光）后的发现。超过这一发现一个主要的争论可能是由于不同的手术相关的程序中的努力来复制或扩大在此重要的发现使用。这些指令动态地呈现材料和方法根尖切除的小鼠模型。其显着的步骤该啮齿动物surviva的升手术涉及低温麻醉，开胸，心脏心室心尖手术截肢，缝合和老鼠的恢复。描述可以扩大根尖切除的小鼠模型的心血管研究的应用程序的方法。
Protocol
所有小鼠实验用协议号H0083R3批准的动物护理和使用计划，在美国国立卫生研究院（NIH）。本NHLBI IACUC认可无镇痛药的协议。
1.低温麻醉新生小鼠
- 手术前消毒海绵和手术设备中的高压釜中。准备所有的手术材料和在加热珠灭菌15-20分钟切换提前达到240℃至270℃。
- 传输所有C57BL / 6幼鼠（年龄P1）从哺乳的母亲到一个干净的鼠笼新鲜的床上用品和筑巢的材料。一旦幼仔取入手术室，迅速地进行根尖手术，以减少他们的花费的时间从母亲分离并降低产妇拆的风险。
- 将海绵在冰床上，然后将一只小狗在海绵〜3分钟，实现低温麻醉。通过观察AP确认麻醉NEA和运动不能和捏一个后脚。检查新生儿的状态经常因为时间太少不会让小狗动性和呼吸暂停，和麻醉的时间过多会降低成活率12。
2.开胸
- 传送从冰床的小狗到外科台式区域，使用胶带来固定其手臂，腿和尾部在仰卧位置。
- 消毒胸部用聚维酮碘，轻轻地用70％酒精消毒片进行清洁。
- 做一个横向的皮肤切口，沿胸腔使用Vannas弹簧剪刀脚的第四肋间区域，然后生硬剖析第四肋间肌肉，以方便进入心脏。
注：生存率提高时，在手术过程中尽量减少失血。
心脏心室心尖3.手术截肢
- 用手，轻轻涂抹于腹部压力exteriorize的顶点的心脏。吸收周围的血用无菌棉签涂抹清晰的可视化手术区。对于假手术对照新生儿，直接进入步骤4（缝合和恢复小鼠）。
- 在放大镜灯，并使用虹膜切除术剪刀，直到低压室暴露轻轻地进行零碎切除左心室（LV）的。要小心，尽量减少LV的切除部分。大约15％的切除是必要实现低压室的最佳曝光。
- 确保心脏返回到胸腔，一旦低压室暴露。
4.缝合和小鼠恢复
- 缝合肋和肌肉一起使用无菌脯氨酸6-0缝线以密封胸腔，然后用皮胶小心关闭皮肤切口部位。
- 暖新生儿下为〜3分钟为恢复一加热灯，然后用70％的酒精消毒片befo清洁血液和胶的痕迹重新它重新引入到其同窝。尝试完成整个手术过程在10分钟内，因为减少花费从母体分离的时间，从而提高根尖切除后的小狗存活。
- 以下各手术中，将手术工具与热珠灭菌的珠子接触，用于完全灭菌约20秒。允许外科工具，以各术前冷却至室温。
- 完成手术的所有幼仔在产仔后，他们回到母亲的窝前将与母亲的床上用品和排泄物的幼崽。
注：一般情况下，ICR / CD-1小鼠是更好的养母不是C57BL / 6，但即使在相同的遗传背景的乳母，促进本能而有所不同。如果改变一个哺乳的母亲需要通过母体拆，以减少死亡率，取出P0幼崽哺乳的母亲，然后在P1进行根尖切除术。只有执行下列任一假手术或根尖řesection于幼崽一窝，因为混合假和手术的幼崽可以降低手术组幼崽6的存活率。
5.后外科分析
- 手术后的第二天，监视幼崽，确保有假和手术组间无差异，并计算幼仔的数量来衡量的存活率。如果手术被适当地进行时，存活率应当是在两个假和手术组中是相似和大于60％。
- 心脏隔离和固定。
- 安乐死的幼崽在天1，并通过斩首和21日手术后2术后通过CO2的死亡颈椎脱位的保证，然后用70％的酒精准备擦拭胸部。
- 切开胸部正中线皮肤和肌肉，然后打开箱子。
- 消费税从胸腔整个心灵和修复5毫升4％多聚甲醛O / N在室温每个样本的整个心脏。
- 在第二天，转样本以70％的乙醇。样品可以存储最多一周石蜡包埋之前。
- 片通过整个心室5-μm厚的石蜡切片，进行标准苏木精和曙红（H＆E）和Masson三色染色以检查再生反应5,7，具体而言，H＆E染色用于检查肌肉更换和马松三色染色用于研究纤维化反应5。
- 选择感兴趣的区域，并设置了每个样品的至少三个焦点手动使用的滑动扫描器。图像，并根据制造商的使用默认参数的指令分析染色载玻片在40×放大率。
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Representative Results
乳鼠被安乐死1，2，和21天后根尖切除术，并收集了H＆E和马尾松的三色染色他们的心。蓝色在马松三色染色表示心外膜细胞外基质5的沉积。与成功的根尖切除，血块被有效地形成，以密封的LV之一天后根尖切除， 如图1A。血凝块和早期心脏纤维化的逐渐再吸收观察，并代之以心肌组织发生直到心肌完全再生发生21天根尖切除后（图1B 和C）。形态学分析表明21天手术后（图1C 和D）切除和假手术的心之间没有差别。
图1.代表H＆E和马尾松的三色染色，新生小鼠心脏1（A），2（B），或根尖切除术后21（C）天，假手术（D）后21天心肌。对于每个子图中，左侧面板的比例尺为1毫米，右面板的比例尺为100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Disclosures
本文的出版费用由精细的科学工具的礼物，侯健博士进行了赞助。
Acknowledgments
作者感谢博士。詹姆斯·霍金斯，祖熙玉和禤去从国家心脏，肺和血液研究所（NHLBI）为他们的鼠标手术准备和石蜡切片染色的援助。作者感谢美国国立卫生研究院研究员编委会的编辑协助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors, 1.5 mm | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Vannas Spring Scissors - 2 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-03 | Iridectomy scissors |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Iris Forceps, Straight, Serrated | Fine Science Tools | 11064-07 | |
| Iris Forceps, Curved, Serrated | Fine Science Tools | 11065-07 | |
| Shea Scissors - Curved/Blunt-Blunt/12cm | Fine Science Tools | 14105-12 | |
| Round Handled Suture Tying Forceps, Straight | Fine Science Tools | 18025-12 | |
| Round Handled Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15400-12 | |
| Fine Hemostat | Fine Science Tools | 13007-12 | |
| Magnifying Lamp | Luxolamp Corp | IM120 | |
| Heating lamp | Brandt Equipment llc | 51152/3 | |
| 6-0 Prolene sutures | Ethicon | 8889H | |
| Skin glue-Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Dynarex | 4305 | |
| WEBCOL Alcohol Prep Pad | Covidien | 6818 | Medium 2 PLY, 200/BOX, Satured with 70% Isopropyl Alcohol |
| Curity All Purpose Sponges | Covidien | 9024 | Non-woven 4 PLY, 4"x4" (10.2cm×10.2cm) |
| Bench top protector sheet | KIMTECH SCIENCE | 7546 | 18" x 19.5" (45.72cm x 49.53cm) x 50 |
| 0.9% Sodium Chloride, 250ml | Hospira Inc. | NDC 0409-6138-22 | |
| Betadine Solution Swabsticks | Purdue Products L.P. | NDC 67618-153-03 | |
| Autoclave | TOMY Digital Biology | SX-700 | HIGH-PRESSURE STEAM STERILIZER |
| Slide scanner | HAMAMATSU | NanoZoomer 2.0-RS |
References
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