Abstract
심혈관 질환으로 인해 집중적 인 생활 습관의 변화로 전 세계를 재앙. 심장 재생은 수리 인한 부상과 질병에 손실 심근 세포를 복원하는 큰 약속을 보유하고있다. 특정 낮은 척추 동물의 강력한 심장 재생과는 달리, 성인 포유류의 마음은 일반적으로 심장 재생 및 수리를위한 최소한의 용량을 보여줍니다. 그러나, 최근의 연구 (P7에 P1) 1-7 출생 후의 일 사이에, 신생아 마우스 마음이 혀끝의 절제 (즉, 수술 절단 및 좌심실 정점의 노출) 후 상당한 회생 가능성을 유지, 연구 결과와 상당한 과학적 관심을 촉발했다. 이 발견을 통해 하나의 주요 논쟁은 복제하거나이 중요한 발견에 확장하기위한 노력에 사용되는 다양한 수술 관련 절차로 인해 수 있습니다. 이 지침은 동적으로 마우스 모델에서 혀끝의 절제에 대한 자료와 방법론을 제시한다. 이 설치류 surviva의 두드러진 단계L 수술은 저체온 마취, 개흉술, 심장 심실 정점의 수술 절단 및 봉합와 마우스의 회복을 포함한다. 심장 혈관 연구를위한 치근단 절제술 마우스 모델의 응용 프로그램을 확장 할 수 설명하는 방법.
Protocol
모든 마우스 실험 프로토콜 번호 H0083R3와 국립 보건원 (NIH)의 동물 관리 및 사용 프로그램에 의해 승인되었다. NHLBI IACUC는 진통제없이 프로토콜을 승인했다.
신생아 마우스 1. 저체온 마취
- 수술 전에 오토 클레이브 스폰지 및 수술 장비 소독. 모든 수술 재료를 준비하고 270 ° C에 240 ° C에 도달하기 위해 사전에 뜨거운 구슬 살균기 15 ~ 20 분에 전환합니다.
- 신선한 침구와 중첩 재료와 깨끗한 마우스 케이지에 자신의 간호 어머니의 모든 C57BL / 6 새끼 (연령 P1)를 전송합니다. 새끼는 수술 방으로 촬영하면, 자신의 시간은 어머니로부터 분리 된 시간에 산모 잠식의 위험을 줄이기 위해 최소화하기 위해 신속하게 혀끝 수술을 수행합니다.
- 얼음 침대에 스폰지를 넣고 2 ~ 3 분 저체온 마취를 달성하기 위해 다음 스펀지에 한 강아지를 놓습니다. AP를 관찰하여 마취를 확인NEA와 무 운동과 후방 발을 곤란. 너무 적은 시간이 강아지의 무 운동성 및 apneic 및 생존율 (12)을 낮출 수 마취의 과도 기간을 확인하지 않습니다 자주하기 때문에 신생아의 상태를 확인합니다.
2. 개흉술
- 수술 벤치 탑 지역에 얼음 침대에서 강아지를 전송하고 앙와위에서의 팔, 다리, 꼬리를 고정하는 테이프를 사용합니다.
- betadine을 사용하여 가슴을 소독하고 부드럽게 70 % 알코올 준비 패드를 사용하여 청소합니다.
- 스프링 Vannas 가위를 사용 흉강의 항 늑간 영역을 따라 횡 피부 절개를하고 심장에 대한 액세스를 용이하게하기 위해 기재된 늑간 근육을 무디게 절개.
참고 : 혈액 손실이 수술 과정에서 최소화 될 때 생존율을 향상시킬 수 있습니다.
심장 심실 에이펙스 3. 수술 절단 수술
- 손으로 부드럽게를 외면 화하다하기 위해 복부에 압력을가마음의 정점. 명확한 시각화를위한 멸균 면봉 어플리케이터와 외과 영역의 주위에 피를 흡수한다. 가짜 운영 제어 신생아의 경우, 4 (봉합 및 마우스의 복구) 단계로 직접 진행합니다.
- 돋보기 램프와 가위를 사용하여 홍채 절제술에서 부드럽게 LV 실이 노출 될 때까지 좌심실 (LV)의 단편적인 절제술을 수행합니다. LV의 절제 부분을 최소화하기 위해주의해야합니다. 약 15 %의 절제는 LV 챔버의 최적의 노출을 달성 할 필요가있다.
- LV 실이 노출되면 심장이 흉강에 반환해야합니다.
4. 봉합 및 마우스의 복구
- 멸균 프롤린 6-0 봉합사를 사용 흉강을 함께 밀봉 립과 근육을 봉합 한 후 조심스럽게 피부 접착제를 이용하여 피부 절개 부위를 닫는다.
- 복구 ~ 3 분 동안 가열 램프하에 신생아를 따뜻하게 한 후 70 % 알코올을 준비 사이클로 작업하기 전에 패드를 사용하여 혈액과 접착제 흔적을 깨끗하게그 한배 새끼에 재 소개 재. 어머니로부터 분리 소요되는 시간을 최소화하는 것이 치근단 절제술 후 강아지의 생존을 향상하기 때문에 10 분 이내에 전체 수술 절차를 완료하려고합니다.
- 각각의 수술 후, 완전한 살균 약 20 초 동안 뜨거운 구슬 살균기의 구슬과 접촉 수술 도구를 배치합니다. 수술 도구는 각각의 수술 전에 실온으로 냉각 할 수 있습니다.
- 쓰레기의 모든 새끼에 대한 수술을 완료 한 후, 어머니의 둥지로 돌아 오기 전에 어머니의 침구와 배설물로 새끼를 섞는다.
참고 : 일반적으로, ICR / CD-1 마우스는 더 나은 위탁 C57BL / 6보다 어머니,하지만 심지어 같은 유전 적 배경의 간호 어머니 사이는, 육성 본능에 따라 다릅니다. 간호 어머니를 변경하면, 산모의 잠식에 의해 사망률을 감소 간호 어머니 P0 새끼를 제거한 다음 (P1)에 혀끝의 절제술을 수행 할 필요가있는 경우. 만 허위 조작이나 혀끝의 연구를 수행새끼의 한 쓰레기에서 esection, 혼합 가짜 수술 새끼가 새끼 6 수술 군의 생존율을 감소 할 수 있기 때문이다.
5. 수술 후 분석
- 하루 수술 후, 새끼를 모니터링하고 가짜 수술 군 간의 차이가 없다는 것을 확인하고 생존율을 측정하는 새끼의 개수를 카운트. 수술이 적절하게 수행되는 경우, 생존율은 가짜 수술 군 모두에서 유사한 60 % 이상이어야한다.
- 심장 격리 및 고정.
- 일 1에서 새끼 자궁 전위에 의해 사망 보장과 이산화탄소에 의해 참수하고 21 일 후 수술을 통해 2 후 수술을 안락사, 다음 70 % 알코올 준비를 사용하여 가슴을 청소합니다.
- 가슴의 중간 선 피부와 근육을 절개 한 후 가슴을 엽니 다.
- 흉강에서 전체의 마음을 절제하고 4 % 파라 포름 알데히드의 O / RT에서 N 5ml에 각 샘플의 전체 마음을 고정한다.
- 다음날, 70 % 에탄올로 샘플들을 전달. 샘플은 파라핀 삽입하기 전에 일주까지 저장할 수 있습니다.
- 슬라이스는 5 μm의 두께의 파라핀 전체 심실을 통해 섹션과 회생 응답 5, 7을 검토 표준 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E)과 메이슨의 트리 크롬 염색을 수행한다. 특히, H & E 염색은 근육의 교체를 검토하는 데 사용되며 메이슨의 트리 크롬 염색이 사용됩니다 섬유 성 반응 (5)을 조사한다.
- 관심의 영역을 선택하여 수동으로 슬라이드 스캐너를 사용하여 샘플 당 적어도 세 초점을 설정합니다. 이미지 및 디폴트 매개 변수와 제조자의 지시에 따라 40 × 배율에서 염색 슬라이드를 분석한다.
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Representative Results
마우스 새끼는 1, 2, 이십일일 후 치근단 절제술을 안락사시키고, 그들의 마음을 H & E 및 메이슨 트리 크롬 염색의 수집 하였다. 메이슨의 트리 크롬 염색 블루 색상은 심 외막 세포 외 기질 (5)의 증착을 나타냅니다. 도 1a에 도시 된 바와 같이 성공적인 치근단 절제술, 혈병을 효과적으로, LV 일일 후 치근단 절제술을 밀봉하도록 형성된다. 혈액 응고 초기 심장 섬유화의 점진적인 흡수가 관찰되고, 심근의 완전한 재생이 이십일일 치근단 절제술 후 (그림 1B 및 C)를 배치한다 때까지 심근 조직으로 대체가 발생합니다. 형태 학적 분석은 이십일일 수술 후 (그림 1C와 D)에서 절제와 가짜로 작동하는 마음 사이에 차이점을 보여줍니다.
그림 1. 대표 H & E와 메이슨의트리 크롬 염색. 신생아 마우스 하트 1 (A), 2 (B), 또는 정점 절제 후 21의 (C) 일 및 허위 조작 (D) 후의 이십일일 심실의 심근. 각각의 하위 도면의 경우, 왼쪽 패널의 스케일 바는 1mm이고, 오른쪽 패널의 스케일 바는 100 ㎛이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Disclosures
이 기사에 대한 출판 비용은 박사 지앤 허우에 파인 과학 도구의 선물 후원했다.
Acknowledgments
저자는 박사 감사합니다. 제임스 호킨스, 국립 심장, 폐에서 즈 - 사이 유와 법사 숨어 및 마우스 수술 준비와 파라핀 섹션의 염색과의 도움을 혈액 연구소 (NHLBI). 저자는 편집 지원에 대한 NIH 휄로우 편집위원회에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors, 1.5 mm | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Vannas Spring Scissors - 2 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-03 | Iridectomy scissors |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Iris Forceps, Straight, Serrated | Fine Science Tools | 11064-07 | |
| Iris Forceps, Curved, Serrated | Fine Science Tools | 11065-07 | |
| Shea Scissors - Curved/Blunt-Blunt/12cm | Fine Science Tools | 14105-12 | |
| Round Handled Suture Tying Forceps, Straight | Fine Science Tools | 18025-12 | |
| Round Handled Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15400-12 | |
| Fine Hemostat | Fine Science Tools | 13007-12 | |
| Magnifying Lamp | Luxolamp Corp | IM120 | |
| Heating lamp | Brandt Equipment llc | 51152/3 | |
| 6-0 Prolene sutures | Ethicon | 8889H | |
| Skin glue-Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Dynarex | 4305 | |
| WEBCOL Alcohol Prep Pad | Covidien | 6818 | Medium 2 PLY, 200/BOX, Satured with 70% Isopropyl Alcohol |
| Curity All Purpose Sponges | Covidien | 9024 | Non-woven 4 PLY, 4"x4" (10.2cm×10.2cm) |
| Bench top protector sheet | KIMTECH SCIENCE | 7546 | 18" x 19.5" (45.72cm x 49.53cm) x 50 |
| 0.9% Sodium Chloride, 250ml | Hospira Inc. | NDC 0409-6138-22 | |
| Betadine Solution Swabsticks | Purdue Products L.P. | NDC 67618-153-03 | |
| Autoclave | TOMY Digital Biology | SX-700 | HIGH-PRESSURE STEAM STERILIZER |
| Slide scanner | HAMAMATSU | NanoZoomer 2.0-RS |
References
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