Abstract
Les maladies cardiovasculaires empoisonne le monde entier en raison de changements de style de vie intensifs. La régénération cardiaque est très prometteuse pour la réparation et la restauration de cardiomyocytes perdus en raison de blessures et de maladies. Contrairement à la régénération cardiaque robuste de certains vertébrés inférieurs, coeurs de mammifères adultes présentent généralement une capacité minimale pour la régénération et la réparation cardiaque. Cependant, des études récentes ont suscité un intérêt scientifique considérable à la conclusion que, entre le jour postnatal 1 à 7 (P1 à P7), le cœur de souris néonatale conserve potentiel régénératif significative après résection apicale (ie, l'amputation chirurgicale et l'exposition de gauche apex ventriculaire). Une importante controverse sur cette constatation pourrait être due à des procédures liées à la chirurgie-divers utilisés dans les efforts visant à reproduire ou à développer sur cette importante découverte. Ces instructions présentent dynamiquement les matériaux et les méthodes pour la résection apicale dans un modèle de souris. Les étapes marquantes de ce rongeur Survival chirurgie implique l'hypothermie anesthésie, thoracotomie, l'amputation chirurgicale du coeur apex ventriculaire, et la suture et la récupération de la souris. L'approche décrite pourrait étendre l'application du modèle de la souris apicale de résection pour la recherche cardiovasculaire.
Protocol
Toutes les expériences de souris ont été approuvés par la protection des animaux et l'utilisation de programme au National Institutes of Health (NIH) avec le numéro de protocole H0083R3. Le NHLBI IACUC approuvé le protocole sans analgésiques.
1. hypothermie anesthésie chez des souris néonatale
- Stériliser les éponges et de matériel chirurgical dans un autoclave avant la chirurgie. Préparer tous les matériaux chirurgicaux et passer sur un stérilisateur à billes chaude 15-20 minutes à l'avance pour atteindre 240 ° C à 270 ° C.
- Transférez tous C57BL / 6 chiots (âge P1) de leur mère qui allaite à une cage de la souris propre avec literie fraîche et matériaux de nidification. Une fois que les chiots sont prises dans une salle de chirurgie, effectuer la chirurgie apicale rapidement afin de minimiser le temps passé séparé de la mère et de réduire le risque de cannibalisation maternelle.
- Mettez des éponges sur un lit de glace et ensuite placer un chiot sur l'éponge pour ~ 3 min pour atteindre l'hypothermie anesthésie. Confirmez l'anesthésie en observant APAEN et l'akinésie et pincer un pied arrière. Vérifiez l'état des nouveau-nés souvent parce que trop peu de temps ne fera pas la akinetic et apnéique chiot, et une durée excessive de l'anesthésie peut abaisser le taux de survie 12.
2. thoracotomie
- Transférer le chiot à partir du lit de glace sur une zone de paillasse chirurgicale et utiliser du ruban adhésif pour immobiliser son bras, les jambes et la queue dans une position couchée.
- Désinfectez la poitrine à l'aide de la bétadine et nettoyer délicatement à l'aide d'un tampon à l'alcool de 70%.
- Faire une incision de la peau transversale le long de la zone de suite intercostal de la cavité de la poitrine à l'aide d'un Vannas printemps ciseaux, puis émousser disséquer les muscles intercostaux de suite pour faciliter l'accès au cœur.
NOTE: Les taux de survie augmentent lorsque la perte de sang est minimisée pendant le processus chirurgical.
3. Amputation chirurgicale de l'apex ventriculaire Coeur
- À la main, appliquer doucement la pression sur l'abdomen d'extérioriser laapex du cœur. Absorber le sang autour de la zone chirurgicale avec des applicateurs de coton-tige stérile pour une visualisation claire. Pour les nouveau-nés de contrôle opérés de manière fictive, passez directement à l'étape 4 (Suture et récupération de souris).
- Sous une lampe loupe et en utilisant des ciseaux iridectomie, effectuez doucement résection fragmentaire du ventricule gauche (VG) jusqu'à ce que la chambre LV est exposée. Prenez soin de réduire les portions de résection de la LV. Environ 15% résection est nécessaire pour obtenir une exposition optimale de la chambre LV.
- Assurez-vous que le cœur retourne à la cavité thoracique, une fois la chambre LV est exposé.
4. Suture et récupération de souris
- Suturer les côtes et les muscles pour sceller la cavité thoracique en utilisant des sutures Proline 6-0 stériles, puis fermez soigneusement le site d'incision de la peau à l'aide de colle de peau.
- Réchauffer le nouveau-né sous une lampe de chaleur pour ~ 3 min de récupération, puis nettoyer les traces de sang et de la colle à l'aide d'un tampon à l'alcool de 70% before réintroduire à ses compagnons de portée. Essayez de compléter la procédure chirurgicale ensemble dans les 10 min parce minimisant le temps passé séparé de la mère améliore la survie des petits après résection apicale.
- Après chaque opération, placer les outils chirurgicaux en contact avec les talons du stérilisateur à billes à chaud pendant environ 20 secondes pour une stérilisation complète. Laisser les outils chirurgicaux à refroidir à température ambiante avant chaque intervention chirurgicale.
- Après avoir terminé les chirurgies pour tous les chiots dans une litière, mélanger les chiots avec la literie et les excréments de la mère avant de les retourner au nid de la mère.
REMARQUE: Généralement, ICR / souris CD-1 sont des mères mieux nourriciers que C57BL / 6, mais même chez les mères allaitantes de même fond génétique, favorisant instincts varient. Si changer une mère qui allaite est nécessaire pour réduire la mortalité maternelle par la cannibalisation, enlever les chiots de P0 à une mère qui allaite, puis effectuer une résection apicale en P1. Seulement effectuer soit l'opération fictive ou de la r apicaleESection en une portée de chiots, car le mélange imposture et chiots chirurgicales pourraient diminuer les taux du groupe chirurgical des chiots 6 de survie.
5. Analyse post-chirurgicales
- Un jour après la chirurgie, surveiller les chiots, assurer qu'il n'y a aucune différence entre imposture et des groupes de chirurgie, et de compter le nombre de chiots pour mesurer le taux de survie. Si les chirurgies sont effectuées correctement, les taux de survie devraient être similaires et supérieur à 60% dans les deux groupes imposture et chirurgicales.
- L'isolement du cœur et de la fixation.
- Euthanasier les chiots à des jours 1 et 2 post-opératoire par décapitation et 21 jours post-chirurgie en CO2 avec une assurance de la mort par dislocation cervicale, puis nettoyer la poitrine à l'aide d'un alcool de préparation de 70%.
- Inciser la peau médiane et le muscle de la poitrine, puis ouvrez le coffre.
- Exciser tout le cœur de la cavité thoracique et fixer l'ensemble du cœur de chaque échantillon dans 5 ml de paraformaldéhyde 4% O / N à température ambiante.
- Le jour suivant, le transfert des échantillons à 70% d'éthanol. Les échantillons peuvent être conservés jusqu'à une semaine avant inclusion dans la paraffine.
- Sections de paraffine 5 um d'épaisseur couper à travers l'ensemble du ventricule et effectuer hématoxyline standard et l'éosine (H & E) et trichrome coloration de Masson pour examiner la réponse régénérative 5, 7. Plus précisément, coloration H & E est utilisée pour examiner le remplacement musculaire et Trichrome de Masson est utilisé d'examiner les réponses fibrotiques 5.
- Sélectionnez la zone d'intérêt et mettre en place au moins trois foyers par échantillon manuellement à l'aide d'un scanner de diapositives. Image et analyser les diapositives de coloration à 40 grossissement selon les instructions du fabricant avec des paramètres par défaut.
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Representative Results
Chiots de souris ont été euthanasiées 1, 2, et 21 jours après la résection apicale, et leurs coeurs ont été recueillies pour H & E et Trichrome de Masson. Couleur bleue dans Trichrome de Masson indique le dépôt de la matrice extracellulaire épicardique 5. Avec succès résection apicale, un caillot de sang est formée pour sceller efficacement la LV une résection jour post-apical, comme représenté sur la figure 1A. Une résorption progressive du caillot de sang et la fibrose cardiaque rapide est observée, et le remplacement par du tissu myocardique se produit jusqu'à ce que la régénération complète du myocarde a lieu 21 jours après la résection apicale (Figure 1B et C). L'analyse morphologique montre pas de différence entre les cœurs réséqués et opérés de manière fictive à 21 jours après l'intervention chirurgicale (Figure 1C et D).
Figure 1. Représentant H & E et de MassonTrichrome. Myocarde ventriculaire de coeurs de souris néonatale 1 (A), 2 (b), 21 (C) après résection apicale jours et 21 jours après opération fictive (D). Pour chaque sous-figure, la barre d'échelle du panneau gauche est de 1 mm et la barre d'échelle du panneau de droite est de 100 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Disclosures
Frais de publication de cet article ont été parrainés par un don de beaux outils de la science pour le Dr Jian Hou.
Acknowledgments
Les auteurs remercient les Drs. James Hawkins, Zu-Yu Xi Qu Xuan et du National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) pour leur aide à la chirurgie de la souris et la préparation et la coloration des coupes en paraffine. Les auteurs sont reconnaissants à la NIH Fellows Comité de rédaction de l'assistance éditoriale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors, 1.5 mm | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Vannas Spring Scissors - 2 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-03 | Iridectomy scissors |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Iris Forceps, Straight, Serrated | Fine Science Tools | 11064-07 | |
| Iris Forceps, Curved, Serrated | Fine Science Tools | 11065-07 | |
| Shea Scissors - Curved/Blunt-Blunt/12cm | Fine Science Tools | 14105-12 | |
| Round Handled Suture Tying Forceps, Straight | Fine Science Tools | 18025-12 | |
| Round Handled Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15400-12 | |
| Fine Hemostat | Fine Science Tools | 13007-12 | |
| Magnifying Lamp | Luxolamp Corp | IM120 | |
| Heating lamp | Brandt Equipment llc | 51152/3 | |
| 6-0 Prolene sutures | Ethicon | 8889H | |
| Skin glue-Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Dynarex | 4305 | |
| WEBCOL Alcohol Prep Pad | Covidien | 6818 | Medium 2 PLY, 200/BOX, Satured with 70% Isopropyl Alcohol |
| Curity All Purpose Sponges | Covidien | 9024 | Non-woven 4 PLY, 4"x4" (10.2cm×10.2cm) |
| Bench top protector sheet | KIMTECH SCIENCE | 7546 | 18" x 19.5" (45.72cm x 49.53cm) x 50 |
| 0.9% Sodium Chloride, 250ml | Hospira Inc. | NDC 0409-6138-22 | |
| Betadine Solution Swabsticks | Purdue Products L.P. | NDC 67618-153-03 | |
| Autoclave | TOMY Digital Biology | SX-700 | HIGH-PRESSURE STEAM STERILIZER |
| Slide scanner | HAMAMATSU | NanoZoomer 2.0-RS |
References
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