Introduction
Lo scambio di sostanze nutritive, gas e prodotti di scarto durante la gestazione eutherian è mediato dalla placenta. Nel tratto riproduttivo femminile, le arterie uterine sono i principali condotti di sangue verso l'utero. Dopo l'impianto, questi ramo in vasi specializzati chiamati arterie spirali che avvolgono attraverso le basale decidua verso l'unità fetoplacentare. Diametro e l'elasticità di queste arterie spirali, che sono circondate da leucociti, in particolare uterina natural killer (Unk), le cellule, dettare il volume e la velocità di sangue a disposizione alla placenta 1,2. Modificazioni emodinamiche corretti come risultato di rimodellamento delle arterie spirali sono fondamentali per il successo della gravidanza.
Mentre i meccanismi sottostanti differiscono in dettaglio tra umano e murino gravidanza, il risultato finale del processo di rimodellamento in entrambe le specie è dilatato, alta conduttanza vascolare che perde il suo strato di muscolatura liscia. Nei topi, l'interferone Zio derivato dalle cellule (IFN-) γ è necessario per indurre questi cambiamenti a intorno a metà della gestazione 3-5. I topi che mancano sia le cellule NK o componenti della via di segnalazione di IFN-γ non riescono a subire questi cambiamenti e questo è associato ad una ridotta crescita fetale 6,7, sottolineando l'importanza di un adeguato apporto di sangue per l'unità fetoplacentare. Durante la prima gravidanza umana, l'invasione interstiziale ed endovascolare di trofoblasto extravilloso e la loro interazione con le cellule unk sono importanti per indurre alterazioni vascolari e di promuovere la crescita del feto 8-10. Lo Zio cellule possono orchestrare invasione trofoblasto umano attraverso chemochine e citochine 11, come granulociti e macrofagi - fattore stimolante le colonie (GM-CSF) 12. Shallow invasione trofoblasto è associato con ridotte rimodellamento arteriosa e complicazioni durante la gravidanza come la pre-eclampsia 9.
Questo protocollo si basa sul lavoro pionieristico di Anne Croy che ha descritto l'importanteruolo del sistema immunitario e in particolare NK-IFN-γ derivato per il successo rimodellamento vascolare attraverso immunoistochimica e di trasferimento eleganti esperimenti 5,13. Qui si descrive un modo veloce ed economico per valutare lo stato di rimodellamento delle arterie a spirale. Anche se il nostro laboratorio valuta regolarmente presente a metà della gestazione (giorno di gestazione (GD) 9.5) 14, il processo di rimodellamento avviene tra gd8.5 e 12,5 15. L'avvento di scanner per diapositive automatizzati ha notevolmente facilitato la valutazione delle aree nave e lume dalle sezioni e abbiamo trovato che questo è un approccio più riproducibile di misurare i diametri dei vasi. L'aggiunta di rilevazione immunoistochimica di SMA consente una semplice validazione dei risultati ottenuti dalla valutazione stereologica. Come per tutte le tecniche di stereologici, si raccomanda di eseguire la valutazione come un esperimento in cieco da almeno due esaminatori. A tal fine, un passo randomizzazione può essere introdotto quando serialmente tagliareting i campioni in modo che gli investigatori valutare le diapositive non sanno da quale gruppo sperimentale i campioni provengono.
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire uno strumento affidabile per valutare attentamente la ristrutturazione delle arterie spirali nei topi con genotipi materni e paterni definiti, nel contesto di modelli murini per le complicazioni legate alla gravidanza. I risultati sottolineano la dipendenza da cellule Zio di questo processo, che è essenziale per la normale crescita fetale.
Protocol
Tutte le procedure descritte in questo manoscritto sono in conformità con le normative UK Home Office e sono approvati dalla Ethical Review Panel Cambridge.
1. Raccolta dei campioni
- Impostare accoppiamenti cronometrate con 8-12 settimane vecchia femmina C57BL / 6 topi con maschi adulti (fino a 2 femmine per ogni maschio) nel pomeriggio. Verificare la presenza di tappi vaginali come segno di copulazione prime ore del mattino nei giorni seguenti. La presenza di un plug nella mattina marchi gd0.5.
- Su gd9.5, eutanasia dell'animale da dislocazione cervicale e aprire la cavità addominale. Si noti che l'eutanasia da CO 2 può causare vasodilatazione.
- Utilizzare il filo interdentale per legare delicatamente le arterie uterine (Figura 1, frecce tratteggiate). Legare il filo intorno alle arterie sulla punta di ogni corno uterino, prossimale alle ovaie, così come intorno alla cervice.
Nota: Non rompere i vasi in quanto ciò potrebbe causare arterie crollate. <li> sezionare il utero rapidamente utilizzando forbici dissezione, ablazione del tutto utero distale ai tre punti legatura sulla punta delle corna uterine e la cervice. - Posizionare l'utero su un pezzo di polistirene preparato in modo che entrambe le corna sono allineati lungo il medesimo asse lungo in direzioni opposte dalla cervice. Allungare delicatamente e pin in posizione 25 con 2-3 aghi G.
- Immergere il polistirolo in un tubo da 50 ml preparati. Top fino a 50 ml con formalina al 10%. Fix per 5-6 ore a temperatura ambiente.
- Scartare la soluzione di formalina e sostituire con 50 ml 1x tampone fosfato salino (PBS) per 5 min.
- Accise le due corna uterine prossimale al punto legatura a ciascuna estremità prossimale e al collo dell'utero, nel centro, tagliare l'eventuale eccesso di grasso intorno ai siti di impianto e lavare due volte in PBS per 5 minuti per rimuovere le tracce di formalina.
- Conservare i campioni in etanolo al 70% a 4 ° C (per due settimane) fino all'elaborazione.
ATTENZIONE: EthAnol è altamente infiammabile. - Utilizzare un sistema di trattamento automatizzato utilizzando i parametri indicati in tabella 1. Incorporare le corna singolarmente in paraffina modo che possano essere tagliati lungo il piano perpendicolare all'asse lungo dell'utero. Questo assicura che l'area massima di ogni sito implantologico verrà esposta per analisi nel mezzo del blocco (Figura 2A).
OPTIONAL: Questo è un punto di tempo comodo per randomizzazione dei blocchi se lo si desidera. - Utilizzando un microtomo, tagliare sezioni seriali di 7 micron di spessore dai blocchi. Macchia una sezione ad ogni intervallo di 49 micron con ematossilina e eosina (H & E, vedere paragrafo 2.1). Conservare le restanti sezioni a temperatura ambiente per SMA colorazione e altre applicazioni a valle.
| Soluzione | Orario | Temperatura |
| 70% etanolo | 1 ora | 40 ° C |
| 100% di etanolo | 1 ora | 40 ° C |
| 100% di etanolo | 1 ora | 40 ° C |
| 100% di etanolo | 1 ora | 40 ° C |
| 100% di etanolo | 1 ora | 40 ° C |
| 100% di etanolo | 1 ora | 40 ° C |
| 100% di etanolo | 1 ora | 40 ° C |
| 1 ora | 40 ° C | |
| Xilene | 1 ora | 40 ° C |
| Xilene | 1 ora | 40 ° C |
| Paraffina | 1 ora | 63 ° C |
| Paraffina | 1 ora | 63 ° C |
| Paraffina | 1 ora | 63 ° C |
| Paraffina | 1 ora | 63 ° C |
Tabella 1:. Impostazioni per la lavorazione dei tessuti automatizzata Panoramica di regolazione usate per la lavorazione di tessuto uterino
2. SterValutazione eological
- H & E colorazione
- Deparaffinare sezioni immergendo diapositive montate in un rack scorrevole in un bagno di xilene 100% per 10 min a temperatura ambiente.
ATTENZIONE: xilene è infiammabile e un sospetto cancerogeno che è tossico attraverso il contatto e l'inalazione. Questo lavoro deve essere condotto in una cappa aspirante, utilizzando i dispositivi di protezione individuale (DPI). - Immergere i vetrini in bagno contenenti xilene pulita per altri 10 min.
- Sequenziale immergere i vetrini in bagni contenenti etanolo al 100%, 95% di etanolo, 70% di etanolo e acqua purificata per 5 minuti ciascuna.
- Immergere i vetrini in 50% Gill Nessuna soluzione ematossilina 3, diluita con acqua purificata, per 5 min.
ATTENZIONE: ematossilina è nociva per ingestione e contatto per gli occhi. Indossare un apposito DPI durante la manipolazione. - Lavare i vetrini in una vaschetta di colorazione sotto acqua corrente per 10 minuti.
- Immergere i vetrini in 1% soluzione di acido / alcol (1% di acido cloridrico al 10 M in etanolo 70%) per 10 sece lavare in una vasca di colorazione sotto acqua corrente.
- Immergere i vetrini in soluzione eosina per 30 secondi e lavare in una vasca di colorazione sotto acqua corrente per 10 minuti.
- All'interno di una cappa aspirante, sequenzialmente immergere i vetrini in bagni contenenti 70% di etanolo, 95% di etanolo e 100% etanolo per 5 minuti ciascuna.
- Immergere i vetrini in bagno contenente xilene per 10 min.
- Mount coprioggetto utilizzando un mezzo di montaggio a base di xilene-. Essiccare orizzontalmente e completamente in una cappa aspirante prima visualizzare i vetrini al microscopio.
- Deparaffinare sezioni immergendo diapositive montate in un rack scorrevole in un bagno di xilene 100% per 10 min a temperatura ambiente.
- Valutazione stereologica della nave Dimensioni e Rimodellamento Stato
- Per ogni sito di impianto, determinare in quali sezioni sono vicini al punto di midsagittal. L'attaccamento corioallantoidea tra il feto e la placenta in via di sviluppo costituisce un buon indicatore del punto midsagittal.
- Selezionare 3 sezioni a 49 micron intervalli vicine al punto midsagittal per l'analisi. Scansione diapositive selezionate. Per evitare incvene Luding, che hanno dimostrato di essere più perifericamente situato nei siti di impianto 16, limitare l'analisi sul centrale 2/4 di ogni sito d'impianto (Figura 2A).
- Per valutare dimensione del lume, disegnare intorno all'interno dei vasi e registrare l'area di questa forma. Per la dimensione totale del vaso, disegnare attorno alla parete esterna del recipiente, comprese le cellule endoteliali, e leucociti periciti intramurali.
Nota: Il rapporto tra dimensione totale nave a lume è un proxy per lo stato ristrutturazione di una nave. Come i vasi bobina attraverso il piano che la sezione è stato tagliato lungo, vi possono essere più sezioni della stessa arteria una diapositiva. Evitare di misurare la stessa arteria più volte. - Registrare le misure delle 5 navi in ciascun sito di impianto con le più grandi e più rotondi lumen. Misurare ogni sito di impianto in triplicato (tre sezioni distanziati 49 micron l'uno dall'altro). La media di questi 15 misurazioni represeNTS il diametro medio dei vasi più grandi.
- Per evitare overrepresentation dei vasi grandi in alcuni campioni, misurare lo stesso numero di navi in ciascun sito di impianto.
3. qualitativa valutazione utilizzando immunoistochimica
- Deparaffinizzazione e reidratazione
- Deparaffinare sezioni immergendo diapositive montate in un rack heatproof scivolare in un bagno di xilene 100% per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Immergere i vetrini in bagno contenenti xilene pulita per altri 10 min.
- Sequenziale immergere i vetrini in bagni contenenti etanolo al 100%, 95% etanolo e 70% e acqua purificata per 5 minuti ciascuna.
- Antigen Retrieval
- Preparare un 10 mM tampone citrato di sodio in acqua depurata e regolare a pH 6 con 10 M di acido cloridrico.
- Riempire un contenitore resistente al calore che può contenere 600 ml con 400 ml di sodio citrato e luogo di buffer in una pentola a pressione interna contenente wat sufficienteer a sommergere la metà del contenitore. Liberamente fissare il coperchio della pentola a pressione e calore fino a ebollizione.
- Porre il vetrino cremagliera nel buffer citrato di sodio e fissare saldamente il coperchio della pentola a pressione. Una volta pressurizzato, far bollire per 3 minuti.
- Depressurizzare la pentola a pressione e rimuovere il contenitore interno. Lasciare raffreddare i vetrini nel tampone citrato di sodio per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare i vetrini in un bagno contenente acqua purificata per 5 min.
- Circondare la sezioni usando una penna barriera idrofobica.
- Lavare i vetrini immergendo in PBS per 5 min.
- Blocco endogena perossidasi e legame non specifico
- Incubare sezioni con 3% di perossido di idrogeno diluito in acqua purificata in una camera umidificata per 30 minuti a temperatura ambiente.
ATTENZIONE: Il perossido di idrogeno è altamente irritante per gli occhi, la pelle e per ingestione. Indossare appropriati DPI. - Toccare off soluzione di perossido d'idrogeno in eccesso e lavare slides due volte immergendo in soluzione fisiologica tamponata Tris (TBS) per 2 minuti ciascuna.
- Incubare sezioni con il mouse immunoglobulina bloccando reagente dal mouse sul corredo del mouse preparato secondo le istruzioni del produttore.
- Lavare i vetrini due volte in TBS per 2 minuti ciascuna.
- Incubare sezioni con 3% di perossido di idrogeno diluito in acqua purificata in una camera umidificata per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Immunolocalizzazione di actina del muscolo liscio
- Preparare la soluzione diluente anticorpale (fornito nel kit) e incubare con sezioni per 5 minuti a temperatura ambiente, o secondo le istruzioni del produttore.
- Diluire 1: actina muscolo liscio 100 topo anti-umano (DAKO m0851) in soluzione diluente. Diluire il mouse IgG2a controllo isotipico in soluzione diluente, assicurando che la concentrazione finale immunoglobulina è equivalente in entrambe le soluzioni.
- Toccare off soluzione diluente e coprire le sezioni in eccesso sia con soluzioni di controllo degli anticorpi o isotipo diluiti. Incubare in una camera umidificata per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare i vetrini due volte in TBS per2 min ciascuno.
- Diluire anticorpo secondario anti-topo biotinilato e incubare sezioni per 10 minuti a temperatura ambiente, o secondo le istruzioni del produttore.
- Lavare i vetrini una volta con TBS e PBS per 2 min, rispettivamente.
- Preparare la soluzione 3,3'-diaminobenzidina (DAB) in base alle istruzioni del produttore. Coprire sezioni con soluzione DAB e incubare fino a 4 min, assicurando a monitorare le sezioni al fine di evitare lo sviluppo del colore in eccesso.
ATTENZIONE: DAB è infiammabile e un sospetto cancerogeno che è tossico attraverso il contatto e l'inalazione. Indossare un apposito DPI durante la manipolazione. - Immergere i vetrini in acqua depurata una volta raggiunta l'intensità desiderata di colorazione.
- Controcolorare con il 50% di Gill n ° 3 ematossilina per 20 secondi e lavare in una vasca di colorazione sotto acqua corrente fino a quando l'acqua è pulita.
- Disidratazione e montaggio
- All'interno di una cappa aspirante, in sequenza immergere i vetrini in bagni contenenti il 70% ethAnol, etanolo al 95% e il 100% di etanolo per 5 minuti ciascuna.
- Immergere i vetrini in bagno contenente xilene per 10 min.
- Mount coprioggetto utilizzando un mezzo di montaggio a base di xilene-. Essiccare orizzontalmente e completamente in una cappa aspirante prima visualizzare i vetrini al microscopio
Representative Results
Rag2 - / - IL2RG - / - mice mancano tutti i linfociti maturi, comprese le cellule NK 17, e le loro arterie uterine non riescono a subire i cambiamenti vascolari osservati in di tipo selvatico congenic C57BL / 6 (WT) topo intorno a metà della gestazione 5,14. Come risultato di questo ridotto rimodellamento Rag2 - / - IL2RG - / - topi mostrano aree significativamente più piccole luminali di superficie, indicativi dei vasi globale più piccoli che possono essere visualizzati su sezioni H & E-colorati e quantificate stereologically (Figura 2). Inoltre, lo spessore della parete relativa (vaso rapporto lumen) è maggiore nelle arterie spirali in questi topi, suggerendo ridotto apporto di sangue e di velocità del sangue superiori.
Questa valutazione quantitativa è stata confermata con la rilevazione immunoistochimica della SMA. E 'caratteristico per topi WT a perdere la maggior parte della SMA nei media vascolaredelle arterie a spirale entro la metà di gestazione. Se questo processo cellule NK-driven non avviene, SMA rimane in media dei vasi e può essere facilmente rilevato immunoistochimiche come anelli intorno ai vasi sanguigni (Figura 3).
Figura 1: utero mouse a gd9.5, riassunto schematico disegno che mostra le posizioni relative della corna uterine, cervice uterina (blu) e principali arterie uterine (rosso).. Indicati sono l'asse delle corna uterine (frecce) ed i punti di legatura (frecce tratteggiate). Le sezioni per immunoistochimica sono tagliate lungo il piano di vista.
Figura 2:. Valutazione stereologica di rimodellamento arterioso a metà della gestazione (A) Esempio assessment di luminale e superfici totali delle navi su sezioni H & E macchiato dalle femmine WT nella centralissima 2/4 delle basalis decidua (delimitata dalla nera verticale linee tratteggiate) a gd9.5. Nelle navi in alto ingrandimento, la linea rossa tratteggiata delimita un'area totale nave, linea gialla tratteggiata delimita un'area lumen. Bar = 500 micron (a sinistra), 50 micron (a destra). L'asse lungo dell'utero è una linea orizzontale in questo orientamento. (B) Quantificazione delle aree luminali (pannello di sinistra) e rapporto di area luminale all'area nave totale (pannello di destra) da WT (C57BL / 6) e Rag2 - / - IL2RG - / - topi (su C57BL / 6 background). Ogni punto di dati rappresenta la media di 15 misurazioni (5 misure per sezione, 3 sezioni per ogni sito dell'impianto). Barre rappresentano in media, n = 11-13 siti di impianto da 4 gravidanze per gruppo; p-value da una a due code, spaiato test di Mann-Whitney. WT: tipo selvatico.
Figura 3:. Rilevazione immunoistochimica di actina muscolo liscio nelle basale decidua Rappresentante SMA colorazione su WT (in alto) e Rag2 - / - IL2RG - / - mice (su C57BL / 6 sfondo, fondo) a gd9.5. Bar = 100 micron. WT: tipo selvatico.
Discussion
Il protocollo qui presentata è progettato per fornire un metodo riproducibile che per valutare le modifiche vascolari che sono necessarie per gravidanza. Critico per il successo di questa valutazione è la qualità delle sezioni di tessuto. Sia determinare con precisione l'età gestazionale dei siti di impianto, così come affidabile legando le arterie uterine sono passi cruciali. Le variazioni di parametri quali il tempo di fissazione, protocollo tessuto-processing, ecc possono influire sul risultato. Per una valutazione stereologica imparziale, è importante misurare lo stesso numero di navi in ciascun sito di impianto. Si raccomanda di misurare 5 navi per sito di impianto e ogni sito di impianto in triplice copia. La media di queste misurazioni 15 rappresenta la dimensione media delle 5 più grandi vasi.
A seguito dei dati da Rag2 alymphoid - / - IL2RG - / - mice mostrate qui, abbiamo trovato questo protOcol utile per una serie di modelli di inadeguata funzione immunitaria materna, tra cui una delle cellule NK inibiti 14. Difetti di rimodellamento arterioso hanno anche dimostrato in modelli di alterata trofoblasto dell'invasione 18 e le tecniche qui descritte possono essere utili per valutare la vascolarizzazione in questi casi. Abbiamo ottimizzato e validato questo protocollo per la ricerca di deciduali rimodellamento vascolare a metà della gestazione nel topo, ma è anche ipotizzabile, ad adeguare il protocollo di lavorare in altri sistemi modello (ad esempio ratti) o anche in altri organi. Mentre troviamo che il rimodellamento NK-dipendente può essere robustamente valutata a gd9.5, esso può essere modificato per altri momenti, come gd12.5, quando il sistema vascolare materno è completamente ristrutturato. A questo punto di tempo, trofoblasto endovascolare invasione è profondo 16 e questo punto di tempo potrebbe essere più adatto per le indagini del ruolo di trofoblasto per cambiamenti vascolari. Se si desiderano ulteriori letture quantitativi,gli investigatori possono anche aumentare il numero di sezioni colorate per la SMA e valutare la percentuale di navi parzialmente ristrutturato all'interno di ogni sito dell'impianto.
Un limite di questo protocollo è la natura descrittiva degli esami istologici. Saggi funzionali, tuttavia, sono solo lentamente diventando disponibili (come ecocolordoppler 19). Queste tecniche richiedono competenze tecniche e costi molto più elevati per l'acquisizione e la manutenzione delle apparecchiature, ma hanno il vantaggio di fornire una lettura longitudinale in vivo per l'effetto delle variazioni osservabili istologicamente. Un possibile svantaggio di tutti gli esami stereologici è la soggettività degli investigatori. A tal fine, con due esaminatori indipendenti che analizzano tutti i campioni in modo indipendente può contribuire ad evitare questo problema. Mentre il protocollo descritto qui fornisce una visione in quanto sangue può raggiungere l'interfaccia feto-materna, può essere vantaggioso combinare con il complapproccio ementary di valutare la quantità totale di sangue in un dato momento nel sistema vascolare attraverso la plastica getta 16.
La forza di questo protocollo è che combina due approcci indipendenti. Cambiamento vascolare viene prima quantitativamente valutata stereologia e il risultato viene poi convalidato qualitativa, utilizzando l'immunoistochimica. L'affidabilità dei risultati può essere ulteriormente rafforzata dalla randomizzazione dei campioni. I campioni preparati per questo protocollo può essere facilmente utilizzato per studiare anche altri parametri di gravidanza, come decidualisation, lo sviluppo dell'aggregato linfoide mesometrial di gravidanza (MLAP) o immunolocalizzazione di cellule di interesse, di valutare con rigore un fenotipo gravidanza a midgestation.
Rimodellamento arteriosa è un passaggio fondamentale per le gravidanze senza complicazioni nelle donne e il fallimento di questi cambiamenti è alla base delle grandi sindromi ostetriche (GOS), vale a dire pre-eclampsia, restrizione della crescita fetale enati morti. Vi presentiamo qui le tecniche per valutare attentamente un fenotipo gravidanza in modelli murini che imitano alcune caratteristiche della fisiopatologia del GOS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice (8-12 weeks old) | Charles River | ||
| Dental floss | |||
| Polystyrene | Used for holding tissue in place | ||
| Straight dissection scissors | EMS | 72940 | |
| 25 G needles | BD | 300600 | Used for holding tissue in place |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P3813-10PAK | |
| Ethanol | Sigma | 32221-2.5L | |
| Paraffin | Sigma | 327204-1KG | |
| Xylene | Fisher Scientific | X/0250/17 | |
| Automated tissue processor | Sakura | 6032 | |
| Microtome | Leica | RM2245 | |
| Slide rack | Sigma | Z710989 | |
| Coplin jar | Sigma | S5891 | |
| Purified water | |||
| Hematoxylin solution, Gill No. 3 | Sigma | GHS332-1L | |
| Eosin Y solution | Sigma | HT110116-500ML | |
| Fume hood | |||
| Xylene-based mounting media | VWR | 361254D | |
| Slide scanner | Hamamatsu | NanoZoomer | |
| Slide scanner software | Hamamatsu | NDP viewer | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | 32320 | Make 10 mM solution and adjust pH to 6 |
| Pressure cooker | Used for antigen retrieval | ||
| Heating plate | Used for antigen retrieval | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H/1800/15 | |
| Tris buffered saline | Sigma | T6664-10PAK | |
| Mouse on mouse kit | Vector | BMK-2202 | Significantly reduces background |
| Mouse anti-human smooth muscle actin | DAKO | M0851 | Cross-reacts with mouse |
| IgG2a isotype control | DAKO | X0943 | |
| Humidified chamber | Sigma | H6644 | |
| 3,3’-Diaminobenzidine solution | Sigma | D4293-5SET | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | H/1050/PB17 |
References
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