Generieren von CRISPR / Cas9 Mediated monoallelic Löschungen Enhancer-Funktion in embryonalen Stammzellen der Maus zu studieren
Summary
Experimental validation of enhancer activity is best approached by loss-of-function analysis. Presented here is an efficient protocol that uses CRISPR/Cas9 mediated deletion to study allele-specific regulation of gene transcription in F1 ES cells which contain a hybrid genome (Mus musculus129 x Mus castaneus).
Abstract
Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often located distally from the regulated gene in intergenic regions or even within the body of another gene. The position independent nature of enhancer activity makes it difficult to match enhancers with the genes they regulate. Deletion of an enhancer region provides direct evidence for enhancer activity and is the gold standard to reveal an enhancer’s role in endogenous gene transcription. Conventional homologous recombination based deletion methods have been surpassed by recent advances in genome editing technology which enable rapid and precisely located changes to the genomes of numerous model organisms. CRISPR/Cas9 mediated genome editing can be used to manipulate the genome in many cell types and organisms rapidly and cost effectively, due to the ease with which Cas9 can be targeted to the genome by a guide RNA from a bespoke expression plasmid. Homozygous deletion of essential gene regulatory elements might lead to lethality or alter cellular phenotype whereas monoallelic deletion of transcriptional enhancers allows for the study of cis-regulation of gene expression without this confounding issue. Presented here is a protocol for CRISPR/Cas9 mediated deletion in F1 mouse embryonic stem (ES) cells (Mus musculus129 x Mus castaneus). Monoallelic deletion, screening and expression analysis is facilitated by single nucleotide polymorphisms (SNP) between the two alleles which occur on average every 125 bp in these cells.
Introduction
Transkriptions – Regulationselemente sind entscheidend für die räumlich-zeitliche Feinabstimmung der Genexpression während der Entwicklung 1 und Modifikation dieser Elemente in Krankheits 2 aufgrund aberrant Genexpression führen kann. Viele krankheitsassoziierten Regionen durch genomweite Assoziationsstudien identifiziert sind in nicht-kodierenden Regionen und verfügen über Funktionen von Transkriptionsverstärker 3-4. Identifizieren Enhancer und passender sie mit den Genen regulieren sie ist kompliziert , da sie oft mehrere Kilobasen entfernt von den Genen liegen sie regulieren und kann 5-6 in einer gewebespezifischen Weise aktiviert werden. Enhancer Prognosen werden auf Histonmodifikation Marken, Mediator-cohesin Komplexe häufig basiert und Bindung von zelltypspezifischen Transkriptionsfaktoren 7-10. Validierung des vorhergesagten Verstärker wird am häufigsten durch einen vektorbasierten Assay durchgeführt , in dem der Verstärker 11-12 Expression eines Reportergens aktiviert. Diese Daten liefern valuable Informationen über das regulatorische Potential mutmaßlicher Enhancer-Sequenzen, aber nicht offenbaren ihre Funktion in ihrer endogenen genomischen Kontext oder zu identifizieren, die Gene, die sie regulieren. Genome Bearbeitung dient als leistungsfähiges Werkzeug, um die Funktion von Transkriptionsregulationselemente in ihrer endogenen Zusammenhang mit loss-of-function-Analyse zu untersuchen.
Jüngste Fortschritte in der Genombearbeitung, nämlich die CRISPR / Cas9 Genom Editing-System, ermöglichen die Untersuchung der Genomfunktion. Der CRISPR / Cas9 System ist einfach zu bedienen und anpassungsfähig für viele biologische Systeme. Das Cas9 Protein wird durch eine Führungs RNA (gRNA) 13 in das Genom an einer bestimmten Stelle ausgerichtet sind . Der SpCas9 / gRNA Komplex durchsucht das Genom für seine Ziel genomischen Sequenz , die 5 'angrenzend Motiv (PAM) Sequenz, NGG 14-15 zu einem protospacer sein muss. Basenpaarung der gRNA zu seinem Ziel, eine 20 Nukleotid (nt) Sequenz, die komplementär zu der gRNA aktiviert SpCas9 Aktivität Nuklease in einem Doppe ergebe Strangbruch (DSB) 3 bp stromaufwärts der PAM-Sequenz. Die Spezifität wird durch vollständige Basenpaarung in der Seed-Region gRNA erreicht, die 6-12 nt neben dem PAM; Umgekehrt Mismatches 5 'des Saatgutes werden üblicherweise 16-17 toleriert. Das eingeführte DSB repariert werden können, entweder durch die nicht-homologen Endverbindung (NHEJ) DNA-Reparatur oder Homologie gerichteten Reparatur (HDR) mechanisms.NHEJ DNA-Reparatur oft Einfügen / Löschen (indels) von wenigen bp an der Zielstelle erzeugt, die stören können der offene Leserahmen (ORF) eines Gens. Um größere Deletionen im Genom zwei gRNAs erzeugen, welche die Region von Interesse flankieren, können 18-19 verwendet werden. Dieser Ansatz ist besonders nützlich für die Untersuchung der transkriptionalen Enhancer geclustert in Locus – Kontrollregionen oder super-Enhancer , die größer sind als herkömmliche Enhancer 9,18,20-22.
Monoallelic Streichungen sind ein wertvolles Modell für cis -Regelung der Transkription zu studieren. Die beobachtete change in Transkriptebene nach monoallelic Deletion eines Enhancers korreliert mit der Stellung dieser Enhancer in Genregulation ohne die verwirrende Wirkungen, die potenziell Zell fitness Beeinflussung beeinträchtigt wird, wenn die Transkription von beiden Allelen auftreten können. reduzierte Expression Auswertung ist schwierig, jedoch ohne die Fähigkeit, die gelöscht aus dem Wildtyp-Allel zu unterscheiden. Weiterhin ohne die Fähigkeit , an jedem Allel – Deletionen Genotypisierung die beiden Allele zu unterscheiden , ist eine Herausforderung, insbesondere für große Deletionen von> 10 kb bis 1 Mb 23 , in dem es schwierig ist, die gesamte Wildtyp – Region durch PCR zu amplifizieren. Die Verwendung von F1 – ES – Zellen erzeugt durch Kreuzen Mus musculus 129 mit Mus castaneus können die zwei Allele durch allelspezifische PCR 18,24 unterscheiden. Das Hybrid-Genom in diesen Zellen erleichtert Allel-spezifische Deletion Screening und Expressionsanalyse. Im Durchschnitt gibt es eine SNP alle 125 bp zwischen diesen beiden GenomeFlexibilität für den Ausdruck und die Genotypisierung in Primer-Design, Untersuchungen. Die Anwesenheit eines SNP können die Primer Schmelztemperatur (T m) beeinflussen und Zielspezifität in real-time quantitative PCR (qPCR) Amplifikation unter Berücksichtigung Unterscheidung der beiden Allele 25. Weiterhin ist ein Mismatch innerhalb des Endes des Primers '3 beeinflußt stark die Fähigkeit der DNA – Polymerase aus dem Primer verhindert Amplifikation des Allels unerwünschten Ziel 26 zu erstrecken. Beschrieben in dem folgenden Protokoll ist die Verwendung von F1 – ES – Zellen für die Allel – spezifische Enhancer – Deletionen von mehr als 1 kb und anschließende Expressionsanalyse unter Verwendung des CRISPR / Cas9 Genom Editiersystem (Abbildung 1).
Abbildung 1. Enhancer Löschen mit CRISPR / Cas9 cis -REG zu studierenulation der Genexpression. (A) F1 ES durch eine Kreuzung zwischen Mus musculus sind 129 und Mus castaneus erzeugten Zellen für Allel – spezifische Löschen zu ermöglichen. (B) Zwei Führungs RNAs (gRNA) verwendet , um eine große Cas9-vermittelte Deletion des Enhancer – Region zu induzieren. (C) werden Primer – Sets verwendet , um große mono- und bi-allelische Deletionen zu identifizieren. Die orangefarbenen Primer sind die inneren Primer sind die lila Primer die äußeren Primer und die grünen Primer werden die gRNA flankierenden Primer. (D) Änderungen in der Genexpression verwenden allelspezifischen qPCR überwacht. RFU bezeichnet relative Fluoreszenzeinheiten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR / Cas9 vermittelte Genome Editing-Technologie bietet eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode für die Genommodifikation. Die Methode, die hier detailliert zu erzeugen und monoallelic Enhancer Deletion für die funktionelle Charakterisierung Enhancer nimmt in F1 Mauszellen Vorteil von SNPs analysieren. Die Vorteile dieser Art von Ansatz sind: 1) monoallelic Enhancer Deletionen produzieren keine Verwechselung Wirkungen , die auftreten , wenn ein kritischer Enhancer aus beiden Allelen deletiert ist, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank all the members of the Mitchell lab for helpful discussions. This work was supported by the Canadian Institutes of Health Research, the Canada Foundation for Innovation and the Ontario Ministry of Research and Innovation (operating and infrastructure grants held by JAM).
Materials
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | high fidelity DNA polymerase used in gRNA assembly |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | A target sequence is cloned into this vector to create the gRNA plasmid |
| pCas9_GFP | Addgene | 44719 | Codon-optimized SpCas9 and EGFP co-expression plasmid |
| AflII | NEB | R0520S | |
| EcoRI | NEB | R3101S | |
| Neon Transfection System 100 µL Kit | Life Technologies | MPK10096 | Microporator transfection technology |
| prepGEM | ZyGEM | PT10500 | genomic DNA extraction reagent |
| Nucleo Spin Gel & PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| High-Speed Plasmid Mini Kit | Geneaid | PD300 | |
| Maxi Plasmid Kit Endotoxin Free | Geneaid | PME25 | |
| SYBR select mix for CFX | Life Technologies | 4472942 | qPCR reagent |
| iScript cDNA synthesis kit | Bio-rad | 170-8891 | Reverse transcription reagent |
| 0.25% Trypsin with EDTA | Life Technologies | 25200072 | |
| PBS without Ca/Mg2+ | Sigma | D8537 | |
| 0.5M EDTA | Bioshop | EDT111.500 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175095 | |
| 1M HEPES | Life Technologies | 13630080 | |
| BSA fraction V (7.5%) | Life Technologies | 15260037 | |
| Max Efficiency DH5α competent cells | Invitrogen | 18258012 | |
| FBS | ES cell qualified | FBS is subjected to a prior testing in mouse ES cells for pluripotency | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050 | |
| DMEM | Life Technologies | 11960069 | |
| Pencillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360 | |
| Non-essential aminoacid | Invitrogen | 11140 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 83.3924 | |
| Sealing tape | Sarstedt | 95.1994 | |
| CoolCell LX | Biocision | BCS-405 | alcohol-free cell freezing container |
| CHIR99021 | Biovision | 1748-5 | Inhibitor for F1 ES cell culture |
| PD0325901 | Invivogen | inh-pd32 | Inhibitor for F1 ES cell culture |
| LIF | Chemicon | ESG1107 | Inhibitor for F1 ES cell culture |
References
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