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Medicine

Ciliopathy माउस उत्परिवर्ती कोक्लीअ में Planar सेल Polarity phenotypes का मूल्यांकन

Published: February 21, 2016 doi: 10.3791/53559
Automatic Translation
1
1Cell and Matrix Biology, Institute of Zoology, Johannes Gutenberg-Universität Mainz

Introduction

प्राथमिक सिलिया लंबे microtubule आधारित उपांग है कि सबसे अधिक स्तनधारी कोशिकाओं की सतह से विस्तार कर रहे हैं। प्राथमिक सिलिया अक्सर गतिशील सिलिया के साथ भ्रमित कर रहे हैं, जो वहाँ हमेशा सेल प्रति एकाधिक रहे हैं, और जिसका उद्देश्य झिल्ली सतहों के पार तरल पदार्थ ले जाने के लिए है। प्राथमिक सिलिया, इसके विपरीत, संवेदी भूमिकाओं को अपनाने और इसके परिणामस्वरूप के रूप में भी संवेदी सिलिया के लिए भेजा जाता है। एक बार लंबी भूल, इस organelle हाल ही में मानव आनुवंशिक रोगों 1 के एक भीड़ के साथ अपने सहयोग का एक परिणाम के रूप में 'फिर से खोज' कर दिया गया है। आदर्श रूप में एक संकेत के रूप में तैनात organelle, प्राथमिक बरौनी कई संकेत दे रास्ते, जिनमें से कई ऊतक homeostasis और रोग में न केवल महत्वपूर्ण हैं, लेकिन यह भी विकास के दौरान 2 विनियमित करने के लिए दिखाया गया है।

सिलिया रोग के साथ जुड़े होने के लिए दिखाया पहला संकेत दे रास्ते में से एक गैर विहित Wnt संकेतन मार्ग भी तलीय सेल polarity (पीसीपी) मार्ग के रूप में जाना जाता था > 3। यह संकेत झरना शुरू में ड्रोसोफिला में पहचान, embryogenesis के लिए महत्वपूर्ण है; अभिसरण और विस्तार की प्रक्रिया के लिए विशेष रूप से और epithelia 4 के विमान में कोशिकाओं के सही ओरिएंटेशन के लिए। एक कोर नियामक प्रोटीन का सेट के अनुक्रमिक सिगनल दिशात्मक संकेतों जो अंततः cytoskeletal rearrangements के लिए नेतृत्व और एक विमान में 5 उपकला कोशिकाओं के समन्वित ध्रुवीकरण में परिणाम अनुवाद। अभिसरण और विस्तार की प्रक्रिया बिल्कुल कर्णावत वाहिनी बढ़ाना करने के लिए और सही सेलुलर patterning 6 के लिए आवश्यक है। इस पीसीपी मार्ग के सक्रियण के माध्यम से नियंत्रित किया जाता है, कोक्लीअ पीसीपी म्यूटेंट की सबसे मुख्य phenotypes में से एक बेतरतीब संवेदी epithelia 7 के साथ एक छोटा कर्णावत वाहिनी है। इसी तरह, माउस म्यूटेंट, जो सिलिया की कमी है, इसके अलावा, इस तरह के एक अभिसरण और विस्तार phenotype 8,9 दिखा रहे इस विनियमित किया जाता है ठीक कैसे elucidated जाना बना रहता है यद्यपि।

ve_content "> क्योंकि अभिसरण और विस्तार प्रक्रियाओं कर्णावत वाहिनी के परिणाम, और कर्णावत वाहिनी के भीतर संवेदी epithelia के सेलुलर patterning के लिए महत्वपूर्ण हैं, विकासशील कोक्लीअ जिसमें कशेरुकी विकास के दौरान पीसीपी सिगनल की जांच के लिए एक आदर्श अंग है। के अंग कोर्टी, अवधि विशेष संवेदी उपकला है कि लाइनों कर्णावत वाहिनी, गैर संवेदी समर्थन कोशिकाओं और mechanosensory बालों की कोशिकाओं जो समान रूप कोक्लीअ के लिए उन्मुख होना चाहिए 10 कार्य करने के लिए शामिल है के लिए दिया गया। mechanosensory बालों की कोशिकाओं इसलिए वजह से कहा जाता है प्रत्येक संवेदी बाल सेल 11 का (शिखर सतह)। mechanosensation की और stereocilia के रूप में उनके नामकरण के बावजूद प्राथमिक ट्रांसड्यूसर रूप में ये कार्य stereociliary बंडलों कि चर्म संबंधी थाली से विस्तार, वास्तव में संशोधित actin रेशा आधारित microvilli के शामिल हैं। प्रत्येक शेवरॉन के आकार बाल के भीतर बंडल, stereocilia की तीन पंक्तियों में एक उच्च आदेश दिया और नियमित रूप से देहात में आयोजित कर रहे हैंएक सीढ़ी मामले की तरह ढंग से ttern। रीयल microtubule आधारित सिलिया, करार दिया kinocilia, विकास और stereociliary बंडलों 12 के उन्मुखीकरण के लिए आवश्यक हैं। प्रत्येक बाल सेल पर, एक ही kinocilium शारीरिक रूप से stereocilia बंडल से जुड़ी है, केन्द्र stereocilia की सबसे ऊंची पंक्ति के निकट स्थित है। Kinocilium की सटीक समारोह स्पष्ट नहीं है, और एक परिकल्पना है कि kinocilium आकार में stereocilia 'खींचतान' के रूप में वे microvilli 12 से परिपक्व है। रीढ़ में, कोक्लीअ में kinocilia केवल वर्तमान क्षणिक हैं और सुनवाई 11,13,14 की शुरुआत करने से पहले चूहों में बालों की कोशिकाओं से वापस लेना।

गंभीर रूप से छोटा कर्णावत नलिकाओं में विकासशील कोक्लीअ परिणामों में सिलिया का पूरा नुकसान, गलत का गठन किया और stereociliary बंडलों, साथ ही गलत तैनात बेसल शव 8,9 एमआईएस उन्मुख। एक कार्यात्मक बरौनी सिर्फ सिलिअरी axoneme के शामिल नहीं है। सिलिया के साथ जुड़े कई प्रोटीनसमारोह में इस तरह बेसल शरीर, संक्रमण क्षेत्र, या सिलिअरी axoneme 15 के रूप में सिलिया से संबंधित उप डोमेन के लिए स्थानीय परिसरों में होते हैं। बेसल शरीर, केंद्रपिंड की मां तारककेंद्रक से प्राप्त होता है, यह भी सेल शरीर में बरौनी से दूर का विस्तार सूक्ष्मनलिकाएं के लिए एक microtubule आयोजन केंद्र है और intracellular तस्करी के रूप में अच्छी तरह से सिलिअरी की तस्करी को विनियमित कर सकते हैं। सिलिअरी संक्रमण क्षेत्र एक और क्षेत्र है जहां सिलिअरी समारोह आयात और सिलिअरी यौगिकों 16 के निर्यात के आयोजन के संदर्भ में नियंत्रित किया जाता है।

कई अध्ययनों, सिलिया और गैर विहित Wnt (पीसीपी संकेतन) के बीच एक संबंध की पहचान की है, हालांकि सटीक व्यवस्था स्पष्ट नहीं 17 है। सिलिअरी और पीसीपी जीनों के अतिरेक और सामान्यीकृत सेलुलर असामान्यताओं को सेल polarity की संवेदनशीलता, यह मुश्किल सीधे पीसीपी-विशिष्ट घाटे को एक उत्परिवर्तन से जोड़ने के लिए बनाते हैं। पीसीपी सिगनल के पढ़ने के बहिष्कार से एक बेसल शरीर और primar की स्थिति हैY बरौनी, इसलिए माध्यमिक दोषों से प्राथमिक छाँट कर अलग चुनौतीपूर्ण है। Zebrafish और माउस म्यूटेंट में कुछ अध्ययनों से संकेत 18-20 सिलिया और Wnt के बीच कोई संबंध का सुझाव दिया है। आंकड़ों में विसंगतियां प्रजातियों, ऊतक, या WNT सिगनल की दिशा में योगदान सिलिअरी में अस्थायी निर्भर मतभेद प्रतिबिंबित कर सकते हैं। इसके अलावा, सामान्य Wnt जवाबदेही बनाए रखा जा सकता है, तो बेसल शव कार्यात्मक रहते हैं। सेलुलर संकेत दे रास्ते और अन्य जैविक घटना में सिलिअरी प्रोटीन की भूमिका में एक गहरी अंतर्दृष्टि सेलुलर और विकासात्मक जीव विज्ञान की हमारी समझ है, साथ ही लक्षित उपचार रणनीतियों के विकास के लिए महत्वपूर्ण है।

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Protocol

का प्रयोग करें और संस्थागत और सरकारी दिशा निर्देशों और नियमों, सबसे अधिक सीओ 2 के माध्यम से साँस लेना और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के अनुसार सभी जानवरों euthanize।

1. अभिकर्मकों की तैयारी

ध्यान दें: शुरू करने से पहले, विश्लेषणात्मक ग्रेड रसायनों का उपयोग कर सभी अभिकर्मकों तैयार करते हैं। आणविक ग्रेड आसुत और विआयनीकृत पानी जब तक अन्यथा निर्दिष्ट का उपयोग कर समाधान करते हैं।

  1. फास्फेट खारा बफर (1x पीबीएस): एच 2 ओ का 1 एल में 8 जी NaCl, 0.2g KCl, 1.44g ना 2 HPO 4 और 0.24g के.एच. 2 4 पीओ भंग द्वारा 1x पीबीएस के 1 एल बनाओ एचसीएल के साथ 7.4 पीएच को समायोजित करें। पीबीएस बाँझ होने की जरूरत नहीं है और आरटी पर संग्रहित किया जा सकता है। ध्यान दें कि यह बफर CaCl 2 या 2 MgCl बिना किया जाता है।
  2. Paraformaldehyde (4% पीएफए): एक हवादार धूआं हुड में 1x पीबीएस में पीएफए ​​के एक 4% समाधान तैयार है। paraformaldehyde पाउडर के 40g 1x पीबीएस के 1 एल में जोड़े। लगभग 60 डिग्री को भंग करने के लिए, हलचल और गर्मी सी,और धीरे धीरे NaOH बुद्धिमान ड्रॉप पीएच बढ़ाने के लिए जोड़ सकते हैं। एक बार जब पाउडर भंग कर दिया है, एचसीएल के साथ 7.4 पीएच को बदल डालना। एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फिल्टर और aliquots फ्रीज। एक प्रयोग के लिए एक ताजा विभाज्य defrost।
  3. ट्राइटन बफर: एक 0.1 एम Tris एचसीएल तैयार (7.5 पीएच), 0.15 एम NaCl, 0.1% ट्राइटन X-100 समाधान 0.1 एम Tris एचसीएल (पीएच 7.5) का 1 एल में 8.77 छ NaCl भंग द्वारा। 1 मिलीलीटर ट्राइटन X-100 जोड़े। भंग करने के लिए हलचल। आरटी पर स्टोर ट्राइटन बफर।
  4. ट्राइटन ब्लॉक: ट्राइटन बफर के 9 मिलीलीटर बकरी सीरम के 1 मिलीलीटर जोड़कर ट्राइटन बफर में 10% बकरी सीरम तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। , माउस में उठाया प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग अवरुद्ध कदम के लिए ट्राइटन ब्लॉक करने के लिए 200 में 1 के एक कमजोर पड़ने पर बकरी विरोधी माउस आईजीजी फैब टुकड़े जोड़ें।
    नोट: योजना स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) के लिए नमूने का उपयोग करने के लिए, तो अतिरिक्त अभिकर्मकों के रूप में नीचे सूचीबद्ध तैयार करते हैं।
  5. हैंक्स 'संतुलित नमक समाधान (HBSS) कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ: एक शेयर के समाधान से गिराए द्वारा HBSS के एक 1x समाधान करेंबाँझ आसुत एच 2 ओ में HBSS बफर बनाने के लिए जटिल है और इसमें शामिल जोखिम को देखते हैं, यह एक premade 10x शेयर समाधान के आदेश की सलाह दी जाती है। HBBS नियमित रूप से इस्तेमाल बफर के अंतिम एकाग्रता निम्नलिखित है: 1.26 मिमी 2 CaCl, 0.49 मिमी 2 MgCl -6H2O, 0.41 मिमी MgSO 4 -7H2O, 5.33 मिमी KCl, 0.44 मिमी के.एच. 2 4 पीओ, 4.17 मिमी 3 NaHCO, १३७.९३ मिमी NaCl 0.34 मिमी ना 2 HPO 4, 5.56 मिमी Dextrose।
  6. HEPES बफर: 1 एल 1x HBSS बफर में 23.8 छ HEPES भंग द्वारा, 1x HBSS में एक 0.1 एम Hepes समाधान तैयार है।
  7. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी लगानेवाला (SEM फिक्स): HEPES बफर में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रेड glutaraldehyde (2.5%) और paraformaldehyde (4%) गिराए द्वारा SEM के लिए लगानेवाला तैयार करें। 2 CaCl 10 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ें।
  8. 1% आज़मियम tetroxide (Oso 4) HEPES बफर में; पानी में 1% आज़मियम tetroxide: HEPES बफर में आज़मियम tetroxide के एक शेयर समाधान पतला, और separatelबाँझ में Y आसुत एच 2 ओ, 1% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए। आज़मियम tetroxide बेहद जहरीला है और सबसे अधिक एक 4% समाधान के रूप में बेचा जाता है।
  9. 1% (w / v) Tannic एसिड: 50 मिलीलीटर में 0.5 ग्राम tannic एसिड भंग बाँझ आसुत एच 2 ओ फ़िल्टर 0.45 ताकना आकार फिल्टर के माध्यम से छान कर बाँझ।
  10. वर्गीकृत इथेनॉल समाधान श्रृंखला: बाँझ आसुत एच 2 ओ के साथ 200 प्रमाण इथेनॉल 30, 50, 70, 90 और 95% इथेनॉल समाधान बनाने के लिए पतला। अंतिम इथेनॉल rinses के लिए, 100% इथेनॉल 200 सबूत की आवश्यकता है। अंतिम rinses के लिए 200 प्रमाण इथेनॉल की एक बोतल खोली हौसले का प्रयोग करें।

2. ऊतक की पसंद

  1. आदर्श रूप में, भ्रूण दिन 16.5 (E16.5) और प्रसव के बाद 3 दिन (पी 3) की उम्र के बीच भ्रूण या युवा पिल्ले की जांच।
    नोट: बोनी भूलभुलैया और लौकिक हड्डियों की हड्डी बन जाना विच्छेदन उत्तरोत्तर अधिक चुनौतीपूर्ण के रूप में चूहों परिपक्व बनाता है। इसके अलावा kinocilia, केवल सच microtubule आधारित बरौनी कर्णावत बालों की कोशिकाओं पर पाया,विकास के दौरान पलटा और अब वयस्क चूहों में मौजूद है।
  2. निर्धारण के बाद, अम्लो व्दारा कैल्सियम वयस्क cochleae। रोटेशन के साथ 4 दिनों - 3 के लिए विच्छेदित जगह (धारा 3 देखें) बोनी लेबिरिंथ, 2 मिलीलीटर EDTA (पीबीएस में 4.13%), पीएच 7.3 में, एक microcentrifuge ट्यूब में। EDTA दैनिक भरपाई होगी। बाद ऊतकों नरम है, बढ़ आंदोलन के साथ एक nutator पर 5 मिनट के लिए 1.5 मिलीलीटर या अधिक पीबीएस 3 बार में कुल्ला।

3. कोक्लीअ विच्छेदन

  1. ग्रीवा अव्यवस्था या सीओ 2 साँस लेना के माध्यम से पोस्ट euthanization (100% सीओ 2), सिर को हटा दें। बाण के मध्य रेखा के साथ सिर काटना करने के लिए नाक में शुरुआत और दुमदारी का विस्तार एक स्केलपेल ब्लेड या कैंची के छोटे जोड़ी का उपयोग करें, जानवर के आकार के आधार पर। संदंश की एक जोड़ी के साथ खोपड़ी के प्रत्येक आधे से मस्तिष्क निकालें। लौकिक हड्डियों, जो भीतरी कान के विकास बोनी लेबिरिंथ शामिल पहचानें (चित्रा 1 ए में तीर देखें)।
  2. के लिए की एक जोड़ी का उपयोग करेंCeps ध्यान से खोपड़ी (लौकिक हड्डियों) से बोनी लेबिरिंथ अलग करने के लिए। एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत यह मत करो। बोनी लेबिरिंथ के नीचे धीरे संदंश चलाने के द्वारा खोपड़ी से बोनी ऊतक दूर Prise। अप करने के लिए पी 4 जानवरों में बोनी लेबिरिंथ अभी भी उपास्थि हैं और आसानी से तोड़ने के बिना हटाया जा सकता है।
  3. विच्छेदन के बाद, अंडाकार और दौर खिड़कियों को साफ करने और कर्णावत सर्पिल के शीर्ष में एक छोटा सा छेद बनाने के लिए विदारक संदंश की नोक का उपयोग करें। कर्णावत वाहिनी के आगे विच्छेदन से पहले बोनी लेबिरिंथ को ठीक करें। tectorial झिल्ली की आसान हटाने के लिए अनुमति देने के लिए (3.7 देखें), बर्फ पर 5 मिनट के लिए 1.5 मिलीलीटर 4% पीएफए ​​में बोनी लेबिरिंथ तय कर लो।
    नोट: यदि tectorial झिल्ली को हटाने की आवश्यकता नहीं है, अब निर्धारण की सलाह दी है (4.1 देखें - 4.3)। कर्णावत वाहिनी के विच्छेदन के लिए पहले लौकिक हड्डियों का संक्षिप्त निर्धारण विच्छेदन की प्रक्रिया और tectorial झिल्ली को हटाने के एड्स। पोस्ट विच्छेदन और Corti के अंग के जोखिम, furtउसका निर्धारण आवश्यक है।
  4. इसके अलावा इस प्रकार के रूप कर्णावत संवेदी उपकला बेनकाब करने के लिए बोनी लेबिरिंथ काटना। एक काले रंग की सिलिकॉन elastomere लेपित विदारक पीबीएस युक्त विच्छेदन की सुविधा के लिए पकवान में बोनी लेबिरिंथ रखें। ऊतक स्थिर करने के लिए यदि आवश्यक हो minutien पिन का प्रयोग करें। minutien पिन का उपयोग करने के लिए, उन्हें कर्णावत सर्पिल ऊपर की ओर का सामना करना पड़ के उदर पहलू के साथ बोनी लेबिरिंथ के vestibular भाग के माध्यम से जगह है।
    नोट: काले सिलिकॉन elastomere पकवान: पाउडर लकड़ी का कोयला के साथ सिलिकॉन elastomere बेस घटक मिक्स एक अपारदर्शी काले रंग प्राप्त करने के लिए। इलाज एजेंट जोड़े और एक या अधिक पेट्री डिश (कांच या प्लास्टिक) में डाल देना। वैक्यूम के अंतर्गत सूखी फंस हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए। सूखी व्यंजन पूरी तरह से उपयोग करने से पहले।
  5. ठीक संदंश (# 5) बाहरी उपास्थि कर्णावत वाहिनी को प्रकाश में लाने को दूर करने के लिए प्रयोग करें। अंडाकार खिड़की पर शुरू करो; अंडाकार खिड़की में संदंश के नीचे टिप डालने और धीरे उपास्थि खोलने जिज्ञासा, धीरे-धीरे ऊपर की ओर की ओर आगे बढ़सर्वोच्च।
  6. कर्णावत वाहिनी के प्रदर्शन के बाद, उदर की सतह, रेइस्स्नेर की झिल्ली को हटा दें। कर्णावत वाहिनी के आधार पर रेइस्स्नेर की झिल्ली चुटकी और ऊपर एक प्रस्ताव में इसे बंद छील करने के लिए संदंश का जुर्माना जोड़ी का उपयोग करें। कर्णावत वाहिनी के पृष्ठीय पहलू कल्पना, संवेदी उपकला भी शामिल है।
  7. नीचे (वैकल्पिक) के रूप में वर्णित tectorial झिल्ली निकालें। SEM या kinocilium की immunohistochemistry या stereociliary बंडलों के लिए tectorial झिल्ली को हटा दें।
  8. कोक्लीअ के आधार पर tectorial झिल्ली चुटकी और शीर्ष की ओर ऊपर की तरफ छील करने के लिए संदंश (# 55 या महीन) का एक बहुत ही सुन्दर जोड़ी का उपयोग करें।
    ध्यान दें: tectorial झिल्ली ऑप्टिकली स्पष्ट है जो यह पहचान करना मुश्किल बना देता है। अधिक से अधिक बार नहीं की तुलना में झिल्ली एक टुकड़ा में उतर आता है और यद्यपि यह आसानी से कल्पना नहीं है, एक प्रतिरोध महसूस कर सकते हैं के रूप में यह कोर्टी के उजागर अंग से दूर खींच लिया है।
  9. Corti के अंग को प्रकाश में लाने के बाद, आगे विकास के रूप में ऊतक को ठीकनीचे escribed। vestibular क्षेत्र बनाए रखने के ऊतकों की आगे की तैयारी सहायता करने के लिए।

4. फिक्सेशन

  1. नियमित immunohistochemistry के लिए 2 घंटे के लिए एक nutator पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 मिलीलीटर 4% पीएफए ​​में विच्छेदित बोनी लेबिरिंथ तय कर लो।
    नोट: लंबाई और निर्धारण की संरचना में एंटीबॉडी और एंटीजन, विविधताओं भिन्न की संवेदनशीलता की वजह से आवश्यक हो सकता है और प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  2. निर्धारण के बाद, बढ़ आंदोलन के साथ एक nutator पर 5 मिनट के लिए 1.5 मिलीलीटर या अधिक पीबीएस 3 बार में rinsing द्वारा नमूने धो लें। नमूने प्रक्रिया से पहले कई हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में संग्रहित किया जा सकता है।
  3. अगर SEM के लिए नमूने की तैयारी, आरटी पर 2 घंटे के लिए (1.7 देखें) SEM तय में लौकिक हड्डियों विच्छेदित को ठीक करें। 1.5 मिलीलीटर या अधिक HEPES बफर वृद्धि हुई आंदोलन के साथ एक nutator पर 5 मिनट के लिए 3 बार में rinsing द्वारा धो लें। आगे की प्रक्रिया जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर HEPES बफर में स्टोर। सप्ताह की एक जोड़ी के लिए अब से भंडारणएस सिफारिश नहीं है।

5. Immunohistochemistry

  1. एक फ्लैट तली 96 अच्छी तरह से थाली में से एक कुएं में विच्छेदित नमूनों पर immunohistochemistry प्रदर्शन। वैकल्पिक रूप से, एक पीसीआर या microcentrifuge ट्यूब का उपयोग करें। यह प्रसंस्करण की सुविधा के लिए बोनी भूलभुलैया के vestibular हिस्से को बनाए रखने की सलाह दी जाती है।
  2. कोमल आंदोलन के साथ एक nutator पर आरटी पर 1 घंटे के लिए 1.5 मिलीलीटर ट्राइटन बफर में incubating द्वारा ऊतक Permeabilize।
  3. आरटी पर 1 घंटे की एक न्यूनतम के लिए 0.5 मिलीलीटर ट्राइटन ब्लॉक में incubating द्वारा ऊतक ब्लॉक। अगर माउस में उठाया प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग, 200 में 1 की एक कमजोर पड़ने (धारा 1.4 देखें) पर ब्लॉक करने के लिए विरोधी माउस आईजीजी फैब टुकड़े जोड़ें। यह बहुत गैर विशिष्ट माउस के ऊतकों को विरोधी माउस आईजीजी के बंधन कम हो जाती है।
  4. कोमल आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्राइटन ब्लॉक हे / एन में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊतक सेते हैं। एंटीबॉडी कमजोर पड़ने (धारा 6.1 देखें) इस्तेमाल किया जा रहा एंटीबॉडी पर निर्भर करता है। वैकल्पिक रूप से प्राथमिक antibodie सेतेआरटी पर 2 घंटे के लिए है। आदर्श रूप में 0.5 मिलीलीटर प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने की एक न्यूनतम मात्रा का उपयोग करें। तो एंटीबॉडी सीमित है, एंटीबॉडी कमजोर पड़ने लगता है कि पूरी तरह से ऊतक envelops की छोटी मात्रा का उपयोग करें।
  5. 1.5 मिलीलीटर या अधिक ट्राइटन बफर, 15 मिनट के लिए 3 बार की एक न्यूनतम में rinsing, बढ़ आंदोलन के साथ एक nutator पर ऊतक से धो लें।
  6. एक nutator पर आरटी पर 1 घंटे के लिए ट्राइटन ब्लॉक में फ्लोरोसेंट डाई संयुग्मित माध्यमिक निर्माताओं पर पतला एंटीबॉडी के साथ ऊतक सेते सिफारिश की एकाग्रता (1000 आम तौर पर 1: 200-1)। 0.5 मिलीलीटर माध्यमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने की एक न्यूनतम मात्रा का प्रयोग करें।
    1. 13,000 XG पर पतला एंटीबॉडी अपकेंद्रित्र 3 मिनट के लिए पूर्व माध्यमिक एंटीबॉडी समुच्चय के गैर विशिष्ट बंधन को कम से कम करने के लिए उपयोग करने के लिए। इस कदम के बाद से प्रकाश से ऊतक शील्ड फ्लोरोसेंट रंगों photobleaching से बचने के लिए।
  7. 5.5 कदम के रूप में, 15 मिनट के लिए 1.5 मिलीलीटर या अधिक ट्राइटन बफर, 3 बार की एक न्यूनतम में rinsing द्वारा ऊतक धोने एक परआंदोलन के साथ वृद्धि हुई nutator। 4 डिग्री सेल्सियस तैयार है जब तक पर पीबीएस में स्टोर नमूने माउंट करने के लिए।

6. एंटीबॉडी चयन

नोट: सिफारिश एंटीबॉडी और उनके dilutions के स्रोत के विशिष्ट सामग्री और उपकरणों की तालिका में सूचीबद्ध हैं। धारा 5 में वर्णित के रूप में एंटीबॉडी incubations प्रदर्शन करना।

  1. या विरोधी acetylated-α ट्यूबिलिन (1: 800): microtubule आधारित kinocilium कल्पना करने के लिए, एक सिलिअरी इस तरह के विरोधी Arl13b (1000 1) के रूप में axoneme मार्कर का उपयोग करें। (: 200 1) या किसी अन्य centrosomal मार्कर बेसल शरीर γ ट्यूबिलिन के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग कल्पना।
  2. माध्यमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन के लिए कई अलग अलग fluorophores के एक संयुग्मित: - (1000 300 1) actin रेशा युक्त stereociliary बंडलों कल्पना, phalloidin जोड़ें। Phalloidin भी प्रत्येक उपकला बाल सेल की परिधि के आसपास के cortical एक्टिन तंतु सहित अन्य filamentous actin संरचनाओं लेबल। यह निर्धारित करने में सहायक होता हैप्रत्येक बाल सेल की रूपरेखा। यदि आवश्यक हो तो: इस तरह के विरोधी Zo-1 (500 1) के रूप में एक विकल्प झिल्ली मार्कर का प्रयोग करें।
  3. या मायोसिन VIIa (1: 1,000): मायोसिन छठी (1000 1) के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर्णावत बालों की कोशिकाओं लेबल। ये कोक्लीअ लंबाई का आकलन करता है, तो इस्तेमाल किया जा सकता है।

नोट: का प्रयोग उचित फ्लोरोसेंट डाई संयुग्मित माध्यमिक माइक्रोस्कोप की आवश्यकताओं के लिए अनुकूलित एंटीबॉडी।

7. बढ़ते और इमेजिंग

  1. एक काले रंग की सिलिकॉन elastomere पीबीएस युक्त डिश में नमूना रखें। ठीक संदंश का प्रयोग, कर्णावत सर्पिल से vestibular क्षेत्र को हटा दें।
  2. बहुत ध्यान से कर्णावत सर्पिल से अंतर्निहित उपास्थि और mesenchyme को हटा दें। शेष कर्णावत सर्पिल भीतरी परिखा, कोर्टी और बाहरी परिखा का अंग होता है।
  3. पीबीएस की एक बूंद एक खुर्दबीन स्लाइड पर रखा में कर्णावत सर्पिल स्थानांतरण। अगर वांछित, एक बारी के बराबर टुकड़ों में कर्णावत सर्पिल अलग। हालांकि यह कदम आवश्यक नहीं है, और मैं करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैंऊतक के ओ.एस.एस.। शिखर सतह कर्णावत बालों की कोशिकाओं की (stereocilia पक्ष) coverslip की दिशा ऊपर की ओर का सामना करना पड़ जाना चाहिए।
  4. बाती दूर पीबीएस एक पी लेनेवाला ऊतक या फिल्टर पेपर के टुकड़े के साथ और धीरे कर्णावत सर्पिल स्थान बदलने यदि epithelia स्थानांतरित कर दिया और खुद पर overlaps गया है।
  5. बढ़ते मीडिया की एक बूंद सीधे कोक्लीअ नमूना पर जोड़ें और धीरे शीर्ष पर एक coverslip जगह, देखभाल करने के लिए हवाई बुलबुले से बचने के लिए। कोई spacers आवश्यक हैं; नमूना पर सीधे coverslip जगह। एक पानी में घुलनशील, गैर fluorescing, अर्द्ध स्थायी बढ़ते मध्यम जो जगह में coverslip धारण करने के लिए अतिरिक्त कदम की आवश्यकता नहीं है की सिफारिश की है। बढ़ते मीडिया और coverslip मोटाई विनिर्देशों माइक्रोस्कोप के लिए मिलान किया जाना चाहिए।
  6. कर्णावत बाल सेल के शिखर सतह की छवियों पर कब्जा करने के उद्देश्य -, उच्च संख्यात्मक एपर्चर (1.4 1.2) - एक epifluorescent या लेजर स्कैनिंग confocal उच्च वृद्धि (100x 63) के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। उपयोग लोwer उद्देश्यों (5 - 20X) कर्णावत वाहिनी की लंबाई यों तो कर्णावत सर्पिल की छवियों ओवरलैपिंग लेने के लिए। मैच उत्तेजना लेजर और माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए इस्तेमाल करने के लिए fluorophores उत्सर्जन फिल्टर।

8. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

  1. खंड 4.3 से आगे बढ़ें। HEPES बफर में SEM तय नमूने धोने के बाद, वेंटिलेशन के तहत निम्न चरणों का प्रदर्शन करते हैं। निम्नलिखित प्रोटोकॉल कोक्लीअ ऊतक के लिए अच्छी तरह से काम करता है और एक प्रवाहकीय धातु के साथ धूम कोटिंग के उपयोग से बचा जाता है।
  2. 1% Oso 4 1 घंटे के लिए HEPES बफर में पोस्ट तय, 5 मिनट प्रत्येक के लिए आसुत जल 1 मिलीलीटर के साथ 3 washes के द्वारा पीछा किया। Oso 4 की छोटी मात्रा है कि पूरी तरह से ऊतक envelops जहरीले कचरे को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। कोई आंदोलन की आवश्यकता है।
  3. आरटी पर नमूने निम्न समाधानों में से प्रत्येक में कदम के बीच में 5 मिनट प्रत्येक के लिए 1 मिलीलीटर आसुत जल के साथ 3 washes के साथ 1 घंटे के लिए सेते हैं: 1% Tannic एसिड हौसले पानी और fil में किए गएउपयोग करने से पहले tered; पानी में 1% Oso 4, पानी में 1% tannic एसिड, पानी में 1% Oso 4।
  4. 30, 50, 70, 90, और 95%: निम्नलिखित dilutions में से प्रत्येक में 10 मिनट के लिए ऊष्मायन से एक वर्गीकृत इथेनॉल श्रृंखला के माध्यम से नमूने निर्जलीकरण। कोई आंदोलन की आवश्यकता है।
  5. तीन परिवर्तन, 5 मिनट प्रत्येक, 100% इथेनॉल के माध्यम से स्थानांतरण के नमूने (200 प्रमाण इथेनॉल के नए खोले बोतल से)।
  6. निर्माता के निर्देशों का पालन हालांकि एक महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने की मशीन नमूने चलाएँ।
  7. एक SEM ठूंठ एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग के लिए पहले के शीर्ष पर प्रवाहकीय कार्बन चिपकने का उपयोग नमूने माउंट। एक stereomicroscope के तहत, धीरे कर्णावत epithelia का सामना करना पड़ के साथ नमूना की स्थिति के लिए ठीक संदंश और एक तूलिका की एक जोड़ी का उपयोग करें। 'लंगर' ठूंठ के लिए ऊतक के लिए नमूना के vestibular हिस्से का प्रयोग करें। इमेजिंग तक Desiccator में स्टोर नमूने हैं। जोन्स (2012), 21 में वर्णित के रूप में SEM इमेजिंग प्रदर्शन।

9।मात्रा का ठहराव

  1. immunohistochemistry तैयारी के बाद, एक epifluorescent या लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन का उपयोग कर छवियों के अधिग्रहण। SEM के लिए तैयार करने के बाद, नमूनों छवि के लिए एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। छवि उजागर कर्णावत बालों की कोशिकाओं और intercalated समर्थन कोशिकाओं के साथ Corti के अंग के शिखर सतह।
  2. कर्णावत वाहिनी के साथ विशिष्ट पदों को परिभाषित करें, बेस से इस तरह के रूप में 25, 50, और 75% और उत्परिवर्ती और नियंत्रण नमूनों के बीच कोक्लीअ क्षेत्रों की तुलना करने के लिए इन का उपयोग करें। विश्लेषण और उनकी littermate नियंत्रण के साथ सिलिया म्यूटेंट की तुलना, के रूप में आनुवंशिक पृष्ठभूमि में मतभेद कर्णावत phenotype संशोधित कर सकते हैं।
    नोट: Corti के अंग एक ढाल है कि दोनों शीर्ष और आधार की ओर मध्य आधार से फैली में विकसित करता है। माउस में, विकास P14 जब तक पूरा नहीं हुआ है, तो यह समान विकास के चरणों और पदों पर क्षेत्रों की तुलना करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  3. तस्वीरें ले लो सॉफ्टवेयर का उपयोग कर माइक्रोस्कोप है कि allo साथडब्ल्यू विशेष phenotype की मात्रा का ठहराव के लिए आवश्यक के रूप में (देखें नीचे)। माइक्रोस्कोप के साथ, लंबाई मापने कोशिकाओं की गिनती और नीचे के रूप में वर्णित प्रोटीन स्थानीयकरण निर्धारित करने के लिए इस तरह की छवि जम्मू या सॉफ्टवेयर के रूप में छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें। ग्राफ एक बार चार्ट, तितर बितर साजिश, बॉक्स धब्बा या हिस्टोग्राम, उत्परिवर्ती बनाम नियंत्रण की तुलना के रूप में इन डेटा।
  4. कर्णावत वाहिनी (चित्रा 3 ए) की कुल लंबाई:
    1. एक बाल सेल मार्कर या phalloidin, (जो stereociliary बंडलों के निशान) का उपयोग करना, निर्धारित और उपाय जहां संवेदी उपकला शुरू होता है और समाप्त होता है। कर्णावत वाहिनी की लंबाई अक्सर सिलिया म्यूटेंट में छोटा है।
  5. Stereociliary बंडल असामान्यताएं (चित्रा 3 बी, डी, ई, जी):
    1. उपाय बंडल के शिखर और लाइन है कि बंडल 'हथियार' के रूप में चित्र में दिखाया गया है 3 जी के दोनों सिरों के माध्यम से फैली बीच कम से कम दूरी के रूप में बंडल उत्तलता (ऊंचाई), छोड़ दिया है। वैकल्पिक रूप से, क्षेत्र योंबाहरी बाल सेल stereociliary बंडल के हथियारों से घिरा के रूप में चित्रा 3 जी में दिखाया गया है, सही है। परिपत्र stereociliary बंडलों पहचाना जा सकता है के साथ बालों की कोशिकाओं की कुल बालों की कोशिकाओं का एक प्रतिशत के रूप में इन गिनती हैं।
      नोट: कई सिलिअरी म्यूटेंट में बंडल असामान्यताएं बंडल उन्मुखीकरण की परवाह किए बगैर देखा जा सकता है। यह सही stereociliary बंडल असामान्यताएं अंदाजा लगाना मुश्किल है।
  6. Stereociliary बंडलों (चित्रा 3 बी, सी, जी) के अभिविन्यास:
    1. एक लाइन स्तंभ कोशिकाओं की पंक्ति है कि भीतरी और बाहरी बालों की कोशिकाओं को अलग करने के लिए खड़ा का विस्तार करने के लिए प्रत्येक व्यक्ति के बंडल रिश्तेदार के उन्मुखीकरण का आकलन करें। एक सामान्य उन्मुखीकरण के साथ कोशिकाओं को इस सीधा अक्ष के साथ गठबंधन कर रहे हैं और इतने 0 डिग्री के एक रोटेशन है। 0 डिग्री से 360 डिग्री या तो एक संकेतन या के रूप में शुद्ध विचलन का उपयोग कर रोटेशन के कोण का निर्धारण करते हैं।
  7. Kinocilia स्थिति या stereociliary बंडल स्थिति (चित्रा3 बी, एफ, एच):
    1. कोशिकाओं का प्रतिशत जिसमें kinocilia याद कर रहे हैं भरोसा रखो। बंडल के 'शिखर' या केंद्र के लिए kinocilium से दूरी को मापने। बंडल के 'शिखर' अगर बंडलों असामान्य हैं, और इसलिए बंडल के केंद्र बजाय प्रयोग किया जा सकता है परिभाषित करने के लिए आसान नहीं हो सकता।
  8. शिखर बाल कोशिका की सतह पर kinocilia और stereociliary बंडलों की स्थिति यों, एक बाल सेल पर एक स्थितीय ग्रिड overlaying और या तो kinocilium का आधार या stereociliary बंडल के शिखर / केन्द्र के स्थान अंकन द्वारा। डेटा प्रदर्शित प्रत्येक वर्ग का एक प्रतिशत है कि ग्रिड के एक विशिष्ट क्षेत्र के भीतर निहित के रूप में, और एक स्थितीय ग्रिड पर प्रत्येक अंकन के स्थानों overlaying द्वारा।
    नोट: नियंत्रण ऊतकों में, kinocilia हमेशा stereociliary बंडल के शिखर से जुड़े होते हैं। सिलिया म्यूटेंट में, kinocilia अक्सर याद कर रहे हैं, अभी तक mislocalized अभी भी जुड़ी हुई है, या भी पूरी तरह से अलग रोंtereociliary बंडल।
  9. Kinocilia लंबाई (चित्रा 3I):
    1. एक सिलिअरी axoneme मार्कर के साथ लेबल करके kinocilium की लंबाई मापने। केवल kinocilia कि एक 1.5 माइक्रोन confocal विमान के भीतर फ्लैट झूठ को मापने। पुष्टि करें कि सिलिया स्कैन ऊतक के एक पार के अनुभागीय दृश्य को देख कर फ्लैट झूठ बोल रहे हैं। कोक्लीअ के एक ही क्षेत्र से वृद्ध मिलान किया नमूनों की तुलना के बाद से kinocilium विकास के दौरान पलटा।
  10. polarity प्रोटीन के Mislocalization:
    1. ऐसे Vangl2 और Gαi3 के रूप में polarity प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग immunohistochemistry के बाद, इमेजिंग के जरिए स्थानीयकरण का निर्धारण।

नोट: कुछ सिलिया म्यूटेंट में, polarity प्रोटीन का स्थानीयकरण बाधित है। ये Vangl2 और Gαi3, जो Ift20, Bbs8 और Bbs6 उत्परिवर्ती कोक्लीअ में बाधित हो दिखाया गया है शामिल हैं।

नोट: कैसे यों और प्रदर्शन बाल सेल polarit करने के लिए आगे उदाहरणY निम्नलिखित कागजात में पाया जा सकता है। कर्टिन, एट अल। (2003) वर्तमान जीवविज्ञान 22, Montcouquiol, एट अल। (2003) प्रकृति 7, वैंग, एट अल (2006) तंत्रिका विज्ञान 23, Montcouquiol, एट अल के जर्नल। (2008) आण्विक जीवविज्ञान 24 मई-Simera, एट अल तरीके। (2012) आण्विक जीवविज्ञान में 25 तरीके, यिन एट अल (2012) एक PLoS 26।

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Representative Results

कोक्लीअ विच्छेदन और ऊतक तैयार

मस्तिष्क को हटाने के बाद, एक P0 माउस सिर, बोनी भूलभुलैया, पीछे से देखा है, कल्पना की जा सकती है (चित्रा 1 ए, सफेद तीर) और हटाया के पद के मध्य लाइन बाण विच्छेदन। चित्रा 1 बी कर्णावत बालों के साथ अलग से पता चलता बोनी लेबिरिंथ ऊपर की ओर का सामना करना पड़, उदर (बाएं) और पीछे से, पृष्ठीय (दाएं)। अंडाकार खिड़की करने के लिए सफेद तीर अंक जिसमें से एक बाहरी उपास्थि को हटाने शुरू कर सकते हैं। एक बार पूरी तरह से बाहरी उपास्थि हटा दिया गया है, उजागर कर्णावत वाहिनी, अभी भी बरकरार है, देखा जा सकता है (चित्रा 1 सी)। vestibular क्षेत्र विच्छेदन की सहायता के लिए के माध्यम से एक पिन के पोजिशनिंग दिखाया गया है। दो पिन, विभिन्न कोणों पर रखा भी ऊतक लंगर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। चित्रा -1 रेइस्स्नेर 'को हटाने के बाद कर्णावत वाहिनी से पता चलता हैकी झिल्ली और tectorial झिल्ली (बाएं) और पृथक कर्णावत उपकला सर्पिल एक बार यह immunohistochemistry (दाएं) के लिए बढ़ते के लिए तैयार करने में vestibular क्षेत्र से अलग-थलग कर दिया गया है। उजागर कर्णावत बाल, की तरह दिखता है क्या एक अक्षुण्ण SEM तैयारी चित्रा 1E में दिखाया गया है की एक सामान्य विचार देने के लिए।

आकृति विज्ञान और immunofluorescence नियंत्रण कोक्लीअ में

कर्णावत ऊतक की तैयारी के बाद, Corti के अंग युक्त कर्णावत वाहिनी के पृष्ठीय सतह से अवगत कराया है और SEM या immunofluorescent धुंधला के माध्यम से देखा गया सकते हैं। एक पूरे माउंट तैयारी के रूप में देखा जाता है, mechanosensory बालों की कोशिकाओं (भीतरी बालों की कोशिकाओं की एक पंक्ति और बाहरी बालों की कोशिकाओं की तीन पंक्तियों) की चार पंक्तियों प्रतिष्ठित किया जा सकता है। चित्रा 2A एक भ्रूण माउस कोक्लीअ से बेसल बारी से एक कम बढ़ाई देखने से पता चलता तैयार चया SEM। वर्दी अभिविन्यास और actin आधारित stereociliary बंडलों के संरेखण पर ध्यान दें। इसके अतिरिक्त stereociliary बंडलों की आकृति विज्ञान संगत है, प्रत्येक बंडल शास्त्रीय ")" (भीतरी बालों की कोशिकाओं पर) या "डब्ल्यू" (बाहरी बालों की कोशिकाओं पर) आकार की है। इस उम्र में करीब बढ़ाई पर अतिरिक्त microvilli न केवल बालों की कोशिकाओं के शिखर सतह पर देखा जा सकता है, लेकिन यह भी बीच में समर्थन कोशिकाओं (चित्रा 2 बी) पर बालों की कोशिकाओं। ये बाहरी बालों की कोशिकाओं और दो वयस्कों में इनर बालों की कोशिकाओं पर पर stereociliary बंडलों के केवल तीन पंक्तियों छोड़ने दूर जाना होगा। जैसा कि चित्र -2 (सफेद तीर) में देखा जा सकता है, एक भी microtubule आधारित kinocilium (एक सच्चे प्राथमिक बरौनी) प्रत्येक stereociliary बंडल के शिखर पर stereocilia की सबसे ऊंची पंक्ति के निकट स्थित है। ये kinocilia लिंक के माध्यम से बंडल से जुड़े होते हैं।

phalloidin, जो प्रयोगशाला के साथ फ्लोरोसेंट लेबलिंगएल्स actin, वर्दी अभिविन्यास और नियंत्रण ऊतक (चित्रा 2 डी) में बंडलों की आकृति पर प्रकाश डाला गया। Cortical actin भी लेबल है, जो प्रत्येक व्यक्ति बाल सेल के शिखर परिधि निर्धारित करने के लिए उपयोगी है। और phalloidin के साथ सह-लेबलिंग मायोसिन 7a (चित्रा 2 ई) के खिलाफ एक एंटीबॉडी, एक बाल सेल मार्कर, यह भी बालों की कोशिकाओं और समर्थन कोशिकाओं के बीच अंतर करने के लिए मदद करता है। मायोसिन 7a भी कर्णावत वाहिनी विस्तार (चित्रा 3A देखें) को मापने के लिए एक उपयोगी मार्कर है। Acetylated-α ट्यूबिलिन के खिलाफ एक एंटीबॉडी सामान्यतः microtubule आधारित kinocilium (चित्रा 2 एफ) की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है। समर्थन कोशिकाओं को भी प्राथमिक सिलिया बंदरगाह के रूप में, यह बालों की कोशिकाओं से उत्पन्न बनाम समर्थन कोशिकाओं intercalating सिलिया के बीच भेद करने के लिए महत्वपूर्ण है। ऐसे ZO-1 (Zona Occludens 1), जो स्पष्ट रूप से कर्णावत वाहिनी के शिखर झिल्ली की पच्चीकारी patterning की रूपरेखा के खिलाफ एंटीबॉडी के रूप में एक अतिरिक्त झिल्ली मार्कर, इसलिए उपयोगी है (<strong> चित्रा 2 एफ)। आगे इस पर विचार है कि acetylated-α ट्यूबिलिन के खिलाफ एंटीबॉडी भी आंतरिक सूक्ष्मनलिकाएं लेबल और तो ध्यान जब बाल सेल शिखर सतह पर ध्यान केंद्रित करने के लिए इमेजिंग से लिया जाना चाहिए। स्तंभ कोशिकाओं में सूक्ष्मनलिकाएं विशेष रूप से सघन (चित्रा 2 जी, सफेद तारांकन) कर रहे हैं। Phalloidin और विरोधी acetylated-α ट्यूबिलिन लेबलिंग का एक संयोजन अक्सर एक साथ stereociliary बंडलों और पड़ोसी kinocilia (चित्रा 2 जी, सफेद तीर) की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है।

सिलिया म्यूटेंट में कर्णावत Phenotype

कर्णावत वाहिनी के बढ़ाव अभिसरण और विस्तार दोषों का सबसे अच्छा पढ़ने के बहिष्कार से एक है, और छोटा कर्णावत नलिकाओं आमतौर पर शास्त्रीय पीसीपी म्यूटेंट में मनाया जाता है। सिलिअरी म्यूटेंट में कोक्लीअ अक्सर कर्णावत नलिकाओं छोटा और संवेदी epithe की एक उल्लेखनीय विस्तार दिखा दिया हैशीर्ष पर lia, के रूप में कर सकते हैं Ift20 cko / में देखा गया चूहों (चित्रा 3) के cko। / - - चूहों दोनों immunohistochemistry के साथ (चित्रा 3 बी, सही तीर) और SEM (चित्रा 3 सी) के साथ के रूप में देखा जा सकता Bbs8 एक और शास्त्रीय पीसीपी दोष, कर्णावत बालों की कोशिकाओं की वर्दी उन्मुखीकरण के लिए व्यवधान है। एमआईएस उन्मुख बंडलों के अलावा, चपटा और कुरूप बंडलों भी आमतौर पर मनाया जाता है (चित्रा 3 बी, मध्य तीर, चित्रा 3 डी)। अक्सर बार परिपत्र बंडलों के रूप में कर सकते हैं चित्रा 3E में देखा गया, वर्तमान, विशेष रूप से kinocilia का पूरी तरह से रहित बालों की कोशिकाओं में हैं। kinocilium की गलत स्थानीयकरण भी आम है।

गलत स्थानीय kinocilium कर सकते हैं या stereociliary बंडल (चित्रा 3 बी, बाएँ तीर, चित्रा 3F) से जुड़ी नहीं किया जा सकता है। कैसे बू यों के उदाहरणndle अभिविन्यास और kinocilia या बंडल स्थिति चित्रा 3 जी और 3H में दिखाया जाता है। प्रत्येक व्यक्ति के बंडल के उन्मुखीकरण तो एक लाइन स्तंभ कोशिकाओं की पंक्ति है कि भीतरी और बाहरी बालों की कोशिकाओं को अलग करने के लिए सीधा को विस्तार देने के लिए बंडल रिश्तेदार का निर्धारण करने के रोटेशन द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। एक सामान्य उन्मुखीकरण के साथ कोशिकाओं को इस सीधा अक्ष के साथ गठबंधन कर रहे हैं और इतने 0 डिग्री (चित्रा 3 जी) के एक रोटेशन है। Kinocilium, या stereociliary बंडल के केंद्र की स्थिति, बालों की कोशिकाओं की सतह पर एक lumenal स्थितीय ग्रिड overlaying और फिर kinocilia के स्थान का निर्धारण या ग्रिड (चित्रा 3I) के भीतर बंडल द्वारा साजिश रची जा सकता है। सिलिया जीन में म्यूटेशन अक्सर सिलिया लंबाई को प्रभावित है, और इसलिए kinocilium की लंबाई का आकलन किया जा सकता है। Cep290 rd16 / rd16 म्यूटेंट में, kinocilia नियंत्रण (चित्रा 3J) की तुलना में लंबे समय तक रहे। बरौनी पलटा के रूप में,यह उम्र मिलान कूड़े साथियों के लिए है और कोक्लीअ के एक ही क्षेत्र से माप लेने के लिए महत्वपूर्ण है। विश्लेषण और मात्रा का ठहराव के लिए अच्छा छवियों, दोनों immunohistochemistry और SEM के लिए मिलता है, यह tectorial झिल्ली को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है। चित्रा 3F एक SEM माइक्रोग्राफ जिसमें tectorial झिल्ली पूरी तरह से नहीं हटाया गया है पता चलता है।

आकृति 1
चित्रा 1. एक विकासशील माउस कोक्लीअ (P0) के विच्छेदन। (ए) P0 माउस सिर के मध्य रेखा बाण विच्छेदन मस्तिष्क के साथ हटा दिया। बोनी भूलभुलैया के पद पर सफेद तीर अंक। (बी) के उदर (बाएं) और पृष्ठीय (दाएं) विच्छेदित बोनी लेबिरिंथ के विचारों। कोक्लीअ अंडाकार खिड़की के नीचे सफेद तीर बिंदुओं पर vestibular हिस्से के साथ ऊपर की ओर स्थित है। (सी) बोनी भूलभुलैया पिछाड़ीकोक्लीअ के बाहरी उपास्थि के ईआर हटाने। एक पिन vestibular प्रणाली के माध्यम से रखा गया है। (डी) बाएँ, रेइस्स्नेर की झिल्ली और tectorial झिल्ली को हटाने के बाद सी के रूप में ही देखें। ठीक है, अलग-थलग कर्णावत वाहिनी बढ़ते के लिए तैयार है। एक अक्षुण्ण, उजागर कर्णावत सर्पिल कर्णावत वाहिनी के फर्श, संवेदी उपकला सहित प्रकाश में लाने की (ई) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ। स्केल बार 100 माइक्रोन है। । (ए - डी) मई-Simera एट अल से अनुकूलित, 2012 25 यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. आकृति विज्ञान और immunofluorescence नियंत्रण कोक्लीअ में (एक - सी)। बेसल अरहर की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन micrographsn भ्रूण (E18.5) में जंगली प्रकार cochleae। इनर बालों की कोशिकाओं (नीचे) और बाहरी बालों की कोशिकाओं (ऊपर) की तीन पंक्तियों की एक पंक्ति अलग कर दिया और समर्थन कोशिकाओं द्वारा intercalated रहे हैं। शेवरॉन के आकार का stereociliary बंडलों समान रूप से प्रत्येक बाल सेल (छवि के ऊपरी छोर) के पार्श्व किनारे की ओर उन्मुख। E18.5 पर अतिरिक्त microvilli बालों की कोशिकाओं के शिखर सतहों, stereociliary बंडलों के नीचे, और intercalated समर्थन कोशिकाओं (बी) को कवर किया। (सी) एक एकल microtubule आधारित kinocilium (सफेद तीर), बंडल के शिखर, पार्श्व किनारे से यहाँ दिखाया गया है पर स्थित है। (डी - जी) बेसल बारी पोस्ट प्रसव दिन 1 (P1) जंगली प्रकार cochleae की Immunofluorescent धुंधला। Phalloidin सेल परिधि (डी, ई, जी) पर stereocilia और cortical actin में filamentous actin लेबल। मायोसिन 7a भीतरी और बाहरी बालों की कोशिकाओं (ई) के लिए एक मार्कर है। Zo_1 के बीच कोशिकाओं तंग जंक्शनों लेबल, यह सेल bounda भेद करने के लिए एक महान बनाने मार्करशिक्षा संस्थानों (एफ)। Acetylated α ट्यूबिलिन बंडल (एफ, जी सफेद तीर) के शिखर पर kinocilium के लिए एक मार्कर के रूप में प्रयोग किया जाता है। आंतरिक सूक्ष्मनलिकाएं भी Acetylated α ट्यूबिलिन, जो स्तंभ कोशिकाओं में विशेष रूप से प्रचुर मात्रा में हैं (ग्राम सफेद Asterix) द्वारा चिह्नित कर रहे हैं। स्केल सलाखों एक: 10 माइक्रोन, बी: 5 माइक्रोन, C: 1 माइक्रोन, महानिदेशक:। 5 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
सिलिया म्यूटेंट में चित्रा 3. कर्णावत Phenotype। (ए) Ift20 cko / के रूप में चिह्नित छोटा नियंत्रण की तुलना में कर्णावत नलिकाओं cko। E18.5 पर विच्छेदित कर्णावत नलिकाओं acetylated ट्यूबिलिन के साथ दाग। (बी Bbs8 में बेसल कर्णावत बारी से पूरे माउंट छवियों - / - उत्परिवर्ती (P0)। Phalloidin लेबल filamentous actin, stereocilia (लाल), acetylated ट्यूबिलिन, kinocilia (हरा)। / - - में Bbs8 Stereociliary बंडलों cochleae अस्थायित्व, (सही तीर) घुमाया जाता है चपटा और / या mislocalized (मध्य तीर)। Kinocilia mislocalized रहे हैं या axonemes (बाएं तीर) लापता हैं। (सी - एफ) Bbs8 में stereociliary बंडलों और kinocilia के उच्च बढ़ाई SEM - / - OHCs। सी में, घुमाया बंडलों, डी में, बंडल चपटा, ई, एफ और बंडलों में परिपत्र में kinocilia mislocalized। (जी - मैं) बंडल विषमता मात्रा का ठहराव के योजनाबद्ध अभ्यावेदन। (G) बाएँ, उत्तलता (ऊंचाई) बंडल; बंडल के शिखर और लाइन है कि बंडल 'हथियार' के दोनों सिरों के माध्यम से फैली के बीच कम से कम दूरी। के रूप में डीठोस काला लाइन द्वारा epicted। ठीक है, बंडल के तहत क्षेत्र; क्षेत्र। (एच) stereociliary बंडलों के उन्मुखीकरण यों इस्तेमाल मानदंड के योजनाबद्ध अभ्यावेदन। बंडल के रोटेशन के कोण एक लाइन स्तंभ कोशिकाओं की पंक्ति को सीधा विस्तार देने के सापेक्ष गणना की जाती है। (मैं) kinocilia और stereociliary बंडलों की स्थितीय विश्लेषण के लिए मापदंड की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। एक खंडों ग्रिड बाल सेल की परिधि पर रखी है और स्थिति का उल्लेख किया। (जे) phalloidin लेबल stereocilia बंडलों (लाल) और P0 कोक्लीअ में बाहरी बालों की कोशिकाओं की acetylated ट्यूबिलिन लेबल kinocilia (हरा) के उच्च बढ़ाई छवि। आसन्न रंग पैनल में, लाल लाइनों kinocilia, जो Cep29 rd16 / rd16 म्यूटेंट में लंबे समय तक नियंत्रण (सफेद तीर) की तुलना में कर रहे हैं की पहचान। Tectorial झिल्ली की अधूरी हटाने के साथ भ्रूण कोक्लीअ के (कश्मीर) SEM माइक्रोग्राफ। स्केलसलाखों के एक: 100 माइक्रोन, बी: 5 माइक्रोन, सी - एफ: 2.5 माइक्रोन, मैं: 5 माइक्रोन, जम्मू: 50 माइक्रोन। (ए - एफ)।।। राहेल एट अल, 2012 27 से अनुमति के साथ मई-Simera एट अल 2015 8, जम्मू पुनर्मुद्रण से संशोधित यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

जब विश्लेषण के लिए कर्णावत ऊतक तैयारी, वहाँ कुछ महत्वपूर्ण बिंदुओं को ध्यान में रखना है। सबसे पहले, आनुवंशिक पृष्ठभूमि में मतभेद कर्णावत phenotype संशोधित कर सकते हैं, यह आवश्यक विश्लेषण और केवल littermate नियंत्रण तुलना करने के लिए कर रही है। दूसरे, tectorial झिल्ली का पूरी तरह हटाने immunohistochemistry के साथ सबसे अच्छा चित्र प्राप्त करने के लिए आवश्यक है और SEM के लिए आवश्यक है। tectorial झिल्ली एक अपारदर्शी संरचना है और यह नीचे सीधे संवेदी उपकला की कोशिकाओं को अस्पष्ट कर सकते हैं, इमेजिंग और अधिक चुनौतीपूर्ण बना रही है। कभी कभी प्रसंस्करण के दौरान, tectorial झिल्ली पीछे हटना सकता है, बालों की कोशिकाओं को उजागर। यहां तक ​​कि इन मामलों में दृढ़ता से हटाने की सलाह दी है। यह कदम धैर्य और अभ्यास की आवश्यकता है। तीसरा, सिलिअरी प्रोटीन, विशेष रूप से लोगों को अत्यधिक जमा बेसल शरीर के लिए स्थानीय बनाना, के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग immunohistochemistry चुनौतीपूर्ण हो सकता है और अनुकूलन की आवश्यकता कर सकते हैं। permeabil तेज, प्रतिजन पुनर्प्राप्ति प्रदर्शन पर विचारization कदम, या एकाग्रता या निर्धारण के समय कम। अंत में, kinocilium (प्राथमिक बरौनी कर्णावत बालों की कोशिकाओं पर पाया) इमेजिंग जब यह ध्यान रखें कि यह P0 से वापस लेना शुरू होता है - एक आधार करने वाली सर्वोच्च ढाल में बाद P1। इसलिए, जब kinocilium की लंबाई मापने यह कोक्लीअ के एक ही क्षेत्र से और उम्र से मिलान पशुओं में बालों की कोशिकाओं की तुलना करने के लिए महत्वपूर्ण है। intercalated समर्थन कोशिकाओं को भी प्राथमिक सिलिया, जो वापस लेना नहीं है। जॉब सेल सिलिया और बाल सेल kinocilia समर्थन के बीच भेद करने के लिए लिया जाना चाहिए।

चूहों परिपक्व के रूप में, यह तेजी से मुश्किल हो जाता है सफाई से लौकिक हड्डियों और बोनी लेबिरिंथ का कड़ा हो जाना के कारण, कर्णावत संवेदी epithelia को अलग-थलग करने के लिए। ऊतक के विकैल्सीकरण की आवश्यकता है, जो हमेशा आगे immunolocalization तकनीकों के साथ संगत नहीं है लेकिन सकल phenotype की परीक्षा के लिए अनुमति नहीं है और यह भी SEM तैयारी के साथ संगत है। जन्मजात माउस एसटीआरains अक्सर जाना जाता श्रवण जीन या आपरिवर्तक जीन में म्यूटेशन के कारण, इस तरह के बालों के झड़ने या सेल ऊंचा श्रवण brainstem प्रतिक्रियाओं (ABRs) के रूप में श्रवण दोष दिखा रहे हैं। इसलिए यह एक विकल्प के आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर उम्र मिलान littermate नियंत्रण तुलना या प्रजनन के लिए आवश्यक है।

इस विश्लेषण की सीमाओं में से एक यह है कि, चूहों में, kinocilium पद जन्म वापस लेना शुरू होता है और अब वयस्क बालों की कोशिकाओं पर मौजूद है। इस कारण से kinocilia माप केवल ऊतक विकसित करने में किया जा सकता है। इसके अलावा यह ध्यान उत्परिवर्ती और नियंत्रण नमूने के बीच तुलना के लिए उम्र से मिलान नियंत्रण का चयन करने के लिए आवश्यक है। एक और सीमा सिलिअरी उत्परिवर्ती चूहों इस प्रकार अब तक का विश्लेषण किया गंभीर श्रवण शिथिलता प्रदर्शित नहीं करते (अर्थात्।, श्रवण brainstem प्रतिक्रियाएं, ABRs या otoacoustic उत्सर्जन, OAEs) भी जब कर्णावत विकास बिगड़ा हुआ है। इस के साथ संगत, सुनवाई दोष एक आम इंसान ciliopathy phenotype नहीं हैं। असाधारण, hearin का नुकसानजी बेसल शरीर के प्रोटीन ALMS1 28,29 में परिवर्तन की वजह से Alström सिंड्रोम के प्राथमिक सुविधाओं में से एक है। यह पता चलता है कि stereociliary बंडल आकृति विज्ञान जरूरी श्रवण शिथिलता के सिलिया म्यूटेंट में, संभावना सुधारात्मक पुनरभिविन्यास की वजह से बंडलों के बाद के विकास में जुड़ा हुआ नहीं है के रूप में Vangl2 CKO म्यूटेंट 30 के लिए सूचित किया गया है। ciliopathy स्पेक्ट्रम अशर सिंड्रोम, बहरा-अंधापन का सबसे आम कारण जन्मजात शामिल करने के लिए चौड़ी हो जाता है, तो श्रवण रोग अत्यधिक प्रासंगिक हो जाता है। हाल के आंकड़ों से पता चला है कि कई Usher सिंड्रोम से संबंधित प्रोटीन भी बरौनी के लिए स्थानीय बनाना और सिलिअरी से संबंधित प्रक्रियाओं 31 में शामिल हैं, लेकिन इन प्रोटीनों पीसीपी सिगनल से संबंधित है कि क्या अभी तक जांच नहीं की गई है।

अब तक सबसे सिलिअरी माउस कर्णावत पीसीपी दोष के लिए विश्लेषण किया म्यूटेंट केवल थोड़ा जांच की गई है। तकनीक इस पांडुलिपि में वर्णित की एक व्यापक ब्यौरा के लिए अनुमतिकर्णावत phenotype, जो निस्संदेह कशेरुकी पीसीपी सिगनल स्थापित करने में सिलिअरी भागीदारी का एक और अधिक सटीक समझ को बढ़ावा मिलेगा। ciliopathy माउस उपलब्ध मॉडलों की बड़ी संख्या के बावजूद, आश्चर्यजनक रूप से कुछ कर्णावत पीसीपी दोषों के संदर्भ में विश्लेषण किया गया है। एक आम इन मॉडलों के साथ जुड़े ख़तरा भ्रूण मारक है। हालांकि, विकासशील कोक्लीअ के विकास के कान में पीसीपी में सिलिया की भूमिका embryonically जांच की जा सकती है क्योंकि अभी भी जांच की जानी जा सकती है। इसके अलावा, बहुत जल्दी भ्रूण मारक सशर्त नॉकआउट का उपयोग कर उन्हें धोखा दिया जा सकता है। Foxg1 Cre 32 चूहों, JacksonLaboratories से उपलब्ध है, आमतौर पर E8.To तारीख से भीतरी कान thedeveloping में ब्याज की inactivategenes करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, प्रयास मुख्य रूप से रोग के कारण ciliopathy जीनों की जांच पर ध्यान केंद्रित किया है , लेकिन अन्य सिलिया संबंधित प्रोटीन और कैसे के अन्वेषण इन विकास कोल इंडिया में अधिक से अधिक जानकारी उपलब्ध करा सकता है पीसीपी के दौरान सिगनल को प्रभावितआइए जीव विज्ञान और समारोह।

एक श्रवण phenotype माउस मॉडल में संदिग्ध है, तो विश्लेषण किया जा रहा है, संभव आगे के विश्लेषण ABRs 33 या 34 OAEs की audiometric परीक्षण शामिल हैं। कर्णावत explant विस्तार assays (मई-Simera एट अल। में वर्णित के रूप में, 2012 25), भी प्रदर्शन किया और पहले विकासात्मक समय बिंदुओं पर विस्तार अभिसरण दोषों की पहचान के लिए अनुमति जा सकता है। कोक्लीअ explants के संवर्धन भी जिससे विकास शामिल प्रक्रियाओं की यंत्रवत समझ के लिए योगदान विभिन्न संकेत activators या निरोधक, जो explant विस्तार संशोधित कर सकते हैं के साथ इलाज के लिए अनुमति देता है। हालांकि यह ज्ञात है कि kinocilium जन्म 11,13,14 के बाद पलटा, इस त्याग को अच्छी तरह से सिलिअरी म्यूटेंट के संदर्भ में संबोधित नहीं किया गया है। यह mutants.Considering सिलिया में kinocilia उद्भव और त्याग के समय विशेष माप लेने के लिए ब्याज की हो जाएगा कि सिलिअरी समर्थक के लिए एक प्राथमिक भूमिकाteins, सूक्ष्मनलिकाएं साथ माल की आवाजाही का है यह बहुत संभावना है कि इन प्रोटीनों भी cytoskeleton 35-37 साथ intracellular तस्करी के पहलुओं को नियंत्रित कर सकते है। सिलिया प्रोटीन की एक सबसेट की तस्करी और पीसीपी अणुओं 8 की विषम स्थानीयकरण प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है। पीसीपी अणुओं के immunohistochemistry द्वारा स्थानीयकरण, ऐसे Vangl2, Frz3 और dsh के रूप में विशेष रूप से झिल्ली जुड़े प्रोटीन, इसलिए यदि पीसीपी अणुओं mislocalized कर रहे हैं स्थापित करने के लिए सिफारिश की है। Polarity की स्थापना एक बहुमुखी चक्कर प्रतीत होता है, और एक अतिरिक्त सेल स्वायत्त मार्ग है, जो भी संवेदी बालों की कोशिकाओं 38 में सही पीसीपी के लिए आवश्यक है के लिए बढ़ते सबूत नहीं है। हाल ही में एक कागज दिखाया जी प्रोटीन निर्भर संकेतन एक सेल स्वायत्त तरीके से 39 में बरौनी के पलायन को नियंत्रित करता है। polarity अणुओं के स्थानीयकरण में सिलिअरी प्रोटीन के लिए एक भूमिका के अनुरूप, heterotrimeric जी प्रोटीन अल्फा-मैं सबयूनिट 3 (Gαi3) एलocalization कोक्लीअ 8,39 पीटकर Bbs8 और Bbs6 में बाधित है।

व्यक्तिगत सिलिअरी घटकों और पीसीपी सिगनल पर उनके अलग प्रभाव की भूमिका भेद हमें सही polarity स्थापित करने में बरौनी की भूमिका में अधिक से अधिक जानकारी दे देंगे। विशेष महत्व के एक सिलिअरी संदर्भ में कार्य कर सिलिअरी प्रोटीन, बनाम इस तरह के गैर रोमक intracellular की तस्करी से संबंधित विनियमित करने में उनकी भूमिका के रूप में परंपरागत रूप से माना सिलिअरी प्रोटीन की गैर रोमक काम करता है, के बीच भेद करने के लिए है। सेलुलर patterning और stereociliary बंडल उन्मुखीकरण सहित कर्णावत संरचना, के कई पहलुओं में नियमितता के उच्च डिग्री, यह संभव सिलिया संबंधित प्रोटीन में या तो आनुवंशिक या आणविक perturbations के जवाब में पीसीपी के विकास में सूक्ष्म परिवर्तन का पता लगाने के लिए बनाता है। यह देखते हुए वहाँ कई सिलिअरी माउस मॉडल हैं, और विकासशील माउस कोक्लीअ सबसे अच्छा स्थानों पीसीपी की जांच करने का एक यह है किसिगनल, यह किस हद तक अलग-अलग प्रोटीन म्यूटेशन कोक्लीअ विकास को बाधित करने के लिए सीखने के लिए महान ब्याज की है।

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Acknowledgments

लेखक मैथ्यू केली, Tiziana Cogliati, जेसिका Gumerson, उवे Wolfrum, रिवका Levron, वियोला Kretschmer और झो मान और धन्यवाद करने के लिए पांडुलिपि के अपने महत्वपूर्ण मूल्यांकन के लिए चाहते हैं। इस काम Sofja Kovalevskaya पुरस्कार (Humbodlt फाउंडेशन) और जोहान्स-गुटेनबर्ग विश्वविद्यालय, मेंज, जर्मनी द्वारा वित्त पोषित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tools/Equipment
Silicone elastomere - Sylgard 184 Sigma-Aldrich 761028-5EA See Note 2
Micro dissecting scissors-straight blade Various
Fine forceps (no. 5 and 55) and blunt forceps Various
Dissecting microscope. Various
Uncoated glass microscope slides Various
Microscope cover slips (22 mm × 40 mm × 0.15 mm) Various
Transfer pipettes Various
Minutien pins  Fine Science Tools 26002-10
SEM sample holder tousimis 8762
Scanning electron microscopy studs TED PELLA 16111
PELCO Tabs: Carbon adhesive TED PELLA 16084-3
Fluorescent Microscope Various
Critical Point Dryer Various
Scanning Electron Microscope Various
Glass microscope slides Various
Glass coverslips Various
Kimwipe Tissue  Various
Fine Paint Brush
Reagents
1× Phosphate buffered saline (PBS) Gibco/Life Technologies 10010023
Paraformaldehyde  (PFA) (EM Grade Required for EM) Various Prepare a 4% solution in 1× PBS made fresh each time. EM Grade Required for EM.
2.5% Glutaraldehyde Grade1 Sigma-Aldrich G5882
Tris-HCl (pH 7.5) Various
NaCl Various
CaCl 2 Various
Triton X-100 Various
Normal Goat Serum Various
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 715-007-003
Fluoromount-G Mounting media SouthernBiotech 0100-01
10× Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco/Life Technologies 14065
Hepes Gibco/Life Technologies 15630-080
Osmium tetroxide (OsO4 ) Sigma-Aldrich/Fluka Analytical 75632
Tannic acid Sigma-Aldrich 403040
Ethanol 200 proof Various
Antibodies
anti Arl13b Protein Tech 17711-1-AP Suggested concentration 1:1,000
anti acetylated tubulin (611-B1) Sigma-Aldrich T6793 Suggested concentration 1:800
anti gamma tubulin (GTU-88) Sigma-Aldrich T6557 Suggested concentration 1:200
anti Zo_1  Invitrogen 40-2300 Suggested concentration 1:500
Myosin VI Proteus Biosciences 25-6791 Suggested concentration 1:1000
Myosin VIIa Proteus Biosciences 25-6790 Suggested concentration 1:1,000
anti Vangl2 Merk Millipore ABN373 Suggested concentration 1:250
anti Gαi3 Sigma-Aldrich G4040 Suggested concentration 1:250
Alexa Fluor® 488 Phalloidin Invitrogen/Life Technologies A12379 Suggested concentration 1:300 - 1,000
Alexa Fluor® 568 Phalloidin Invitrogen/Life Technologies A12380 Suggested concentration 1:300 - 1,000

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References

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चिकित्सा अंक 108 प्राथमिक सिलिया Kinocilium Planar सेल polarity कोक्लीअ माउस बालों की कोशिकाओं Stereocilia WNT सिगनल
Ciliopathy माउस उत्परिवर्ती कोक्लीअ में Planar सेल Polarity phenotypes का मूल्यांकन
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May-Simera, H. Evaluation of… More

May-Simera, H. Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea. J. Vis. Exp. (108), e53559, doi:10.3791/53559 (2016).

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