Summary

Evaluación de planar-Cell-polaridad fenotipos en ciliopatía ratón mutante cóclea

Published: February 21, 2016
doi:

Summary

Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.

Abstract

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest signaling pathways shown to be associated with ciliary function was the non-canonical Wnt signaling pathway, also referred to as planar cell polarity (PCP) signaling. One of the best places in which to study the effects of planar cell polarity (PCP) signaling during vertebrate development is the mammalian cochlea. PCP signaling disruption in the mouse cochlea disrupts cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, all of which are affected by cilia dysfunction. The goal of this protocol is to describe the analysis of PCP signaling in the developing mammalian cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. Defects in convergence and extension are manifested as a shortening of the cochlear duct and/or changes in cellular patterning, which can be quantified following dissection from developing mouse mutants. Changes in stereociliary bundle orientation and kinocilia length or positioning can be observed and quantitated using either immunofluorescence or scanning electron microscopy (SEM). A deeper insight into the role of ciliary proteins in cellular signaling pathways and other biological phenomena is crucial for our understanding of cellular and developmental biology, as well as for the development of targeted treatment strategies.

Introduction

cilios primarios son apéndices largos basados ​​en microtúbulos que se extienden desde la superficie de la mayoría de células de mamífero. cilios primarios se confunde a menudo con cilios móviles, de los cuales siempre hay múltiples por célula, y cuya finalidad es mover fluido a través de superficies de la membrana. cilios primarios, por el contrario, adoptar funciones sensoriales y son por consiguiente también se hace referencia como cilios sensorial. Una vez en el olvido, este orgánulo ha sido recientemente 'redescubierto' como resultado de su asociación con una multitud de enfermedades genéticas humanas 1. Idealmente posicionado como un orgánulo de señalización, el cilio primaria se ha demostrado que regulan numerosas rutas de señalización, muchas de las cuales son importantes no sólo en la homeostasis del tejido y la enfermedad, sino también durante el desarrollo 2.

Una de las primeras vías de señalización demostrado estar asociadas con la disfunción cilios fue la vía de señalización Wnt no canónica, conocido también como vía de la polaridad celular plana (PCP) <sup > 3. Esta cascada de señalización inicialmente identificado en Drosophila, es fundamental para la embriogénesis; en particular para los procesos de convergencia y de extensión y para la orientación correcta de las células en el plano de los epitelios 4. La señalización secuencial de un conjunto básico de proteínas reguladoras traduce las señales direccionales que en última instancia conducen a reordenamientos del citoesqueleto y dan como resultado la polarización coordinada de las células epiteliales en un plano 5. El proceso de convergencia y la extensión es absolutamente necesario para el conducto coclear para alargar y para el correcto patrón celular 6. Como esto se regula a través de la activación de la vía de PCP, uno de los fenotipos más llamativos de mutantes PCP cóclea es un conducto coclear acortado con epitelios sensoriales desorganizado 7. Del mismo modo, los mutantes de ratón, que carecen de cilios, también presentan una convergencia y la extensión fenotipo tan 8,9, aunque precisamente cómo esto está regulado aún no se ha dilucidado.

ve_content "> Debido a que los procesos de convergencia y de extensión son críticos para la derivación del conducto coclear, y el patrón celular de los epitelios sensoriales dentro del conducto coclear, la cóclea en desarrollo es un órgano ideal en el que para examinar la señalización de PCP durante el desarrollo de los vertebrados. El órgano de Corti, el término dado al epitelio sensorial especializado que recubre el conducto coclear, está compuesto por células de soporte no sensoriales y las células ciliadas mechanosensory que deben ser orientados de manera uniforme para la cóclea para funcionar 10. las células ciliadas mechanosensory se llama así debido a la manojos estereociliar que se extienden desde la placa cuticular (superficie apical) de cada una de las células ciliadas sensoriales 11. Estos actúan como transductores primarios de mechanosensation ya pesar de su nomenclatura como estereocilios, en realidad están compuestas por microvellosidades a base de filamentos de actina modificado. Dentro de cada pelo en forma de V haz, tres filas de estereocilios se organizan en un pa altamente ordenada y regular,ttern caso de una manera similar a la escalera. Cilios real basado en los microtúbulos, cinetocilios llamados, son necesarios para el desarrollo y orientación de los haces estereociliar 12. Sobre cada célula de pelo, una sola cinocilio está unido físicamente al haz estereocilios, centralmente situada adyacente a la fila más alta de estereocilios. La función precisa de la cinocilio no está claro, y una hipótesis es que la cinocilio 'tira' los estereocilios en forma a medida que maduran desde microvellosidades 12. En los vertebrados, cinetocilios en la cóclea solamente están presentes de forma transitoria y se retraen de las células pilosas en los ratones antes de la aparición de la audición 11,13,14.

La pérdida completa de los cilios en los resultados en desarrollo cóclea en conductos cocleares acortar gravemente, mal formado y mal orientada haces estereociliar, así como los cuerpos basales mis-posicionado 8,9. Un cilio funcional no es sólo formaba parte del axonema ciliar. Muchas proteínas asociadas con los ciliosse producen en función de los complejos localizados en subdominios cilios afines, como la basal del cuerpo, zona de transición, o axonema ciliar 15. El cuerpo básica, derivada del centríolo madre del centrosoma, es también un centro organizador de microtúbulos por los microtúbulos se extienden lejos del cilio en el cuerpo celular y puede regular el tráfico intracelular, así como el tráfico ciliar. La zona de transición ciliar es otra región donde la función ciliar se regula en función de la organización de importación y exportación de compuestos ciliares 16.

Múltiples estudios han identificado una conexión entre los cilios y Wnt no canónica (de señalización PCP), aunque el mecanismo exacto no está claro 17. La redundancia de ciliares y PCP genes y la sensibilidad de la polaridad celular a anormalidades celulares generalizadas, hacen que sea difícil para enlazar directamente a una mutación específica déficit de PCF. Una de las salidas de lectura de la señalización de PCP es el posicionamiento del cuerpo basal y primarcilio y, por lo tanto, la segregación de la primaria de los defectos secundarios es un reto. Algunos estudios en el pez cebra y el ratón mutantes han sugerido ninguna conexión entre cilios y la señalización Wnt 18-20. Las discrepancias en los datos siempre son representativas de las especies, tejidos, o las diferencias temporales que dependen de las contribuciones ciliares hacia la señalización de Wnt. Además, la capacidad de respuesta normal de Wnt podría ser retenida si cuerpos basales siguen siendo funcionales. Una comprensión más profunda de la función de las proteínas ciliares en vías de señalización celular y otros fenómenos biológicos es crucial para nuestra comprensión de la biología celular y del desarrollo, así como para el desarrollo de estrategias de tratamiento dirigidas.

Protocol

Uso y la eutanasia a todos los animales de conformidad con las directrices y normas institucionales y gubernamentales, más comúnmente a través de inhalación de CO2 y dislocación cervical. 1. Preparación de los reactivos NOTA: Antes de comenzar, prepare todos los reactivos que utilizan productos químicos de grado analítico. Hacer que las soluciones de grado molecular utilizando agua destilada y desionizada a menos que se especifique lo contrario. Salina tamponada con fosfato …

Representative Results

La disección y la cóclea Preparación del tejido Después de la eliminación del cerebro, puesto línea media disección sagital de una cabeza P0 ratón, el laberinto óseo, visto desde atrás, puede ser visualizado (Figura 1A, flecha blanca) y se retira. La Figura 1B muestra los laberintos óseas aisladas con el cabello coclear mirando hacia arriba, ventral, (izquierda) y p…

Discussion

Cuando se prepara el tejido coclear para el análisis, hay algunos puntos clave a tener en cuenta. En primer lugar, las diferencias en el fondo genético puede modificar el fenotipo coclear, por lo que es necesario analizar y comparar sólo los controles de la misma camada. En segundo lugar, se requiere la eliminación completa de la membrana tectorial para obtener las mejores imágenes con inmunohistoquímica y es esencial para SEM. La membrana tectorial es una estructura opaca y puede oscurecer las células del epitel…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El autor desea agradecer a Mateo Kelley, Tiziana Cogliati, Jessica Gumerson, Uwe Wolfrum, Rivka Levron, Viola Kretschmer y Zoe Mann y para su evaluación crítica del manuscrito. Este trabajo fue financiado por el Premio Sofja Kovalevskaya (Fundación Humbodlt) y la Universidad Johannes Gutenberg, Mainz, Alemania.

Materials

Tools/Equipment
Silicone elastomere – Sylgard 184 Sigma-Aldrich 761028-5EA See Note 2
Micro dissecting scissors-straight blade Various
Fine forceps (no. 5 and 55) and blunt forceps Various
Dissecting microscope. Various
Uncoated glass microscope slides Various
Microscope cover slips (22 mm × 40 mm × 0.15 mm) Various
Transfer pipettes Various
Minutien pins  Fine Science Tools 26002-10
SEM sample holder tousimis 8762
Scanning electron microscopy studs TED PELLA 16111
PELCO Tabs: Carbon adhesive TED PELLA 16084-3
Fluorescent Microscope Various
Critical Point Dryer Various
Scanning Electron Microscope Various
Glass microscope slides Various
Glass coverslips Various
Kimwipe Tissue  Various
Fine Paint Brush
Reagents
1× Phosphate buffered saline (PBS) Gibco/Life Technologies 10010023
Paraformaldehyde  (PFA) (EM Grade Required for EM) Various Prepare a 4% solution in 1× PBS made fresh each time. EM Grade Required for EM.
2.5% Glutaraldehyde Grade1 Sigma-Aldrich G5882
Tris-HCl (pH 7.5) Various
NaCl Various
CaCl 2 Various
Triton X-100 Various
Normal Goat Serum Various
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 715-007-003
Fluoromount-G Mounting media SouthernBiotech 0100-01
10× Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco/Life Technologies 14065
Hepes Gibco/Life Technologies 15630-080
Osmium tetroxide (OsO4 ) Sigma-Aldrich/Fluka Analytical 75632
Tannic acid Sigma-Aldrich 403040
Ethanol 200 proof Various
Antibodies
anti Arl13b Protein Tech 17711-1-AP Suggested concentration 1:1000
anti acetylated tubulin (611-B1) Sigma-Aldrich T6793 Suggested concentration 1:800
anti gamma tubulin (GTU-88) Sigma-Aldrich T6557 Suggested concentration 1:200
anti Zo_1  Invitrogen 40-2300 Suggested concentration 1:500
Myosin VI Proteus Biosciences 25-6791 Suggested concentration 1:1000
Myosin VIIa Proteus Biosciences 25-6790 Suggested concentration 1:1000
anti Vangl2 Merk Millipore ABN373 Suggested concentration 1:250
anti Gαi3 Sigma-Aldrich G4040 Suggested concentration 1:250
Alexa Fluor® 488 Phalloidin Invitrogen/Life Technologies A12379 Suggested concentration 1:300-1000
Alexa Fluor® 568 Phalloidin Invitrogen/Life Technologies A12380 Suggested concentration 1:300-1000

References

  1. Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatr Nephrol. 26, 1039-1056 (2011).
  2. May-Simera, H. L., Kelley, M. W. Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton. Cilia. 1, 7 (2012).
  3. Ross, A. J., et al. Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates. Nat Genet. 37, 1135-1140 (2005).
  4. Ezan, J., Montcouquiol, M. Revisiting planar cell polarity in the inner ear. Seminars in cell & developmental biology. 24, 499-506 (2013).
  5. Semenov, M. V., Habas, R., Macdonald, B. T., He, X. SnapShot: Noncanonical Wnt Signaling Pathways. Cell. 131, 1378 (2007).
  6. Wang, J., et al. Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway. Nat Genet. 37, 980-985 (2005).
  7. Montcouquiol, M., et al. Identification of Vangl2 and Scrb1 as planar polarity genes in mammals. Nature. 423, 173-177 (2003).
  8. May-Simera, H. L., et al. Ciliary proteins Bbs8 and Ift20 promote planar cell polarity in the cochlea. Development. 142, 555-566 (2015).
  9. Jones, C., et al. Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation. Nat Genet. 40, 69-77 (2008).
  10. Lim, D. J. Functional structure of the organ of Corti: a review. Hearing research. 22, 117-146 (1986).
  11. Nayak, G. D., Ratnayaka, H. S., Goodyear, R. J., Richardson, G. P. Development of the hair bundle and mechanotransduction. The International journal of developmental biology. 51, 597-608 (2007).
  12. Denman-Johnson, K., Forge, A. Establishment of hair bundle polarity and orientation in the deveoping vestibular system of the mouse. J. Neurocytol. , 821-835 (1999).
  13. Sobkowicz, H. M., Slapnick, S. M., August, B. K. The kinocilium of auditory hair cells and evidence for its morphogenetic role during the regeneration of stereocilia and cuticular plates. Journal of neurocytology. 24, 633-653 (1995).
  14. Denman-Johnson, K., Forge, A. Establishment of hair bundle polarity and orientation in the developing vestibular system of the mouse. Journal of neurocytology. 28, 821-835 (1999).
  15. van Dam, T. J., et al. The SYSCILIA gold standard (SCGSv1) of known ciliary components and its applications within a systems biology consortium. Cilia. 2, 7 (2013).
  16. Blacque, O. E., Sanders, A. A. Compartments within a compartment: what C. elegans can tell us about ciliary subdomain composition, biogenesis, function, and disease. Organogenesis. 10, 126-137 (2014).
  17. Wallingford, J. B., Mitchell, B. Strange as it may seem: the many links between Wnt signaling, planar cell polarity, and cilia. Genes & development. 25, 201-213 (2011).
  18. Borovina, A., Ciruna, B. IFT88 plays a cilia- and PCP-independent role in controlling oriented cell divisions during vertebrate embryonic development. Cell reports. 5, 37-43 (2013).
  19. Huang, P., Schier, A. F. Dampened Hedgehog signaling but normal Wnt signaling in zebrafish without cilia. Development. 136, 3089-3098 (2009).
  20. Ocbina, P. J., Tuson, M., Anderson, K. V. Primary cilia are not required for normal canonical Wnt signaling in the mouse embryo. PloS one. 4, e6839 (2009).
  21. Jones, C. G. Scanning electron microscopy: preparation and imaging for SEM. Methods Mol Biol. 915, 1-20 (2012).
  22. Curtin, J. A., et al. Mutation of Celsr1 disrupts planar polarity of inner ear hair cells and causes severe neural tube defects in the mouse. Current biology : CB. 13, 1129-1133 (2003).
  23. Wang, Y., Guo, N., Nathans, J. The role of Frizzled3 and Frizzled6 in neural tube closure and in the planar polarity of inner-ear sensory hair cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 2147-2156 (2006).
  24. Montcouquiol, M., Jones, J. M., Sans, N. Detection of planar polarity proteins in mammalian cochlea. Methods Mol Biol. 468, 207-219 (2008).
  25. May-Simera, H., Kelley, M. W. Examining planar cell polarity in the mammalian cochlea. Methods Mol Biol. 839, 157-171 (2012).
  26. Yin, H., Copley, C. O., Goodrich, L. V., Deans, M. R. Comparison of phenotypes between different vangl2 mutants demonstrates dominant effects of the Looptail mutation during hair cell development. PloS one. 7, e31988 (2012).
  27. Rachel, R. A., et al. Combining Cep290 and Mkks ciliopathy alleles in mice rescues sensory defects and restores ciliogenesis. J Clin Invest. 122, 1233-1245 (2012).
  28. Jagger, D., et al. Alstrom Syndrome protein ALMS1 localizes to basal bodies of cochlear hair cells and regulates cilium-dependent planar cell polarity. Human molecular genetics. 20, 466-481 (2011).
  29. Collin, G. B., et al. The Alstrom Syndrome Protein, ALMS1, Interacts with alpha-Actinin and Components of the Endosome Recycling Pathway. PloS one. 7, e37925 (2012).
  30. Copley, C. O., Duncan, J. S., Liu, C., Cheng, H., Deans, M. R. Postnatal refinement of auditory hair cell planar polarity deficits occurs in the absence of Vangl2. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 14001-14016 (2013).
  31. Sorusch, N., Wunderlich, K., Bauss, K., Nagel-Wolfrum, K., Wolfrum, U. Usher syndrome protein network functions in the retina and their relation to other retinal ciliopathies. Advances in experimental medicine and biology. 801, 527-533 (2014).
  32. Hebert, J. M., McConnell, S. K. Targeting of cre to the Foxg1 (BF-1) locus mediates loxP recombination in the telencephalon and other developing head structures. Dev Biol. 222, 296-306 (2000).
  33. Willott, J. F. Chapter 8, Measurement of the auditory brainstem response (ABR) to study auditory sensitivity in mice. Current protocols in neuroscience. , Unit8 21B (2006).
  34. Martin, G. K., Stagner, B. B., Lonsbury-Martin, B. L., et al. Chapter 8, Assessment of cochlear function in mice: distortion-product otoacoustic emissions. Current protocols in neuroscience. , Unit8 21C (2006).
  35. Finetti, F., et al. Intraflagellar transport is required for polarized recycling of the TCR/CD3 complex to the immune synapse. Nature cell biology. 11, 1332-1339 (2009).
  36. Sedmak, T., Wolfrum, U. Intraflagellar transport molecules in ciliary and nonciliary cells of the retina. J Cell Biol. 189, 171-186 (2010).
  37. Yuan, S., Sun, Z. Expanding horizons: ciliary proteins reach beyond cilia. Annual review of genetics. 47, 353-376 (2013).
  38. Tarchini, B., Jolicoeur, C., Cayouette, M. A molecular blueprint at the apical surface establishes planar asymmetry in cochlear hair cells. Developmental cell. 27, 88-102 (2013).
  39. Ezan, J., et al. Primary cilium migration depends on G-protein signalling control of subapical cytoskeleton. Nature cell biology. 15, 1107-1115 (2013).

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Cite This Article
May-Simera, H. Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea. J. Vis. Exp. (108), e53559, doi:10.3791/53559 (2016).

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