Evaluación de planar-Cell-polaridad fenotipos en ciliopatía ratón mutante cóclea
Summary
Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.
Abstract
In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest signaling pathways shown to be associated with ciliary function was the non-canonical Wnt signaling pathway, also referred to as planar cell polarity (PCP) signaling. One of the best places in which to study the effects of planar cell polarity (PCP) signaling during vertebrate development is the mammalian cochlea. PCP signaling disruption in the mouse cochlea disrupts cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, all of which are affected by cilia dysfunction. The goal of this protocol is to describe the analysis of PCP signaling in the developing mammalian cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. Defects in convergence and extension are manifested as a shortening of the cochlear duct and/or changes in cellular patterning, which can be quantified following dissection from developing mouse mutants. Changes in stereociliary bundle orientation and kinocilia length or positioning can be observed and quantitated using either immunofluorescence or scanning electron microscopy (SEM). A deeper insight into the role of ciliary proteins in cellular signaling pathways and other biological phenomena is crucial for our understanding of cellular and developmental biology, as well as for the development of targeted treatment strategies.
Introduction
cilios primarios son apéndices largos basados en microtúbulos que se extienden desde la superficie de la mayoría de células de mamífero. cilios primarios se confunde a menudo con cilios móviles, de los cuales siempre hay múltiples por célula, y cuya finalidad es mover fluido a través de superficies de la membrana. cilios primarios, por el contrario, adoptar funciones sensoriales y son por consiguiente también se hace referencia como cilios sensorial. Una vez en el olvido, este orgánulo ha sido recientemente 'redescubierto' como resultado de su asociación con una multitud de enfermedades genéticas humanas 1. Idealmente posicionado como un orgánulo de señalización, el cilio primaria se ha demostrado que regulan numerosas rutas de señalización, muchas de las cuales son importantes no sólo en la homeostasis del tejido y la enfermedad, sino también durante el desarrollo 2.
Una de las primeras vías de señalización demostrado estar asociadas con la disfunción cilios fue la vía de señalización Wnt no canónica, conocido también como vía de la polaridad celular plana (PCP) <sup > 3. Esta cascada de señalización inicialmente identificado en Drosophila, es fundamental para la embriogénesis; en particular para los procesos de convergencia y de extensión y para la orientación correcta de las células en el plano de los epitelios 4. La señalización secuencial de un conjunto básico de proteínas reguladoras traduce las señales direccionales que en última instancia conducen a reordenamientos del citoesqueleto y dan como resultado la polarización coordinada de las células epiteliales en un plano 5. El proceso de convergencia y la extensión es absolutamente necesario para el conducto coclear para alargar y para el correcto patrón celular 6. Como esto se regula a través de la activación de la vía de PCP, uno de los fenotipos más llamativos de mutantes PCP cóclea es un conducto coclear acortado con epitelios sensoriales desorganizado 7. Del mismo modo, los mutantes de ratón, que carecen de cilios, también presentan una convergencia y la extensión fenotipo tan 8,9, aunque precisamente cómo esto está regulado aún no se ha dilucidado.
ve_content "> Debido a que los procesos de convergencia y de extensión son críticos para la derivación del conducto coclear, y el patrón celular de los epitelios sensoriales dentro del conducto coclear, la cóclea en desarrollo es un órgano ideal en el que para examinar la señalización de PCP durante el desarrollo de los vertebrados. El órgano de Corti, el término dado al epitelio sensorial especializado que recubre el conducto coclear, está compuesto por células de soporte no sensoriales y las células ciliadas mechanosensory que deben ser orientados de manera uniforme para la cóclea para funcionar 10. las células ciliadas mechanosensory se llama así debido a la manojos estereociliar que se extienden desde la placa cuticular (superficie apical) de cada una de las células ciliadas sensoriales 11. Estos actúan como transductores primarios de mechanosensation ya pesar de su nomenclatura como estereocilios, en realidad están compuestas por microvellosidades a base de filamentos de actina modificado. Dentro de cada pelo en forma de V haz, tres filas de estereocilios se organizan en un pa altamente ordenada y regular,ttern caso de una manera similar a la escalera. Cilios real basado en los microtúbulos, cinetocilios llamados, son necesarios para el desarrollo y orientación de los haces estereociliar 12. Sobre cada célula de pelo, una sola cinocilio está unido físicamente al haz estereocilios, centralmente situada adyacente a la fila más alta de estereocilios. La función precisa de la cinocilio no está claro, y una hipótesis es que la cinocilio 'tira' los estereocilios en forma a medida que maduran desde microvellosidades 12. En los vertebrados, cinetocilios en la cóclea solamente están presentes de forma transitoria y se retraen de las células pilosas en los ratones antes de la aparición de la audición 11,13,14.La pérdida completa de los cilios en los resultados en desarrollo cóclea en conductos cocleares acortar gravemente, mal formado y mal orientada haces estereociliar, así como los cuerpos basales mis-posicionado 8,9. Un cilio funcional no es sólo formaba parte del axonema ciliar. Muchas proteínas asociadas con los ciliosse producen en función de los complejos localizados en subdominios cilios afines, como la basal del cuerpo, zona de transición, o axonema ciliar 15. El cuerpo básica, derivada del centríolo madre del centrosoma, es también un centro organizador de microtúbulos por los microtúbulos se extienden lejos del cilio en el cuerpo celular y puede regular el tráfico intracelular, así como el tráfico ciliar. La zona de transición ciliar es otra región donde la función ciliar se regula en función de la organización de importación y exportación de compuestos ciliares 16.
Múltiples estudios han identificado una conexión entre los cilios y Wnt no canónica (de señalización PCP), aunque el mecanismo exacto no está claro 17. La redundancia de ciliares y PCP genes y la sensibilidad de la polaridad celular a anormalidades celulares generalizadas, hacen que sea difícil para enlazar directamente a una mutación específica déficit de PCF. Una de las salidas de lectura de la señalización de PCP es el posicionamiento del cuerpo basal y primarcilio y, por lo tanto, la segregación de la primaria de los defectos secundarios es un reto. Algunos estudios en el pez cebra y el ratón mutantes han sugerido ninguna conexión entre cilios y la señalización Wnt 18-20. Las discrepancias en los datos siempre son representativas de las especies, tejidos, o las diferencias temporales que dependen de las contribuciones ciliares hacia la señalización de Wnt. Además, la capacidad de respuesta normal de Wnt podría ser retenida si cuerpos basales siguen siendo funcionales. Una comprensión más profunda de la función de las proteínas ciliares en vías de señalización celular y otros fenómenos biológicos es crucial para nuestra comprensión de la biología celular y del desarrollo, así como para el desarrollo de estrategias de tratamiento dirigidas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cuando se prepara el tejido coclear para el análisis, hay algunos puntos clave a tener en cuenta. En primer lugar, las diferencias en el fondo genético puede modificar el fenotipo coclear, por lo que es necesario analizar y comparar sólo los controles de la misma camada. En segundo lugar, se requiere la eliminación completa de la membrana tectorial para obtener las mejores imágenes con inmunohistoquímica y es esencial para SEM. La membrana tectorial es una estructura opaca y puede oscurecer las células del epitel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El autor desea agradecer a Mateo Kelley, Tiziana Cogliati, Jessica Gumerson, Uwe Wolfrum, Rivka Levron, Viola Kretschmer y Zoe Mann y para su evaluación crítica del manuscrito. Este trabajo fue financiado por el Premio Sofja Kovalevskaya (Fundación Humbodlt) y la Universidad Johannes Gutenberg, Mainz, Alemania.
Materials
| Tools/Equipment | |||
| Silicone elastomere – Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | See Note 2 |
| Micro dissecting scissors-straight blade | Various | ||
| Fine forceps (no. 5 and 55) and blunt forceps | Various | ||
| Dissecting microscope. | Various | ||
| Uncoated glass microscope slides | Various | ||
| Microscope cover slips (22 mm × 40 mm × 0.15 mm) | Various | ||
| Transfer pipettes | Various | ||
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SEM sample holder | tousimis | 8762 | |
| Scanning electron microscopy studs | TED PELLA | 16111 | |
| PELCO Tabs: Carbon adhesive | TED PELLA | 16084-3 | |
| Fluorescent Microscope | Various | ||
| Critical Point Dryer | Various | ||
| Scanning Electron Microscope | Various | ||
| Glass microscope slides | Various | ||
| Glass coverslips | Various | ||
| Kimwipe Tissue | Various | ||
| Fine Paint Brush | |||
| Reagents | |||
| 1× Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco/Life Technologies | 10010023 | |
| Paraformaldehyde (PFA) (EM Grade Required for EM) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS made fresh each time. EM Grade Required for EM. | |
| 2.5% Glutaraldehyde Grade1 | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Tris-HCl (pH 7.5) | Various | ||
| NaCl | Various | ||
| CaCl 2 | Various | ||
| Triton X-100 | Various | ||
| Normal Goat Serum | Various | ||
| AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-007-003 | |
| Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| 10× Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco/Life Technologies | 14065 | |
| Hepes | Gibco/Life Technologies | 15630-080 | |
| Osmium tetroxide (OsO4 ) | Sigma-Aldrich/Fluka Analytical | 75632 | |
| Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
| Ethanol 200 proof | Various | ||
| Antibodies | |||
| anti Arl13b | Protein Tech | 17711-1-AP | Suggested concentration 1:1000 |
| anti acetylated tubulin (611-B1) | Sigma-Aldrich | T6793 | Suggested concentration 1:800 |
| anti gamma tubulin (GTU-88) | Sigma-Aldrich | T6557 | Suggested concentration 1:200 |
| anti Zo_1 | Invitrogen | 40-2300 | Suggested concentration 1:500 |
| Myosin VI | Proteus Biosciences | 25-6791 | Suggested concentration 1:1000 |
| Myosin VIIa | Proteus Biosciences | 25-6790 | Suggested concentration 1:1000 |
| anti Vangl2 | Merk Millipore | ABN373 | Suggested concentration 1:250 |
| anti Gαi3 | Sigma-Aldrich | G4040 | Suggested concentration 1:250 |
| Alexa Fluor® 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:300-1000 |
| Alexa Fluor® 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:300-1000 |
References
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