Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.
In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest signaling pathways shown to be associated with ciliary function was the non-canonical Wnt signaling pathway, also referred to as planar cell polarity (PCP) signaling. One of the best places in which to study the effects of planar cell polarity (PCP) signaling during vertebrate development is the mammalian cochlea. PCP signaling disruption in the mouse cochlea disrupts cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, all of which are affected by cilia dysfunction. The goal of this protocol is to describe the analysis of PCP signaling in the developing mammalian cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. Defects in convergence and extension are manifested as a shortening of the cochlear duct and/or changes in cellular patterning, which can be quantified following dissection from developing mouse mutants. Changes in stereociliary bundle orientation and kinocilia length or positioning can be observed and quantitated using either immunofluorescence or scanning electron microscopy (SEM). A deeper insight into the role of ciliary proteins in cellular signaling pathways and other biological phenomena is crucial for our understanding of cellular and developmental biology, as well as for the development of targeted treatment strategies.
प्राथमिक सिलिया लंबे microtubule आधारित उपांग है कि सबसे अधिक स्तनधारी कोशिकाओं की सतह से विस्तार कर रहे हैं। प्राथमिक सिलिया अक्सर गतिशील सिलिया के साथ भ्रमित कर रहे हैं, जो वहाँ हमेशा सेल प्रति एकाधिक रहे हैं, और जिसका उद्देश्य झिल्ली सतहों के पार तरल पदार्थ ले जाने के लिए है। प्राथमिक सिलिया, इसके विपरीत, संवेदी भूमिकाओं को अपनाने और इसके परिणामस्वरूप के रूप में भी संवेदी सिलिया के लिए भेजा जाता है। एक बार लंबी भूल, इस organelle हाल ही में मानव आनुवंशिक रोगों 1 के एक भीड़ के साथ अपने सहयोग का एक परिणाम के रूप में 'फिर से खोज' कर दिया गया है। आदर्श रूप में एक संकेत के रूप में तैनात organelle, प्राथमिक बरौनी कई संकेत दे रास्ते, जिनमें से कई ऊतक homeostasis और रोग में न केवल महत्वपूर्ण हैं, लेकिन यह भी विकास के दौरान 2 विनियमित करने के लिए दिखाया गया है।
सिलिया रोग के साथ जुड़े होने के लिए दिखाया पहला संकेत दे रास्ते में से एक गैर विहित Wnt संकेतन मार्ग भी तलीय सेल polarity (पीसीपी) मार्ग के रूप में जाना जाता था <sup > 3। यह संकेत झरना शुरू में ड्रोसोफिला में पहचान, embryogenesis के लिए महत्वपूर्ण है; अभिसरण और विस्तार की प्रक्रिया के लिए विशेष रूप से और epithelia 4 के विमान में कोशिकाओं के सही ओरिएंटेशन के लिए। एक कोर नियामक प्रोटीन का सेट के अनुक्रमिक सिगनल दिशात्मक संकेतों जो अंततः cytoskeletal rearrangements के लिए नेतृत्व और एक विमान में 5 उपकला कोशिकाओं के समन्वित ध्रुवीकरण में परिणाम अनुवाद। अभिसरण और विस्तार की प्रक्रिया बिल्कुल कर्णावत वाहिनी बढ़ाना करने के लिए और सही सेलुलर patterning 6 के लिए आवश्यक है। इस पीसीपी मार्ग के सक्रियण के माध्यम से नियंत्रित किया जाता है, कोक्लीअ पीसीपी म्यूटेंट की सबसे मुख्य phenotypes में से एक बेतरतीब संवेदी epithelia 7 के साथ एक छोटा कर्णावत वाहिनी है। इसी तरह, माउस म्यूटेंट, जो सिलिया की कमी है, इसके अलावा, इस तरह के एक अभिसरण और विस्तार phenotype 8,9 दिखा रहे इस विनियमित किया जाता है ठीक कैसे elucidated जाना बना रहता है यद्यपि।
ve_content "> क्योंकि अभिसरण और विस्तार प्रक्रियाओं कर्णावत वाहिनी के परिणाम, और कर्णावत वाहिनी के भीतर संवेदी epithelia के सेलुलर patterning के लिए महत्वपूर्ण हैं, विकासशील कोक्लीअ जिसमें कशेरुकी विकास के दौरान पीसीपी सिगनल की जांच के लिए एक आदर्श अंग है। के अंग कोर्टी, अवधि विशेष संवेदी उपकला है कि लाइनों कर्णावत वाहिनी, गैर संवेदी समर्थन कोशिकाओं और mechanosensory बालों की कोशिकाओं जो समान रूप कोक्लीअ के लिए उन्मुख होना चाहिए 10 कार्य करने के लिए शामिल है के लिए दिया गया। mechanosensory बालों की कोशिकाओं इसलिए वजह से कहा जाता है प्रत्येक संवेदी बाल सेल 11 का (शिखर सतह)। mechanosensation की और stereocilia के रूप में उनके नामकरण के बावजूद प्राथमिक ट्रांसड्यूसर रूप में ये कार्य stereociliary बंडलों कि चर्म संबंधी थाली से विस्तार, वास्तव में संशोधित actin रेशा आधारित microvilli के शामिल हैं। प्रत्येक शेवरॉन के आकार बाल के भीतर बंडल, stereocilia की तीन पंक्तियों में एक उच्च आदेश दिया और नियमित रूप से देहात में आयोजित कर रहे हैंएक सीढ़ी मामले की तरह ढंग से ttern। रीयल microtubule आधारित सिलिया, करार दिया kinocilia, विकास और stereociliary बंडलों 12 के उन्मुखीकरण के लिए आवश्यक हैं। प्रत्येक बाल सेल पर, एक ही kinocilium शारीरिक रूप से stereocilia बंडल से जुड़ी है, केन्द्र stereocilia की सबसे ऊंची पंक्ति के निकट स्थित है। Kinocilium की सटीक समारोह स्पष्ट नहीं है, और एक परिकल्पना है कि kinocilium आकार में stereocilia 'खींचतान' के रूप में वे microvilli 12 से परिपक्व है। रीढ़ में, कोक्लीअ में kinocilia केवल वर्तमान क्षणिक हैं और सुनवाई 11,13,14 की शुरुआत करने से पहले चूहों में बालों की कोशिकाओं से वापस लेना।गंभीर रूप से छोटा कर्णावत नलिकाओं में विकासशील कोक्लीअ परिणामों में सिलिया का पूरा नुकसान, गलत का गठन किया और stereociliary बंडलों, साथ ही गलत तैनात बेसल शव 8,9 एमआईएस उन्मुख। एक कार्यात्मक बरौनी सिर्फ सिलिअरी axoneme के शामिल नहीं है। सिलिया के साथ जुड़े कई प्रोटीनसमारोह में इस तरह बेसल शरीर, संक्रमण क्षेत्र, या सिलिअरी axoneme 15 के रूप में सिलिया से संबंधित उप डोमेन के लिए स्थानीय परिसरों में होते हैं। बेसल शरीर, केंद्रपिंड की मां तारककेंद्रक से प्राप्त होता है, यह भी सेल शरीर में बरौनी से दूर का विस्तार सूक्ष्मनलिकाएं के लिए एक microtubule आयोजन केंद्र है और intracellular तस्करी के रूप में अच्छी तरह से सिलिअरी की तस्करी को विनियमित कर सकते हैं। सिलिअरी संक्रमण क्षेत्र एक और क्षेत्र है जहां सिलिअरी समारोह आयात और सिलिअरी यौगिकों 16 के निर्यात के आयोजन के संदर्भ में नियंत्रित किया जाता है।
कई अध्ययनों, सिलिया और गैर विहित Wnt (पीसीपी संकेतन) के बीच एक संबंध की पहचान की है, हालांकि सटीक व्यवस्था स्पष्ट नहीं 17 है। सिलिअरी और पीसीपी जीनों के अतिरेक और सामान्यीकृत सेलुलर असामान्यताओं को सेल polarity की संवेदनशीलता, यह मुश्किल सीधे पीसीपी-विशिष्ट घाटे को एक उत्परिवर्तन से जोड़ने के लिए बनाते हैं। पीसीपी सिगनल के पढ़ने के बहिष्कार से एक बेसल शरीर और primar की स्थिति हैY बरौनी, इसलिए माध्यमिक दोषों से प्राथमिक छाँट कर अलग चुनौतीपूर्ण है। Zebrafish और माउस म्यूटेंट में कुछ अध्ययनों से संकेत 18-20 सिलिया और Wnt के बीच कोई संबंध का सुझाव दिया है। आंकड़ों में विसंगतियां प्रजातियों, ऊतक, या WNT सिगनल की दिशा में योगदान सिलिअरी में अस्थायी निर्भर मतभेद प्रतिबिंबित कर सकते हैं। इसके अलावा, सामान्य Wnt जवाबदेही बनाए रखा जा सकता है, तो बेसल शव कार्यात्मक रहते हैं। सेलुलर संकेत दे रास्ते और अन्य जैविक घटना में सिलिअरी प्रोटीन की भूमिका में एक गहरी अंतर्दृष्टि सेलुलर और विकासात्मक जीव विज्ञान की हमारी समझ है, साथ ही लक्षित उपचार रणनीतियों के विकास के लिए महत्वपूर्ण है।
जब विश्लेषण के लिए कर्णावत ऊतक तैयारी, वहाँ कुछ महत्वपूर्ण बिंदुओं को ध्यान में रखना है। सबसे पहले, आनुवंशिक पृष्ठभूमि में मतभेद कर्णावत phenotype संशोधित कर सकते हैं, यह आवश्यक विश्लेषण और केवल littermate नियंत्?…
The authors have nothing to disclose.
लेखक मैथ्यू केली, Tiziana Cogliati, जेसिका Gumerson, उवे Wolfrum, रिवका Levron, वियोला Kretschmer और झो मान और धन्यवाद करने के लिए पांडुलिपि के अपने महत्वपूर्ण मूल्यांकन के लिए चाहते हैं। इस काम Sofja Kovalevskaya पुरस्कार (Humbodlt फाउंडेशन) और जोहान्स-गुटेनबर्ग विश्वविद्यालय, मेंज, जर्मनी द्वारा वित्त पोषित किया गया।
Tools/Equipment | |||
Silicone elastomere – Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | See Note 2 |
Micro dissecting scissors-straight blade | Various | ||
Fine forceps (no. 5 and 55) and blunt forceps | Various | ||
Dissecting microscope. | Various | ||
Uncoated glass microscope slides | Various | ||
Microscope cover slips (22 mm × 40 mm × 0.15 mm) | Various | ||
Transfer pipettes | Various | ||
Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
SEM sample holder | tousimis | 8762 | |
Scanning electron microscopy studs | TED PELLA | 16111 | |
PELCO Tabs: Carbon adhesive | TED PELLA | 16084-3 | |
Fluorescent Microscope | Various | ||
Critical Point Dryer | Various | ||
Scanning Electron Microscope | Various | ||
Glass microscope slides | Various | ||
Glass coverslips | Various | ||
Kimwipe Tissue | Various | ||
Fine Paint Brush | |||
Reagents | |||
1× Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco/Life Technologies | 10010023 | |
Paraformaldehyde (PFA) (EM Grade Required for EM) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS made fresh each time. EM Grade Required for EM. | |
2.5% Glutaraldehyde Grade1 | Sigma-Aldrich | G5882 | |
Tris-HCl (pH 7.5) | Various | ||
NaCl | Various | ||
CaCl 2 | Various | ||
Triton X-100 | Various | ||
Normal Goat Serum | Various | ||
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-007-003 | |
Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
10× Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco/Life Technologies | 14065 | |
Hepes | Gibco/Life Technologies | 15630-080 | |
Osmium tetroxide (OsO4 ) | Sigma-Aldrich/Fluka Analytical | 75632 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
Ethanol 200 proof | Various | ||
Antibodies | |||
anti Arl13b | Protein Tech | 17711-1-AP | Suggested concentration 1:1000 |
anti acetylated tubulin (611-B1) | Sigma-Aldrich | T6793 | Suggested concentration 1:800 |
anti gamma tubulin (GTU-88) | Sigma-Aldrich | T6557 | Suggested concentration 1:200 |
anti Zo_1 | Invitrogen | 40-2300 | Suggested concentration 1:500 |
Myosin VI | Proteus Biosciences | 25-6791 | Suggested concentration 1:1000 |
Myosin VIIa | Proteus Biosciences | 25-6790 | Suggested concentration 1:1000 |
anti Vangl2 | Merk Millipore | ABN373 | Suggested concentration 1:250 |
anti Gαi3 | Sigma-Aldrich | G4040 | Suggested concentration 1:250 |
Alexa Fluor® 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:300-1000 |
Alexa Fluor® 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:300-1000 |