Avaliação da Planar-Cell-Polaridade fenótipos em Ciliopathy rato mutante cóclea
Summary
Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.
Abstract
In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest signaling pathways shown to be associated with ciliary function was the non-canonical Wnt signaling pathway, also referred to as planar cell polarity (PCP) signaling. One of the best places in which to study the effects of planar cell polarity (PCP) signaling during vertebrate development is the mammalian cochlea. PCP signaling disruption in the mouse cochlea disrupts cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, all of which are affected by cilia dysfunction. The goal of this protocol is to describe the analysis of PCP signaling in the developing mammalian cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. Defects in convergence and extension are manifested as a shortening of the cochlear duct and/or changes in cellular patterning, which can be quantified following dissection from developing mouse mutants. Changes in stereociliary bundle orientation and kinocilia length or positioning can be observed and quantitated using either immunofluorescence or scanning electron microscopy (SEM). A deeper insight into the role of ciliary proteins in cellular signaling pathways and other biological phenomena is crucial for our understanding of cellular and developmental biology, as well as for the development of targeted treatment strategies.
Introduction
cílios são apêndices longos à base de microtúbulos que se estendem a partir da superfície da maioria das células de mamífero. cílios são muitas vezes confundidos com cílios móveis, dos quais há sempre múltiplas por célula, e cuja finalidade é mover o líquido através de superfícies de membranas. cílios, ao contrário, adotar papéis sensoriais e são, consequentemente, também referida como cílios sensorial. Uma vez que há muito esquecido, esta organela foi recentemente 'redescoberto' como resultado de sua associação com uma infinidade de doenças genéticas humanas 1. Idealmente posicionado como um organelo de sinalização, o cílio primário tem sido demonstrado que regulam numerosas vias de sinalização, muitas das quais são importantes, não só na homeostasia dos tecidos e doença, como também durante o desenvolvimento 2.
Uma das primeiras vias de sinalização mostrado estar associada com disfunção cílios foi a via de sinalização Wnt não canónicas, também conhecida como a polaridade celular planar (PCP) via <sup > 3. Esta cascata de sinalização inicialmente identificado em Drosophila, é crítico para a embriogénese; em particular para os processos de convergência e de extensão e para a orientação correcta de células no plano de epitélios 4. A sinalização sequencial de um núcleo de um conjunto de proteínas reguladoras traduz sinais direccionais que em última análise levam a rearranjos do citoesqueleto e resultam na polarização coordenada de células epiteliais num plano 5. O processo de convergência e de extensão é absolutamente necessária para o ducto coclear para alongar e para a correcta modelação celular 6. Como este é regulado através da activação da via de PCP, um dos mais marcantes de fenótipos mutantes PCP cóclea é um ducto coclear encurtado com desorganizado epitélio sensorial 7. Da mesma forma, ratos mutantes, que não têm cílios, também apresentam como uma convergência e extensão fenótipo 8,9, embora precisamente como isso é regulado continua a ser elucidado.
ve_content "> Como os processos de convergência e de extensão são críticas para o crescimento do ducto coclear, e padronização celular do epitélio sensorial dentro do ducto coclear, na cóclea em desenvolvimento é um órgão ideal para analisar a sinalização PCP durante o desenvolvimento dos vertebrados. O órgão de Corti, o termo dado para o epitélio sensorial especializado que as linhas do ducto coclear, é constituído por células de suporte não-sensoriais e células ciliadas mecanosensorial que devem ser uniformemente orientada para a cóclea para funcionar 10. as células ciliadas mecanosensorial são assim chamados por causa da feixes stereociliary que se estendem a partir da placa cuticular (superfície apical) de cada uma das células pilosas sensitivas 11. Estes agem como transdutores primárias de mechanosensation e apesar da sua nomenclatura como estereocílios, são na verdade, composto de microvilosidades à base de filamentos de actina modificado. Dentro de cada cabelo em forma de viga pacote, três fileiras de estereocílios são organizados em uma pa altamente ordenada e regular,ttern em um caso semelhante a forma de escada. Cílios à base de microtúbulos real, kinocilia chamados, são necessários para o desenvolvimento e orientação dos feixes stereociliary 12. Em cima de cada célula de cabelo, um único cinocílio está fisicamente ligado ao pacote stereocilia, com localização central adjacente à linha mais alta de estereocílios. A função precisa da cinocílio não é clara, e uma hipótese é que a cinocílio 'puxa' estereocílios em forma à medida que amadurecem a partir microvilosidades 12. Nos vertebrados, kinocilia na cóclea estão presentes apenas transitoriamente e retrair a partir das células ciliadas em ratos antes do início da audição 11,13,14.Perda completa dos cílios na cóclea em desenvolvimento resulta em ductos cocleares severamente encurtado, mis-formados e mal-orientada feixes stereociliary, bem como corpos basais mis-posicionado 8,9. Um cílio funcional não é apenas composto pelo axonema ciliar. Muitas proteínas associadas com cíliosfunção ocorrem em complexos localizados para subdomínios cílios-relacionadas, como o corpo basal, zona de transição, ou axonema ciliar 15. O corpo basal, derivado do centriole mãe do centrossoma, é também um centro-organização de microtúbulos de microtúbulos que se estendem para longe do cílio para o corpo celular e pode regular o tráfico intracelular, bem como o tráfico ciliar. A zona de transição ciliar é outra região onde a função ciliar é regulada em termos de organização de importação e exportação de compostos ciliares 16.
Vários estudos têm identificado uma ligação entre os cílios e Wnt não canónicas (sinalização PCP), embora o mecanismo exacto é incerto 17. Redundância dos genes ciliares e do PCP e da sensibilidade da polaridade celular para anormalidades celulares generalizadas, tornam difícil ligar diretamente uma mutação a déficits específicos do PCP. Uma das saídas de leitura de sinalização PCP é o posicionamento do corpo basal e Primary cílio, portanto, segregando o principal dos defeitos secundários é um desafio. Alguns estudos em peixes-zebra e mouse mutantes sugeriram nenhuma conexão entre os cílios e sinalização Wnt 18-20. Discrepâncias nos dados podem refletir espécies, tecidos ou diferenças temporais dependentes das contribuições ciliares no sentido de sinalização Wnt. Além disso, a capacidade de resposta Wnt normal, pode ser mantido se os corpos basais permanecem funcionais. Uma visão mais profunda sobre o papel das proteínas ciliares em vias de sinalização celular e outros fenômenos biológicos é crucial para a nossa compreensão da biologia celular e de desenvolvimento, bem como para o desenvolvimento de estratégias de tratamento direcionados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ao preparar o tecido coclear para análise, existem alguns pontos-chave a ter em conta. Em primeiro lugar, as diferenças de fundo genético pode modificar o fenótipo coclear, tornando-se necessário analisar e comparar apenas os controlos da mesma ninhada. Em segundo lugar, a remoção completa da membrana tectória é necessário para obter as melhores imagens com imuno-histoquímica e é essencial para SEM. A membrana tectória é uma estrutura opaca e pode obscurecer as células do epitélio sensorial directamente …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O autor gostaria de agradecer a Matthew Kelley, Tiziana Cogliati, Jessica Gumerson, Uwe Wolfrum, Rivka Levron, Viola Kretschmer e Zoe Mann e para a sua avaliação crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo Prêmio Sofja Kovalevskaya (Humbodlt Foundation) e da Universidade Johannes-Gutenberg, Mainz, Alemanha.
Materials
| Tools/Equipment | |||
| Silicone elastomere – Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | See Note 2 |
| Micro dissecting scissors-straight blade | Various | ||
| Fine forceps (no. 5 and 55) and blunt forceps | Various | ||
| Dissecting microscope. | Various | ||
| Uncoated glass microscope slides | Various | ||
| Microscope cover slips (22 mm × 40 mm × 0.15 mm) | Various | ||
| Transfer pipettes | Various | ||
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SEM sample holder | tousimis | 8762 | |
| Scanning electron microscopy studs | TED PELLA | 16111 | |
| PELCO Tabs: Carbon adhesive | TED PELLA | 16084-3 | |
| Fluorescent Microscope | Various | ||
| Critical Point Dryer | Various | ||
| Scanning Electron Microscope | Various | ||
| Glass microscope slides | Various | ||
| Glass coverslips | Various | ||
| Kimwipe Tissue | Various | ||
| Fine Paint Brush | |||
| Reagents | |||
| 1× Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco/Life Technologies | 10010023 | |
| Paraformaldehyde (PFA) (EM Grade Required for EM) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS made fresh each time. EM Grade Required for EM. | |
| 2.5% Glutaraldehyde Grade1 | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Tris-HCl (pH 7.5) | Various | ||
| NaCl | Various | ||
| CaCl 2 | Various | ||
| Triton X-100 | Various | ||
| Normal Goat Serum | Various | ||
| AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-007-003 | |
| Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| 10× Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco/Life Technologies | 14065 | |
| Hepes | Gibco/Life Technologies | 15630-080 | |
| Osmium tetroxide (OsO4 ) | Sigma-Aldrich/Fluka Analytical | 75632 | |
| Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
| Ethanol 200 proof | Various | ||
| Antibodies | |||
| anti Arl13b | Protein Tech | 17711-1-AP | Suggested concentration 1:1000 |
| anti acetylated tubulin (611-B1) | Sigma-Aldrich | T6793 | Suggested concentration 1:800 |
| anti gamma tubulin (GTU-88) | Sigma-Aldrich | T6557 | Suggested concentration 1:200 |
| anti Zo_1 | Invitrogen | 40-2300 | Suggested concentration 1:500 |
| Myosin VI | Proteus Biosciences | 25-6791 | Suggested concentration 1:1000 |
| Myosin VIIa | Proteus Biosciences | 25-6790 | Suggested concentration 1:1000 |
| anti Vangl2 | Merk Millipore | ABN373 | Suggested concentration 1:250 |
| anti Gαi3 | Sigma-Aldrich | G4040 | Suggested concentration 1:250 |
| Alexa Fluor® 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:300-1000 |
| Alexa Fluor® 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:300-1000 |
References
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