Avaliação da Planar-Cell-Polaridade fenótipos em Ciliopathy rato mutante cóclea

Summary

Os cílios primários influenciam várias vias de sinalização. A cóclea de mamíferos é ideal para examinar a sinalização da polaridade das células planares (PCP). A disfunção dos cílios afeta o crescimento coclear, a padronização celular e a orientação das células ciliadas, as leituras de PCP. Nosso objetivo é analisar a sinalização de PCP na cóclea de camundongo por meio de análise fenotípica, imuno-histoquímica e microscopia eletrônica de varredura.

Abstract

Nos últimos anos, os cílios primários surgiram como reguladores-chave no desenvolvimento e na doença, influenciando inúmeras vias de sinalização. Uma das primeiras vias de sinalização associadas à função ciliar foi a via de sinalização Wnt não canônica, também conhecida como sinalização de polaridade celular planar (PCP). Um dos melhores lugares para estudar os efeitos da sinalização da polaridade das células planares (PCP) durante o desenvolvimento dos vertebrados é a cóclea dos mamíferos. A interrupção da sinalização de PCP na cóclea do camundongo interrompe o crescimento coclear, o padrão celular e a orientação das células ciliadas, todos afetados pela disfunção dos cílios. O objetivo deste protocolo é descrever a análise da sinalização de PCP na cóclea de mamíferos em desenvolvimento por meio de análise fenotípica, imuno-histoquímica e microscopia eletrônica de varredura. Defeitos na convergência e extensão se manifestam como um encurtamento do ducto coclear e/ou alterações no padrão celular, que podem ser quantificados após a dissecção de mutantes de camundongos em desenvolvimento. Alterações na orientação do feixe estereociliar e no comprimento ou posicionamento dos cinocílios podem ser observadas e quantificadas usando imunofluorescência ou microscopia eletrônica de varredura (MEV). Uma visão mais profunda do papel das proteínas ciliares nas vias de sinalização celular e outros fenômenos biológicos é crucial para nossa compreensão da biologia celular e do desenvolvimento, bem como para o desenvolvimento de estratégias de tratamento direcionadas.

Introduction

cílios são apêndices longos à base de microtúbulos que se estendem a partir da superfície da maioria das células de mamífero. cílios são muitas vezes confundidos com cílios móveis, dos quais há sempre múltiplas por célula, e cuja finalidade é mover o líquido através de superfícies de membranas. cílios, ao contrário, adotar papéis sensoriais e são, consequentemente, também referida como cílios sensorial. Uma vez que há muito esquecido, esta organela foi recentemente 'redescoberto' como resultado de sua associação com uma infinidade de doenças genéticas humanas ^1. Idealmente posicionado como um organelo de sinalização, o cílio primário tem sido demon....

Protocol

Use e sacrificar todos os animais de acordo com as diretrizes e regulamentos institucionais e governamentais, mais comumente através de _inalação de CO 2 e deslocamento cervical.

1. Preparação dos Reagentes

NOTA: Antes de começar, prepare todos os reagentes utilizando reagentes de qualidade analítica. Faça soluções utilizando grau molecular água destilada e deionizada salvo indicação em contrário.

1. Salina tamponada com fosfato (PBS 1x): Adicione 1 L de 1x PBS dissolvendo 8g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na ₂ HPO ₄ e 0,24 g _de KH 2 PO _{4 em} 1 L de H ₂ O. Ajustar o pH para 7,4 ....

Results

Cóclea Dissecção e Preparação de tecidos

Após remoção do cérebro, pós-linha média dissecção sagital de uma cabeça de rato P0, o labirinto ósseo, visto de trás, pode ser visualizado (Figura 1A, seta branca) e removido. A Figura 1B mostra os ósseas labirintos isolado com o cabelo coclear virados para cima, ventral, (à esquerda) e por trás, dorsal (direita). A seta aponta branco .......

Discussion

Ao preparar o tecido coclear para análise, existem alguns pontos-chave a ter em conta. Em primeiro lugar, as diferenças de fundo genético pode modificar o fenótipo coclear, tornando-se necessário analisar e comparar apenas os controlos da mesma ninhada. Em segundo lugar, a remoção completa da membrana tectória é necessário para obter as melhores imagens com imuno-histoquímica e é essencial para SEM. A membrana tectória é uma estrutura opaca e pode obscurecer as células do epitélio sensorial directamente por baixo, torna.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ferramentas/Equipamento
Elastômero de silicone - Sylgard 184	Sigma-Aldrich	761028-5EA	Ver Nota 2
Tesoura de microdissecação - lâmina reta Várias
pinças finas (nº 5 e 55) e pinças rombas	Várias
microscópios de dissecação.	Várias
lâminas de microscópio de vidro não revestidas	Várias
lamínulas de microscópio (22 mm & 40 mm &vezes; 0,15 mm)	Várias
pipetas de transferência	Vários
pinos Minutiens	Fine Science Tools	26002-10
SEM suporte de amostra	tousimis	8762
Pinos de microscopia eletrônica de varredura	TED PELLA	16111
PELCO Abas: Adesivo de carbono	TED PELLA	16084-3
Microscópio Fluorescente	Vários
Secador de Ponto Crítico	Vários
Microscópio Eletrônico de Varredura	Várias
lâminas de microscópio de vidro	Várias
lamínulas de vidro	Vários
tecidos Kimwipe	Vários
reagentes
de pincel
1 e vezes; Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Gibco/Life Technologies	10010023
Paraformaldeído  (PFA) (Grau EM Necessário para EM)	Vários		Prepare uma solução de 4% em 1 e vezes; PBS feito fresco a cada vez. Grau EM necessário para EM.
2,5% Glutaraldeído Grau1	Sigma-Aldrich	G5882
Tris-HCl (pH 7,5)	Vários
NaCl	Vários
CaCl 2	Vários
Triton X-100	Vários
Soro de Cabra Normal	Vários
AffiniPure Fab Fragmento Burro Anti-Rato IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearch	715-007-003
Fluoromount-G Mídia de montagem	SouthernBiotech	0100-01
10&vezes; Hanks ' Solução salina balanceada (HBSS)	Gibco / Life Technologies	14065
Hepes	Gibco / Life Technologies	15630-080
Tetróxido de ósmio (OsO4)	Sigma-Aldrich / Fluka Analytical	75632
Ácido tânico	Sigma-Aldrich	403040
Etanol 200 prova	Vários
anticorpos
anti Arl13b	Protein Tech	17711-1-AP	Concentração sugerida 1:1.000
anti-tubulina acetilada (611-B1)	Sigma-Aldrich	T6793	Concentração sugerida 1:800
anti gama tubulina (GTU-88)	Sigma-Aldrich	T6557	Concentração sugerida 1:200
anti Zo_1	Invitrogen	40-2300	Concentração sugerida 1:500
Miosina VI	Proteus Biosciences	25-6791	Concentração sugerida 1:1000
Miosina VIIa	Proteus Biosciences	25-6790	Concentração sugerida 1:1.000
anti Vangl2	Merk Millipore	ABN373	Concentração sugerida 1:250
anti Gα i3	Sigma-Aldrich	G4040	Concentração sugerida 1:250
Alexa Fluor® 488 Faloidina	Invitrogen/Life Technologies	A12379	Concentração sugerida 1:300 - 1.000
Alexa Fluor® 568 Faloidina	Invitrogen/Life Technologies	A12380	Concentração sugerida 1:300 - 1.000