Imaging membranpotensialet med to typer genetisk kodet Fluorescent Spenning Sensorer
Summary
A method for imaging changes in membrane potential using genetically encoded voltage indicators is described.
Abstract
Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate goal is to image neuronal activity in vivo, one must be able to image activity of a single cell to ensure successful in vivo preparations. This procedure will describe how to image membrane potential in a single cell to provide a foundation to eventually image in vivo. Here we describe methods for imaging GEVIs consisting of a voltage-sensing domain fused to either a single fluorescent protein (FP) or two fluorescent proteins capable of Förster resonance energy transfer (FRET) in vitro. Using an image splitter enables the projection of images created by two different wavelengths onto the same charge-coupled device (CCD) camera simultaneously. The image splitter positions a second filter cube in the light path. This second filter cube consists of a dichroic and two emission filters to separate the donor and acceptor fluorescent wavelengths depending on the FPs of the GEVI. This setup enables the simultaneous recording of both the acceptor and donor fluorescent partners while the membrane potential is manipulated via whole cell patch clamp configuration. When using a GEVI consisting of a single FP, the second filter cube can be removed allowing the mirrors in the image splitter to project a single image onto the CCD camera.
Introduction
De viktigste fokus for denne artikkelen er å vise den optiske bilde av endringer i membranpotensialer in vitro ved bruk av genetisk kodet fluorescerende proteiner. Imaging endringer i membranpotensiale tilbyr spennende mulighet til å studere aktiviteten til nevrale kretser. Når forandringer i membranpotensialet resulterer i en fluorescens-intensitet endring, blir hver piksel i kameraet et surrogat elektrode som gjør det mulig nonintrusive målinger av neuronal aktivitet. I over førti år har organiske spenningsfølsomme fargestoffer vært nyttig for å observere endringer i membranpotensialet 1-4. Men disse fargestoffer mangler cellulær spesifisitet. I tillegg er noen celletyper er vanskelige å farge. Genetisk kodede spenningsindikatorer (GEVIs) overvinne disse begrensningene ved at cellene som skal studeres spesifikt uttrykker det fluorescerende spenningsfølsom sonde.
Det er tre klasser av GEVIs. Den første klassen av Gevi bruker voltage-sensing domenet fra spenningsføler fosfatase med enten en enkel fluorescerende protein (FP) 5-9 eller en Förster resonans energi overføring (FRET) pair 10-12. Den andre klasse av sensorer benytter mikrobiell rhodopsin som en fluorescerende indikator direkte 13-15 eller via elektrokromatiske FRET 16,17. Den tredje klasse utnytter to komponenter, den genetiske komponenten være en membran forankret FP og en andre komponent er et membranbundet bråkjøling fargestoff 18-20. Mens den andre og tredje klasser er nyttige for in vitro-forsøk og eksperimenter stykke 19,20, bare den første klasse av sensorer er for tiden nyttige for in vivo-analyser 6.
I denne rapporten vil vi demonstrere avbildning av membranpotensialet ved bruk av første klasse av GEVIs (figur 1) in vitro. Denne første klasse av spenningssensorene er den enkleste å gå over til in vivo imaging. Siden GEVIs utilizing en spenningsføler domene fusert til et FP er omtrent 50-ganger sterkere enn den rhodopsin klasse av sensorer, de kan avbildes ved hjelp av buelampe belysning i stedet for å kreve en ekstremt kraftig laser. En annen konsekvens av den forskjellen i lysstyrke er at den første klassen av GEVIs lett kan overstige auto-fluorescens av hjernen. De Rhodopsin-baserte prober kan ikke. Den tredje klasse av sensoren er like sterk som den første klasse, men krever tilsetning av en kjemisk quencher som er vanskelig å administrere in vivo.
Vi vil derfor demonstrere oppkjøpet av en sonde med en enkelt FP (Bongwoori) 8 og en sonde som består av en FRET par (Nabi 2) 12. Gnage konstruerer i denne rapporten er sommerfugl versjoner av VSFP-CR (spenningssensitive fluorescerende proteiner – Clover-mRuby2) 11 som består av en grønn fluorescerende donor, Clover, og en rød fluorescerende akseptor, mRuby2, oppkalt Nabi 2,242 og Nabi 2,244 <sopp> 12. Innledningen til disse typer opptakene skal gi forskerne en bedre forståelse av hvilken type informasjon GEVIs kan gi.
Figur 1. To typer genetisk kodet spenningsindikatorer (GEVIs) avbildet i denne rapporten (A) En mono FP basert Gevi ha en trans-membran spenningsføler domene og et fluorescerende protein. (B) En FRET basert Gevi består av en trans-membran spenningsføler domene, en FRET donor og akseptor. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nervesystemet benytter spenning på flere forskjellige måter, fører til hemming en svak hyperpolarisering, fører synaptisk inngangs en svak depolarisering og et aksjonspotensial resulterer i en forholdsvis stor spenningsendring. Evnen til å måle endringer i membranpotensial ved GEVIs tilbyr det lovende potensialet til å analysere flere komponenter av nevronale kretser samtidig. I denne rapporten demonstrerer vi en grunnleggende metode for avbildning forandringer i membranpotensialet ved hjelp av GEVIs.
<p clas…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the World Class Institute (WCI) program of the National Research Foundation of Korea funded by Ministry of Education, Science, and Technology of Korea Grant WCI 2009-003 and Korea Institute of Science and Technology Institutional Program Project 2E24210. Sungmoo Lee was supported by Global Ph.D. Fellowship program (NRF-2013H1A2A1033344) of the National Research Foundation (NRF) under the Ministry of Education (MOE, Korea).
Materials
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| 60X objective lens (numerical aperture = 1.35) | Olympus | UPLSAPO 60XO | |
| Excitation filter | Semrock | FF02-472/30 | For voltage imaging of super ecliptic pHluorin in Bongwoori |
| Dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03-25×36 | |
| Emission filter | Semrock | FF01-497/LP | |
| 75W Xenon arc lamp | CAIRN | OptoSource Illuminator | LEDs and lasers are also effective light sources |
| Slow speed CCD camera | Hitachi | KP-D20BU | |
| Dual port camera adaptor | Olympus | U-DPCAD | |
| High speed CCD camera | RedShirtImaging, LLC | NeuroCCD-SM | |
| Image splitter | CAIRN | Optosplit 2 | |
| Excitation filter | Semrock | FF01-475/23-25 | For voltage imaging of FRET pair based GEVI consisting of Clover and mRuby2) |
| Dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03-25×36 | |
| Emission filter | Chroma | ET520/40 | |
| Dichroic mirror | Semrock | FF560-FDi01-25X36 | |
| Emission filter | Chroma | ET645/75 | |
| Vibration isolation system | Kinetic systems | 250BM-IC, 5702E-3036-31 | |
| Patching chamber | Warner instruments | RC-26G, 64-0235 | |
| #0 Micro Coverglass (22x40mm) | Electron Microscopy Sciences | 72198-20 | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-344B | |
| #0 (0.08~0.13mm) – 10mm diameter glass coverslip | Ted Pella | 260366 | |
| Lipofection agent | Life Technologies | 11668-027 | |
| Calcium phosphate reagent | Clontech – Takara | 631312 | |
| Patch clamp amplifier | HEKA | EPC 10 USB amplifier | |
| Multi-channel data acquisition software | HEKA | Patchmaster | |
| Image acquisition and analysis software | RedShirtImaging | Neuroplex | |
| Spreadsheet application software | Microsoft | Microsoft Excel 2010 | |
| Data analysis software | OriginLab | OriginPro 8.6.0 | |
| Demagnifier | Qioptiq LINOS | Optem standard camera coupler 0.38x SC38 J clamp | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1R confocal microscope | |
| Anti-fade reagent | Life Technologies | P36930 |
References
- Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system. Nature. 246, 508-509 (1973).
- Cohen, L. B., et al. Changes in axon fluorescence during activity: molecular probes of membrane potential. J. Membrane Biol. 19, 1-36 (1974).
- Tasaki, I., Warashina, A. Dye-membrane interaction and its changes during nerve excitation. Photochem Photobiol. 24, 191-207 (1976).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nat Rev Neurosci. 5, 874-885 (2004).
- Jin, L., Han, Z., Platisa, J., Wooltorton, J. R., Cohen, L. B., Pieribone, V. A. Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescent protein voltage probe. Neuron. 75, 779-785 (2012).
- Cao, G., Platisa, J., Pieribone, V. A., Raccuglia, D., Kunst, M., Nitabach, M. N. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 154, 904-913 (2013).
- St-Pierre, F., Marshall, J. D., Yang, Y., Gong, Y., Schnitzer, M. J., Lin, M. Z. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nat Neurosci. 17, 884-889 (2014).
- Piao, H. H., Rajakumar, D., Kang, B. E., Kim, E. H., Baker, B. J. Combinatorial mutagenesis of the voltage-sensing domain enables the optical resolution of action potentials firing at 60 Hz by a genetically encoded fluorescent sensor of membrane potential. J Neurosci. 35, 372-385 (2015).
- Jung, A., Garcia, J. E., Kim, E., Yoon, B. J., Baker, B. J. Linker length and fusion site composition improve the optical signal of genetically encoded fluorescent voltage sensors. Neurophoton. 2, 021012 (2015).
- Dimitrov, D., et al. Engineering and characterization of an enhanced fluorescent protein voltage sensor. PLoS One. 2, e440 (2007).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9, 1005-1012 (2012).
- Sung, U., et al. Developing fast fluorescent protein voltage sensors by optimizing FRET interactions. PLoS One. 10, e0141585 (2015).
- Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., Maclaurin, D., Cohen, A. E. Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin. Nat Methods. 9, 90-95 (2012).
- Flytzanis, N. C., et al. Archaerhodopsin variants with enhanced voltage-sensitive fluorescence in mammalian and Caenorhabditis elegans neurons. Nat Commun. 5, 4894 (2014).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nat Methods. 11, 825-833 (2014).
- Gong, Y., Wagner, M. J., Zhong Li, J., Schnitzer, M. J. Imaging neural spiking in brain tissue using FRET-opsin protein voltage sensors. Nat Commun. 5, 3674 (2014).
- Zou, P., et al. Bright and fast multicoloured voltage reporters via electrochromic FRET. Nat Commun. 5, 4625 (2014).
- Chanda, B., Blunck, R., Faria, L. C., Schweizer, F. E., Mody, I., Bezanilla, F. A hybrid approach to measuring electrical activity in genetically specified neurons. Nat Neurosci. 8, 1619-1626 (2005).
- Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice. J Neurophysiol. 108, 3147-3160 (2012).
- Weigel, S., Flisikowska, T., Schnieke, A., Luksch, H. Hybrid voltage sensor imaging of eGFP-F expressing neurons in chicken midbrain slices. J Neurosci Methods. 233, 28-33 (2014).
- Waters, J. C., Sluder, G., Wolf, D. E. Live-Cell Fluorescence Imaging. Methods in Cell Biology Volume 81. , 115-140 (2007).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
- Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat Protoc. 1, 695-700 (2006).
- Molleman, A. . Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , 101-102 (2003).
- Osorio, N., Delmas, P. Patch clamp recording from enteric neurons in situ. Nat Protoc. 6, 15-27 (2010).
- Schroder, M., Kaufman, R. J. The mammalian unfolded protein response. Annu Rev Biochem. 74, 739-789 (2005).
- Wilt, B. A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. Photon shot noise limits on optical detection of neuronal spikes and estimation of spike timing. Biophys J. 104, 51-62 (2013).
- Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Knopfel, T. Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements. PLoS One. 3, e2514 (2008).
- Peterka, D. S., Takahashi, H., Yuste, R. Imaging voltage in neurons. Neuron. 69, 9-21 (2011).
