Introduction
Il principale obiettivo di questo lavoro è quello di dimostrare l'imaging ottico delle variazioni di potenziali di membrana in vitro utilizzando proteine fluorescenti geneticamente codificate. cambiamenti di imaging del potenziale di membrana offre l'eccitante possibilità di studiare l'attività dei circuiti neuronali. Quando i cambiamenti nella membrana risultato potenziale in un cambiamento intensità di fluorescenza, ogni pixel della telecamera diventa un elettrodo surrogata per misure non intrusivi di attività neuronale. Da oltre quarant'anni, coloranti organici voltaggio-sensibile sono stati utili per osservare i cambiamenti nel potenziale di membrana 1-4. Tuttavia, questi coloranti mancano di specificità cellulare. Inoltre, alcuni tipi di cellule sono difficili da macchiare. indicatori di tensione geneticamente codificati (GeViS) superare queste limitazioni avendo le cellule da studiare specificamente esprimono la sonda fluorescente tensione-sensibili.
Ci sono tre classi di Gevis. La prima classe di GEVI utilizza il vodominio della fosfatasi tensione-sensing ensione-sensing con una singola proteina fluorescente (FP) 5-9 o un paio 10-12 un Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET). La seconda classe di sensori utilizza microbica rodopsina come indicatore fluorescente direttamente 13-15 o tramite FRET elettrocromico 16,17. La terza classe utilizza due componenti, il componente genetica essendo un FP membrana ancorata ed un secondo componente essendo una membrana vincolato tempra colorante 18-20. Mentre il secondo e terzo classi sono utili per esperimenti in vitro e fetta 19,20, solo la prima classe di sensori sono attualmente utile per analisi in vivo 6.
In questo rapporto ci sarà dimostrare l'imaging del potenziale di membrana utilizzando la prima classe di Gevis (figura 1) in vitro. Questa prima classe di sensori di tensione è il più facile da passare a imaging in vivo. Dal momento che Gevis utilizing un dominio di rilevamento della tensione fuso ad una FP sono circa 50 volte più luminoso classe rodopsina dei sensori, possono essere ripreso con illuminazione lampada ad arco anziché richiedere un laser estremamente potente. Un'altra conseguenza della disparità di luminosità è che la prima classe di GeViS può facilmente superare l'auto-fluorescenza del cervello. Le sonde rodopsina-based non può. La terza classe di sensore è altrettanto chiaro come la prima classe, ma richiede l'aggiunta di un quencher chimico che è difficile da gestire in vivo.
Noi, quindi, dimostrare l'acquisizione di una sonda con un singolo FP (Bongwoori) 8 e una sonda costituita da una coppia FRET (Nabi 2) 12. Il FRET costruisce in questo rapporto sono versioni farfalla di VSFP-CR (proteine fluorescenti voltaggio-sensibile - Clover-mRuby2) 11 costituito da un donatore fluorescente verde, trifoglio, e un accettore fluorescente rossa, mRuby2, chiamato Nabi 2.242 e 2.244 Nabi 
Figura 1. due tipi di indicatori geneticamente codificati tensione (Gevis) Divisori stampati in questo rapporto (A) Un FP mono basato GEVI avere un dominio di tensione-sensing trans-membrana e una proteina fluorescente. (B) Un GEVI basato FRET composto da un dominio di tensione-sensing trans-membrana, un donatore tasto e accettore. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Protocol
dichiarazione etica: Il protocollo sperimentazione animale è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa presso KIST protocollo animale 2014-001.
1. Installazione apparecchiature
- configurazione Imaging
- Inserire un microscopio invertito a fluorescenza su un tavolo isolamento dalle vibrazioni. Utilizzare un alto ingrandimento (lente immersione in olio 60X con 1,35 apertura numerica) lente obiettivo e un cubo filtrante con uno specchio dicroico e filtri adatti per le proteine fluorescenti utilizzate per imaging tensione.
Nota: Questa configurazione utilizza un microscopio invertito per utilizzare obiettivi con maggiore NA, ma microscopi verticali può anche essere usato. Infatti, il microscopio invertito è solo per lo sviluppo sonda dal maggiore apertura numerica (NA) dell'obiettivo obiettivo raccoglie più luce di quella con un basso NA migliorando così il rapporto segnale-rumore (SNR, può essere descritto come il segnale ottico picco diviso dal deviazione standard della linea di basefluorescenza) della registrazione. Per i non-sviluppatori, si consiglia un microscopio in posizione verticale per applicazioni quali fetta o nelle registrazioni vivo. - Preparare una sorgente luminosa, ad es., Xenon lampada ad arco, dotata di un otturatore meccanico per efficiente epifluorescenza immagini a grande campo. Dirigere la luce al microscopio tramite una guida di luce di montaggio. La luce passa attraverso il filtro di eccitazione e viene riflessa dal primo specchio dicroico nel cubo filtro. Allineate la luce per illuminare il campione uniformemente con intensità luminosa massimizzato il campo di vista 21.
Nota: Tradizionalmente, una lampada ad arco da 75 watt è stata utilizzata da più elevati lampadine wattaggio creano più grande, ma non i campi di illuminazione più brillanti. I laser possono essere usati ma sono limitati ad una singola lunghezza d'onda. I LED sono sempre più luminoso e possono effettivamente essere la fonte luminosa preferita offrendo molteplici lunghezze d'onda e che non richiedono un otturatore meccanico. - Montare le due telecamere CCD a flmicroscopio za come mostrato nella figura 2D.
Nota: La prima camera CCD è ad alta risoluzione spaziale e viene utilizzato per l'identificazione di una cellula che esprime il GEVI nella membrana plasmatica da testare. Per le modifiche di imaging del potenziale di membrana, in modo che la seconda camera CCD ha una struttura alto tasso quali 1.000 frame al secondo (fps). Utilizzare un adattatore per fotocamera doppia porta (figura 2D (3)) per cambiare il percorso per immagini tra le due telecamere CCD. In questa configurazione, un demagnifier viene utilizzato per adattare l'immagine dalla lente dell'obiettivo sul chip CCD nella seconda camera CCD. - Installare uno splitter immagine tra il primo (lento) e il secondo telecamere CCD (veloce) per l'imaging di GEVI basato FRET. Inserire un cubo filtro avente uno specchio dicroico (560 nm) e due filtri di emissione (520 nm / 40 e 645 nm / 75) nella splitter immagine. Questo si tradurrà in due campi di vista, uno per la fluorescenza del donatore e l'altro rappresenta la fluorescenza accettore. Rimuovere questo sFiltro econda cubo quando l'imaging un GEVI con una sola FP.
Nota: Il singolo GEVI basato FP testato in questo metodo è Bongwoori che utilizza la FP, super eclittica pHluorin A227D (SE A227D). Il filtro di eccitazione (472 nm / 30), filtro per le emissioni (497 nm / passaggio lungo) e lo specchio dicroico (495 nm) sono stati selezionati in base alla sua eccitazione ed emissione spettri 5. Generalmente, i filtri di eccitazione e di emissione dovrebbe avere la più grande sovrapposizione con ogni spettro del fluoroforo per acquisire un'immagine luminosa, mentre i blocchi specchio dicroico qualsiasi luce di eccitazione trasmessa attraverso il filtro per le emissioni. La selezione dei filtri e specchi dicroici per la registrazione GEVI basato FRET coppia 11 segue lo stesso principio, tranne che richiede un secondo cubo filtro nel splitter immagine per simultanea osservazione di donatore e accettore di fluorescenza. Il primo cubo filtro posto nella scatola filtro microscopio deve avere un filtro di eccitazione (475 nm / 23) di trifoglio. Poi il emessa fluorescence sia PQ sarà trasmessa al secondo cubo filtro attraverso il primo specchio dicroico (495 nm). Il secondo cubo filtro ha uno specchio dicroico (560 nm) e due filtri di emissione (520 nm / 40 per il trifoglio e 645 nm / 75 per mRuby2) per ogni FP separando così la fluorescenza da due diversi PQ.
- Inserire un microscopio invertito a fluorescenza su un tavolo isolamento dalle vibrazioni. Utilizzare un alto ingrandimento (lente immersione in olio 60X con 1,35 apertura numerica) lente obiettivo e un cubo filtrante con uno specchio dicroico e filtri adatti per le proteine fluorescenti utilizzate per imaging tensione.
| Singolo GEVI basato FP (Bongwoori) | FRET coppia GEVI base (Nabi 2.42 e 2.44 Nabi) | ||
| Prima cubo filtro posto nel microscopio | filtro di eccitazione | 472 nm / 30 | 475 nm / 23 |
| specchio dicroico | 495 nm | 495 nm | |
| filtro per le emissioni | 497 nm / passaggio lungo | - | |
| Secondo cubo filtro posto nel divisore di fascio | specchio dicroico | - | |
| filtro per le emissioni 1 | - | 520 nm / 40 | |
| filtro per le emissioni 2 | - | 645 nm / 75 |
Tabella 1. Due filtro differente set utilizzati per una singola GEVI FP base e un FRET Based GeVi Recordings
- isolamento delle vibrazioni
- Non montare le apparecchiature con lo spostamento dei componenti sul tavolo isolamento dalle vibrazioni. Assicurarsi che i cavi che sono collegati ad apparecchiature non isolato sono sciolti per evitare vibrazioni del campione.
- camera di patch clamp
- Sigillare la parte inferiore della camera di patch clamp con un sottile # 0 coprioggetto poiché la distanza di lavoro dell'obiettivo è relativamente piccola. Questo è uno svantaggio della configurazione microscopio invertito.
Nota: Come un compromesso di avere una elevata lente obiettivo NA, la distanza di lavoro diminuisce. Al fine di collocare la SPECIMen entro il breve distanza di lavoro, il vetro di copertura e il coprioggetto (step 2) devono essere il più sottile possibile.
- Sigillare la parte inferiore della camera di patch clamp con un sottile # 0 coprioggetto poiché la distanza di lavoro dell'obiettivo è relativamente piccola. Questo è uno svantaggio della configurazione microscopio invertito.
- Controllo della temperatura
- Assicurarsi che la soluzione del bagno scorre attraverso un regolatore di temperatura per mantenere le cellule rattoppate circa 33 ° C tutto l'esperimento.
- collegamenti dell 'apparecchiatura
- Collegare l'amplificatore patch clamp e l'otturatore meccanico della fonte di luce alla scatola di comando baionetta Neill-Concelman (BNC) della telecamera CCD ad alta velocità. Ciò consentirà il software di imaging per controllare l'amplificatore, videocamera, e la sorgente luminosa simultaneamente.
Nota: i componenti elettrici e di imaging devono essere sincronizzati in modo da fornire registrazioni elettriche ed ottiche simultanee di attività elettrica.
- Collegare l'amplificatore patch clamp e l'otturatore meccanico della fonte di luce alla scatola di comando baionetta Neill-Concelman (BNC) della telecamera CCD ad alta velocità. Ciò consentirà il software di imaging per controllare l'amplificatore, videocamera, e la sorgente luminosa simultaneamente.
Figura 2. EquipSetup mento per l'imaging di tensione con GeViS Il workflow seguendo il percorso ottico, (A) lampada ad arco 75W Xenon, (B) la luce di eccitazione dalla lampada ad arco viene filtrato dal filtro di eccitazione e quindi riflessa dal primo specchio dicroico prima che raggiunge il portaoggetti, un inserto in alto a destra mostra l'intera configurazione della cella, (C) la telecamera CCD lenta velocità viene utilizzato per aiutare sia scelta di un morsetto cellulare e patch, (D) della parte di acquisizione dell'immagine; (1) la fotocamera CCD ad alta velocità, (2) lo splitter immagine sia per Fret l'associazione e la mono FP Gevis, (3) la demagnifier per adattare l'immagine sul chip CCD nella telecamera CCD ad alta velocità, (4) il dual port adattatore videocamera di commutare il percorso imaging e (5) la telecamera lenta CCD velocità con elevata risoluzione spaziale per l'identificazione della cella di patch, (e & F) l'acquisizione di immagini con una base singola FP GEVI (e) ed un GEVI FRET-based(F). Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
2. Espressione dei Gevis
- In embrionali umane del rene 293 cellule
- Cultura embrionale umano Rene 293 (HEK 293) cellule con medie di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino a 37 ° C in un incubatore CO 2 (5% di CO 2). Utilizzare un piatto di coltura di tessuti con diametro di 100 mm e 20 mm di altezza. Avviare la coltura con 2 x 10 3 - 6 x 10 3 cellule / cm 2 e incubare fino a raggiungere 80-90% di confluenza per la successiva trasfezione.
- Il giorno della transfezione, aspirare i media di cellule e lavare delicatamente una volta con tampone fosfato Dulbecco. Disperdere le cellule HEK 293 con soluzione di tripsina-EDTA 0,25% per 1-2 minuti, aspirare la soluzione e toccare delicatamente il lato del piatto per staccare il cells. Aggiungere DMEM fresco (10% FBS) e dissociare le cellule aggregata pipettando. Determinare la concentrazione cellulare utilizzando un emocitometro.
- Inserite 0,08 - 0,13 millimetri di spessore, 10 mm di diametro coprioggetto pre-rivestito con poli-L-lisina in un 24-pozzetti di coltura tissutale. Seme le cellule HEK 293 su vetrini a 1 x 10 5 cellule / cm 2 densità cellulare.
Nota: Poiché HEK 293 cellule sono in grado di formare giunzioni tra loro, il numero di semi deve produrre cellule isolate. - Transitoriamente trasfezione le cellule con un adeguato costrutto gene che codifica per una GEVI utilizzando un reagente lipofezione seguendo le istruzioni del produttore.
Nota: I costrutti genici utilizzata in questa fase pcDNA3.1 utilizzata (Bongwoori) e pUB2.1 (Nabi 2.242) come vettori backbone. La quantità di DNA utilizzata era di 100 ng per ogni vetrino; Tuttavia, le condizioni di trasfezione devono essere determinati empiricamente per ogni GEVI da testare.
- In hip dissociata del mouseneuroni primari pocampal
- Sezionare ippocampi dal giorno embrionale 17 topi C57BL6 / N e quindi dissociare i neuroni dell'ippocampo come descritto in precedenza 22,23.
- Piastra i neuroni dissociati Onto poli-D-lisina rivestite 0.08-0.13 mm di spessore, 10 coprioggetto mm di diametro a 1 x 10 5 cellule / ml densità delle cellule. Incubare le cellule a 37 ° C in CO 2 incubatore (5% di CO 2).
- Trasfezione neuroni dissociati transitoriamente a 6 - 7 giorni in vitro (DIV) con un costrutto gene codificante una GEVI utilizzando un reagente di trasfezione fosfato di calcio come descritto in precedenza 24.
Nota: I costrutti genici utilizzata in questa fase pcDNA3.1 utilizzata (Bongwoori) e pUB2.1 (Nabi 2.244) come vettori backbone. La quantità di DNA utilizzato è stato di 1 mg per ogni coprioggetto. Ancora una volta, le condizioni di trasfezione devono essere determinati empiricamente per ogni GEVI testato.
- Controllare il livello di espressione prima di tensione imaging
- Prendere la piastra di coltura tissutale dall'incubatore CO 2 e osservare la fluorescenza dalle cellule trasfettate con un microscopio a epifluorescenza.
- Dopo aver confermato la fluorescenza dalla membrana, trasferire il vetrino alla camera di patch per imaging di tensione nella sezione 3.
Nota: la tensione di imaging è condotto 16 - 24 ore dopo la trasfezione. Tuttavia, come diverse proteine fluorescenti hanno diversi tempi di maturazione, alcuni Gevis bisogno di più tempo in trasfezione posta. Per esempio, le coppie FRET contenenti mRuby2 in questo protocollo potrebbe richiedere più tempo per esprimere in quanto la maturazione di mRuby2 prende significativamente più lungo rispetto Clover 11. La fluorescenza del donatore e accettore deve essere controllato.
3. Tensione Imaging Protocol
- Scegli una cellula sana con buona espressione di membrana
- Utilizzando la microscopia, trovare una cellula sana (Figura 4B) che mostra una fortemembrana fluorescenza localizzato rispetto alla fluorescenza interna. Cercate di non rattoppare le cellule arrotondate. cellule circolari sono sia divisione o morire e sono difficili da correggere. Applicare un impulso di prova di 5,0 mV in msec di ampiezza e 5,0 in durata per aiutare esperimenti successivi patch clamp.
- Preparare la cella per l'imaging di tensione
- Dopo aver scelto una cella per patch, posizionare la pipetta patch clamp sopra la cella. Portare la pipetta verso il basso fino a toccare delicatamente la membrana cellulare. A questo punto, osservare 1 MW - 2 MW aumento della resistenza della membrana sulla patch software morsetto 25.
NOTA: Occasionalmente, una buona tenuta giga ohm può avvenire semplicemente toccando la membrana cellulare. Finché il sigillo giga ohm è stabile, dovrebbe essere OK. - Stabilire un sigillo giga ohm applicando delicatamente pressione negativa attraverso la pipetta. Impostare il potenziale pipetta ad un potenziale tiene desiderato.
- Pur mantenendo il sigillo giga ohm, The cella con la fotocamera CCD ad alta velocità e concentrarsi alla zona della membrana.
- Rompere la membrana cellulare applicando impulsi di aspirazione per bocca o siringa delicatamente per fare una configurazione a cellula intera 26.
- Immagine patch bloccato cella sotto una configurazione tutta morsetto cella secondo il disegno sperimentale utilizzando un software di imaging
- Avviare il software di imaging. Fare clic su [Acquisisci] - menu [SciMeasure fotocamera] per aprire la pagina 'RILEVAZIONE CCD'.
- Creare un nuovo file di dati per salvare le immagini.
- Fare clic su [Uscita analogica] e poi [Leggi l'ASCII] per aprire un file di protocollo impulso di condurre l'imaging. Fare clic su 'la media dei ripetizioni interne' se i dati devono essere mediati. Poi chiudere la pagina 'USCITA ANALOGICA'.
Nota: deve essere progettato e salvato come file '.txt' a seconda dello scopo di ogni esperimento prima di questa fase Questo protocollo impulsi. - Impostare dell'acquis specificoparametri gnote dalla pagina 'RILEVAZIONE CCD'. Inserire i valori specifici per 'Numero di fotogrammi per l'acquisizione' e 'numero di prove'.
Nota: Il numero di frame è determinata dalla velocità di acquisizione e la tempistica del protocollo impulsi. Per esempio, se l'imaging a 1 kHz, 1.000 fotogrammi equivale a 1 sec di tempo di registrazione. - Fare clic su [prendere i dati (Ottica + BNC)] per avviare la registrazione. Mentre la tensione di imaging è in atto, guardare la finestra oscilloscopio dal software patch clamp per garantire la configurazione cellula intera stabile durante la registrazione.
Nota: Per testare gamma di tensioni di risposta del GEVI, formato del segnale in Af / valore F o risoluzione temporale in tutta la gamma di tensione fisiologica, condurre un intero esperimento morsetto di tensione delle cellule con impulsi di tensione un protocollo impulso di aver fatto un passo che vanno da -170 mV a 130 mV. Per determinare le prestazioni del GEVI nella risoluzione dei potenziali d'azione evocati da Prima coltaneuroni Ry, immagine della cella in una configurazione pinza amperometrica cellule intere.
- Dopo aver scelto una cella per patch, posizionare la pipetta patch clamp sopra la cella. Portare la pipetta verso il basso fino a toccare delicatamente la membrana cellulare. A questo punto, osservare 1 MW - 2 MW aumento della resistenza della membrana sulla patch software morsetto 25.
4. Acquisizione dati
- Calcolo di Af / F
- Avviare il software di imaging. Fare clic su [File] - [Lettura dati File] per aprire un file di dati da analizzare. Osservare l'immagine Cella nella sua intensità Riposo Luce (RLI) sul lato destro
Nota: Le medie software i primi 5 fotogrammi per determinare RLI della registrazione. - Clicca su 'Mostra' BNC per portare i valori di corrente e tensione misurata sullo schermo.
- Cambiare il modo di pagina dal 'RLI telaio' a 'sottrazione Frame' di utilizzare la funzione di cornice sottrazione di identificare i pixel con segnali ottici sensibili. Questo è il vero potere delle immagini dal momento che ogni pixel può essere esaminato per eventuali cambiamenti di fluorescenza.
- Selezionare due punti di tempo (F 0 e F 1) per la sottrazione. Identificare quale area della cella èmostrando segnali di rispondere ai cambiamenti potenziale di membrana.
Nota: Il SNR per le immagini telaio sottrazione può essere migliorata selezionando più fotogrammi per ciascun punto di tempo a media temporale del segnale. Il software sottrae l'intensità della luce media tratto da fotogrammi selezionati e calcola i valori F 1 -F 0 (Af). Di solito si sceglie un punto di volta acquisita presso l'azienda potenziale punto e un altro tempo impiegato durante il periodo di stimolazione. - Designare i pixel che devono essere analizzati mediante trascinamento o facendo clic su ogni pixel con il mouse del computer. Osservare la rappresentazione grafica l'intensità media di fluorescenza dai pixel selezionati sul lato sinistro della finestra del software. Figure 4B e 5B mostrano immagini rappresentative dall'analisi fotogramma sottrazione.
- Dividere i pixel sottratti dal RLI (F 0). Fare clic su [Dividere per RLIs] per acquisire valori Af / F
- Avviare il software di imaging. Fare clic su [File] - [Lettura dati File] per aprire un file di dati da analizzare. Osservare l'immagine Cella nella sua intensità Riposo Luce (RLI) sul lato destro
- Esporta dati
- Rimuovere i grafici di corrente e tensione per Cliccando di menù 'Mostra BNC. Vai a [OUTPUT] - [Salva Tracce come visualizzato (ASCII)] per esportare la traccia di fluorescenza in un formato di file ASCII per curva di analisi raccordo con software grafici standard.
Analisi 5. I dati
- Tensione di proprietà di rilevamento della GEVI
- Disegnare la variazione di fluorescenza rispetto al grafico di tensione (FV) riportando i valori Af / F rispetto alla tensione in un programma di analisi dei dati. Montare la curva a una funzione di Boltzmann (Tabella 2) per determinare il range di tensione del segnale ottico facendo clic su [ANALISI] - [montaggio] - [in forma sigmoidale] - [finestra di dialogo Apri], e quindi scegliere la funzione di Boltzmann.
Nota: Montaggio a una funzione rende possible per caratterizzare le proprietà di tensione di rilevamento di diverse sonde di tensione o per confrontare le loro prestazioni in celle diverse. La funzione Boltzmann può essere utilizzata per le sonde testati in questo lavoro perché le curve FV di tali sonde mostrano modello sigmoidale. - Normalizzare ogni valore Af / F utilizzando i valori iniziali e finali (A 1 e A 2) calcolato dalla funzione.
Nota: Nella equazione di Boltzmann, il minimo è di 1 A e il massimo è A 2. Per la normalizzazione, utilizzare un software di foglio di calcolo per regolare i valori Af / F definendo un 1 come zero e A 2 come uno. La media dei valori normalizzati Af / F e calcolare l'errore standard per l'analisi statistica. - Replot l'Af normalizzato / valori F rispetto alla tensione come precedentemente descritto nel paragrafo 5.1.1).
- Disegnare la variazione di fluorescenza rispetto al grafico di tensione (FV) riportando i valori Af / F rispetto alla tensione in un programma di analisi dei dati. Montare la curva a una funzione di Boltzmann (Tabella 2) per determinare il range di tensione del segnale ottico facendo clic su [ANALISI] - [montaggio] - [in forma sigmoidale] - [finestra di dialogo Apri], e quindi scegliere la funzione di Boltzmann.
- La velocità della risposta ottica
- Aprire il file ASCII acquisita dal punto 4.2.2) con una analisi dei datiprogramma e tracciare la traccia Af / F in funzione del tempo.
- Clicca su 'selettore di dati' nel software di analisi dei dati e selezionare un punto temporale corrispondente all'inizio di un impulso di tensione a gradini e un secondo punto di tempo in cui il segnale ottico ha raggiunto il regime. Adatta questa gamma sia a un singolo e doppia funzione di decadimento esponenziale facendo clic su [ANALISI] - [montaggio] - [fit esponenziale] - [Apri finestra di dialogo], e selezionare una funzione di decadimento esponenziale. Segnala la misura migliore.
Nota: Per il montaggio alle funzioni di decadimento esponenziale singole o doppie, le costanti di tempo quantificati rappresentati da τ possono essere acquisite. Ciò contribuirà a sperimentatori confrontare la cinetica delle loro misurazioni effettuate con indicatori di tensione differenti. La traccia di fluorescenza potrebbe mostrare componenti veloci e lenti che possono essere descritte con una doppia funzione di decadimento esponenziale. In questo caso, il calcolo si tradurrà in due costanti di tempo con ampiezze diverse. - Calcola °e costanti ponderata T per confrontare la cinetica di sonde che presentano due componenti temporali alle sonde con un singolo componente.
Nota: Un tau ponderato è calcolato come la somma di τ 1 moltiplicata per la relativa ampiezza, A 1, più τ 2 moltiplicato per la relativa ampiezza, A 2, come definito dalla seguente formula;
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Representative Results
Transitoriamente cellule transfettate possono presentare una significativa variazione di intensità di fluorescenza e il grado di espressione membrana plasmatica. Anche sullo stesso vetrino alcune cellule avranno diversi livelli di fluorescenza interna. Questo è probabilmente dovuto alla quantità di agente trasfezione assorbita dalla cella. Di tanto in tanto, troppo espressione fa sì che la cellula di sperimentare la risposta proteina spiegato con conseguente apoptosi 27 (luminoso, le cellule arrotondate, con elevata fluorescenza interna). Lo sperimentatore è quindi avvertito per testare sia cellule luminose e cellule dim con un minimo di fluorescenza interna possibile, in quanto espressione interno crea una fluorescenza non reattivo che abbassa il rapporto segnale rumore (SNR).
Un'altra considerazione è il tasso di maturazione dei cromofori. Figura 3 mostra disparità nella fluorescenza della chromoph accettoreore (mRuby2) che ha un tempo di maturazione più lungo del cromoforo donatore (trifoglio).
Figura 3. confocale immagini di cellule HEK 293 trasfettate con un FRET Based GEVI, Nabi2.242. (A) immagini confocale di una cella che mostrano HEK membrana fluorescenza localizzata da FRET donatore e accettore, (B) immagini confocale che mostrano un potenziale conseguenza di lenta maturazione di mRuby2. Tutte e quattro le cellule presentano Clover fluorescenza mentre solo due mostre mRuby2 fluorescenza. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Le immagini sono state acquisite da un microscopio confocale. Per il donatore FRET, trifoglio, 488 nm laser è stato utilizzato per l'eccitazione e l'emissione è stata captrato con 525/50 nm banda passante del filtro. L'accettore FRET, mRuby2, è stata illuminata con 561 nm laser per l'eccitazione e 595/50 nm banda passante del filtro è stato utilizzato per l'emissione. I campioni per l'imaging confocale sono state fissate con paraformaldeide al 4% / soluzione di saccarosio in tampone fosfato regolata a pH 7,4 e poi montati con un reagente anti-sbiadimento.
Una volta che le condizioni di trasfezione sono ottimizzate, la prossima fonte di variazione proviene dalla determinazione della regione di interesse da analizzare. Uso telaio sottrazione per identificare le regioni della cella con la massima variazione di fluorescenza è spesso usato per massimizzare il valore Af / F. Un'alternativa è quella di selezionare tutti i pixel che ricevono luce dalla cella. Questo aumenta il numero di pixel con conseguente riduzione del rumore, ma diminuisce la dimensione del segnale dal non-responsive fluorescenza interna è incluso. Entrambi i metodi sono bene fintanto sperimentatore rimane costante.
Figura 4. Imaging di tensione con un FP Based GEVI unico espressain cellule HEK 293 e neuroni dell'ippocampo primario. (A) Af / F traccia di una singola base di FP GEVI, Bongwoori, mostrando le risposte a impulsi di tensione a gradini registrati a 1 kHz con una telecamera CCD ad alta velocità. (B) Un HEK 293 cellule ripreso con la fotocamera CCD ad alta velocità; (A sinistra) Intensità Riposo Luce (RLI) di una cellula che esprime l'immagine di sottrazione (a destra) cornice che indica i pixel in cui è stato osservato il cambiamento di fluorescenza Bongwoori &. (C) la registrazione ottica dei potenziali d'azione indotta da topo neuroni primari dell'ippocampo che esprimono Bongwoori. I potenziali d'azione sono stati evocati in modalità morsetto corrente cellula intera. La traccia Af / F è stato selezionato tra i pixel correlati alla soma. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Un rappresentante fluorescence lettura dei cromofori donatore e accettore è mostrato in Figura 5A. La polarità del cambiamento di fluorescenza è opposto per il donatore e accettore consentendo analisi raziometrica per ridurre sorgenti di rumore correlate, ad es., Il movimento. Ad esempio, il movimento correlata rumore esporrà un cambiamento della fluorescenza nella stessa direzione per donatore e accettore di fluorescenza. Mentre la sonda basata FRET è capace di immagini raziometrico, spesso è meglio analizzare solo il cromoforo luminoso. Questo perché il cromoforo dimmer può aumentare sostanzialmente il rumore della registrazione. Figura 5B mostra questo effetto. La sottrazione struttura in Figura 5B dal brillante trifoglio mostra chiaramente dove il segnale ottico nella cella. Al contrario, il telaio sottrazione di mRuby2 fluorescenza mostra gradi più elevati del rumore in tutta la cella. Pertanto, solo il segnale donatore trifoglio è mostrato in un neurone dell'ippocampo in Fifigura 5C.
Figura 5. immagini di tensione con un FRET basata GEVI espresso in HEK 293 cellule e neuroni primari dell'ippocampo. (A) Af / F traccia di un GEVI FRET basata, Nabi2.242, che mostra le risposte a due lunghezze d'onda a impulsi di tensione a gradini registrati a 1 kHz con una telecamera CCD ad alta velocità. (B) superiore; il donatore (Clover-RLI, Clover-frame sottrazione) e accettore (mRuby2-RLI, mRuby2-frame sottrazione) immagini elaborate con due soglie diverse per ogni FP, in basso; la stessa soglia è stata utilizzata sia per il donatore (Clover-RLI, Clover-frame sottrazione) e accettore (mRuby2-RLI, mRuby2-frame sottrazione) immagini per illustrare la penombra relativo di mRuby2. Tutte le immagini sono state scattate dalla stessa cellula HEK 293 che esprimono Nabi2.242. (C) La 520 nm di lunghezza d'onda trasso di potenziali d'azione indotta da un topo neuroni dell'ippocampo primaria che esprimono sensore Nabi2.244. La traccia Af / F è stato selezionato tra i pixel correlati alla soma. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Conseguenze di diversi livelli di luce per Af e Af / F valori. (A) L'immagine di uno HEK 293 cellule che esprimono un unico basato FP GEVI, Bongwoori, mostrati in Intensità Riposo Luce (RLI), (B) le tracce di fluorescenza che mostrano kernel media Af (F x -F 0) valori da tre diverse regioni, la regione 1: regione membrana con segnale di fluorescenza ben localizzato, regione 2: una regione con una brillante fluorescenza interna, unD regione 3: regione lontana dal segnale ottico, (C) le tracce di fluorescenza mostrano kernel in media valori Af / F dalle stesse regioni (B). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| concetti | equazioni | Osservazione |
| Frazionale cambiamento di fluorescenza (Af / F) |  | F 1 = intensità della luce misurata in un punto di tempo, F 0 = intensità della luce misurata a potenziale tenendo |
| funzione di Boltzmann |  | y = Af / F, V = potenziale di membrana in mV, V 1/2 è il potenziale di membrana in mV a metà-massimale Af / F, A |
| Doppia funzione decadimento esponenziale | y = y 0 + 1 A e - (t - t 0) / τ 1 + A 2 e - (t - t 0) / τ 2 | T si 1, τ 2 = costanti di tempo, a 1, a 2 = ampiezze, t, t 0 = due punti di tempo, compensati y 0 = |
Tabella 2. Equazioni
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Discussion
Il sistema nervoso utilizza tensione in diversi modi, inibizione provoca un leggero iperpolarizzazione, ingresso sinaptica provoca un leggero depolarizzazione e un'azione potenziali risultati in un cambiamento relativamente grande tensione. La possibilità di misurare le variazioni del potenziale di membrana dalla Gevis offre il potenziale promettente di analizzare diversi componenti di circuiti neuronali contemporaneamente. In questo rapporto si dimostra un metodo fondamentale per le modifiche di imaging del potenziale di membrana utilizzando Gevis.
Una chiave importante per modifiche di imaging in tensione è l'espressione efficiente del GEVI nella membrana plasmatica. espressione intracellulare crea una fluorescenza non reattivo che riduce il SNR della sonda. Ottimizzare le condizioni di trasfezione migliora notevolmente la coerenza delle misure ottiche. Infatti, quando si verifica un romanzo GEVI è consigliabile testare anche una sonda nota per garantire che le differenze nelle attività ottica è dovuto unicamente alla neSonda w e non le condizioni delle celle.
La Figura 6 mostra l'effetto della fluorescenza interna diminuire la sensibilità dell'imaging tensione, valore Af / F. La Figura 6B mostra Af valori una cellula HEK esprime il GEVI base singola FP, Bongwoori. Traccia 2 proviene dalla regione 2 (colore blu), dove relativamente brillante fluorescenza interna si vede in Figura 6A. Questa traccia ha analogo livello di valore Af come traccia 1. Tuttavia, nella Figura 6C dove le tracce della figura 6B sono stati divisi da valori RLI per i valori Af / F, la traccia 2 gocce in modo significativo a causa della fluorescenza interna luminoso che diminuisce Af / F valori. Fluorescenza trace 3 ha una piccolissima Af ma ha anche un valore molto piccolo RLI (F). Il risultato è un segnale / Af fuorviante F che ha un sostanziale aumento nel rumore della registrazione. Questo esempio è stato incluso per dimostrare la Af è ancheimportante. Un grande cambiamento di Af / F non è utile se F è molto basso per cominciare.
L'uso di un divisore immagini consente la misura contemporanea di due lunghezze d'onda su una singola telecamera CCD. Questo aiuta notevolmente la misurazione di FRET variazioni fluorescenti dipendente per lo sviluppo sonda e riduce il costo dell'installazione. Tuttavia, a causa di aberrazione cromatica, queste due immagini saranno leggermente fuori fuoco implicano la necessità di un obiettivo apocromatico. La luce più sono e meglio SNR, in modo da scegliere gli obiettivi con la massima apertura numerica migliora anche imaging di fluorescenza. Inoltre, si possono utilizzare sorgenti luminose forti quali diodi emettitori di luce (LED) o laser per aumentare SNR. I LED non richiedono un otturatore meccanico.
In questo rapporto ci mostra i segnali ottici da un unico FP GEVI e un GEVI FRET-based. Il vantaggio principale di una GEVI FRET-based è che l'imaging raziometrico consente la riduzione del rumore correlata due per la respirazione e il flusso di sangue in vivo. La polarità opposta dei segnali fluorescenti conferma un cambiamento reale nel potenziale di membrana. Tuttavia, poiché le intensità di fluorescenza dei due cromofori spesso variano notevolmente, il SNR sarà anche variare. Questo confonde l'analisi raziometrico e limita la sua utilità 28. Non ci può essere anche un segnale FRET indipendente 29. È perciò talvolta preferibile utilizzare solo il cromoforo luminosa fluorescente utilizzando FRET analizzare variazioni del potenziale di membrana.
Imaging tensione è più impegnativo di calcium imaging a causa della velocità e la variabilità delle variazioni di potenziale di membrana rispetto a calcium imaging che misura il flusso di calcio. I potenziali di membrana variazioni scale di tempo molto veloci rispetto al calcio ione flusso, ed eventi sottosoglia in neuroni non possono essere misurati con calcium imaging 30. Inoltre, la sonda di tensione deve essere nella membrana plasmaticaper essere efficace, che riduce la quantità di sonda disponibile ai cambiamenti relazione otticamente del potenziale di membrana. Di conseguenza, il numero di fotoni che può effettivamente arrivare al chip CCD è relativamente pochi. Ciò richiede la necessità di una alta velocità e fotocamera a basso rumore di lettura con alta efficienza quantica e una sonda che provoca un elevato SNR dalle variazioni del potenziale di membrana. Con l'imaging cellule in vitro, i ricercatori potranno comprendere meglio i potenziali benefici e le insidie di Gevis prima di tentare misure in vivo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| 60X objective lens (numerical aperture = 1.35) | Olympus | UPLSAPO 60XO | |
| Excitation filter | Semrock | FF02-472/30 | For voltage imaging of super ecliptic pHluorin in Bongwoori |
| Dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03-25x36 | |
| Emission filter | Semrock | FF01-497/LP | |
| 75W Xenon arc lamp | CAIRN | OptoSource Illuminator | LEDs and lasers are also effective light sources |
| Slow speed CCD camera | Hitachi | KP-D20BU | |
| Dual port camera adaptor | Olympus | U-DPCAD | |
| High speed CCD camera | RedShirtImaging, LLC | NeuroCCD-SM | |
| Image splitter | CAIRN | Optosplit 2 | |
| Excitation filter | Semrock | FF01-475/23-25 | For voltage imaging of FRET pair based GEVI consisting of Clover and mRuby2) |
| Dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03-25x36 | |
| Emission filter | Chroma | ET520/40 | |
| Dichroic mirror | Semrock | FF560-FDi01-25X36 | |
| Emission filter | Chroma | ET645/75 | |
| Vibration isolation system | Kinetic systems | 250BM-IC, 5702E-3036-31 | |
| Patching chamber | Warner instruments | RC-26G, 64-0235 | |
| #0 Micro Coverglass (22 x 40 mm) | Electron Microscopy Sciences | 72198-20 | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-344B | |
| #0 (0.08 ~ 0.13 mm) - 10 mm diameter glass coverslip | Ted Pella | 260366 | |
| Lipofection agent | Life Technologies | 11668-027 | |
| Calcium phosphate reagent | Clontech - Takara | 631312 | |
| Patch clamp amplifier | HEKA | EPC 10 USB amplifier | |
| Multi-channel data acquisition software | HEKA | Patchmaster | |
| Image acquisition and analysis software | RedShirtImaging | Neuroplex | |
| Spreadsheet application software | Microsoft | Microsoft Excel 2010 | |
| Data analysis software | OriginLab | OriginPro 8.6.0 | |
| Demagnifier | Qioptiq LINOS | Optem standard camera coupler 0.38x SC38 J clamp | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1R confocal microscope | |
| Anti-fade reagent | Life Technologies | P36930 |
References
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