Introduction
L'objectif principal de cet article est de démontrer l'imagerie optique de l'évolution des potentiels de membrane in vitro utilisant des protéines fluorescentes codées génétiquement. changements d'imagerie du potentiel de membrane offre la possibilité intéressante de l'étude de l'activité des circuits neuronaux. Lorsque des changements dans la membrane résultat potentiel à un changement d'intensité de fluorescence, chaque pixel de la caméra devient une électrode de substitution permettant des mesures non intrusives de l'activité neuronale. Depuis plus de quarante ans, des colorants sensibles à la tension organiques ont été utiles pour observer les changements de potentiel 1-4 membrane. Cependant, ces colorants manquent de spécificité cellulaire. En outre, certains types de cellules sont difficiles à teindre. indicateurs de tension génétiquement codés (GeViS) à surmonter ces limitations en ayant les cellules à étudier spécifiquement expriment la sonde fluorescente sensible à la tension.
Il existe trois classes de GeViS. La première classe de GEVI utilise la vodomaine de la phosphatase de détection de tension nsion détection soit avec une seule protéine fluorescente (FP) 5-9 ou un transfert d'énergie par résonance Förster (FRET) paire 10-12. La seconde catégorie de capteurs utilise microbienne rhodopsine comme un indicateur fluorescent directement ou par l'intermédiaire de 13 à 15 FRET électrochrome 16,17. La troisième classe utilise deux composantes, la composante génétique étant une membrane ancrée FP et un second composant étant une membrane lié trempe colorant 18-20. Tandis que les deuxième et troisième catégories sont utiles pour in vitro et trancher les expériences 19,20, seule la première classe de capteurs sont actuellement utile pour des analyses in vivo 6.
Dans ce rapport, nous allons démontrer l'imagerie du potentiel de membrane en utilisant la première classe de GeViS (Figure 1) in vitro. Cette première classe de capteurs de tension est le plus facile de faire la transition à l'imagerie in vivo. Depuis GeViS utilizing un domaine de détection de tension fusionné à un FP sont environ 50 fois plus brillante que la classe de rhodopsine de capteurs, ils peuvent être imagés en utilisant un éclairage à lampe à arc au lieu d'exiger un laser extrêmement puissant. Une autre conséquence de l'écart de brillance qui est la première classe de GeViS peut facilement dépasser l'auto-fluorescence du cerveau. Les sondes à base de rhodopsine ne peut pas. La troisième classe de capteur est tout aussi brillante que la première catégorie, mais nécessite l'ajout d'un extincteur chimique qui est difficile à administrer in vivo.
Nous allons donc démontrer l'acquisition d'une sonde avec une seule FP (Bongwoori) 8 et une sonde constituée d'une paire de FRET (Nabi 2) 12. Le FRET construit dans le présent rapport sont des versions de papillon de VSFP-CR (protéines fluorescentes sensibles à la tension - Clover-mRuby2) 11 consistant en un donneur fluorescente verte, Clover, et un accepteur de fluorescence rouge, mRuby2, nommé Nabi 2.242 et 2.244 Nabi 
Figure 1. Deux types d'indicateurs codés génétiquement tension (GeViS) imagés dans le présent rapport (A) A __gVirt_NP_NN_NNPS<__ FP mono GEVI base ayant un domaine de détection de tension trans-membrane et une protéine fluorescente. (B) Un GEVI base de FRET composé d'un domaine de détection de tension trans-membrane, un donneur de FRET et l'accepteur. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Protocol
déclaration éthique: Le protocole d'expérimentation animale a été approuvé par l'Institutional Animal Care et l'utilisation Comité à KIST protocole animale 2014-001.
1. Équipement Setup
- installation d'imagerie
- Placer un microscope à fluorescence inversée sur une table anti-vibrations. Utiliser un fort grossissement (60X lentille à immersion d'huile avec une ouverture numérique de 1,35) et une lentille d'objectif cube de filtre muni d'un miroir dichroïque et des filtres appropriés pour les protéines fluorescentes utilisées pour l'imagerie de tension.
Remarque: Cette configuration utilise un microscope inversé afin d'employer des objectifs avec NA plus élevé, mais les microscopes droits peut également être utilisé. En effet, le microscope inversé est seulement pour le développement de la sonde depuis l'ouverture numérique élevée (NA) objectif recueille plus de lumière que l'une avec un faible NA améliorant ainsi le rapport signal sur bruit (SNR; peut être décrit comme le signal optique pic divisé par le écart-type de la ligne de basefluorescence) de l'enregistrement. Pour les non-développeurs, nous recommandons un microscope droit pour des applications telles que la tranche ou dans des enregistrements in vivo. - Préparer une source de lumière, par exemple., Lampe à arc xénon, équipé d'un obturateur mécanique pour épifluorescence efficace imagerie à grand champ. Diriger la lumière vers le microscope par un guide de lumière monter. La lumière passe à travers le filtre d'excitation et est réfléchi par le premier miroir dichroïque dans le cube de filtre. Aligner la lumière pour éclairer l'échantillon de manière uniforme avec une intensité lumineuse maximisée sur le champ de vision 21.
Remarque: Traditionnellement, une lampe à arc de 75 watts a été utilisé depuis plus élevés des ampoules de puissance créent plus grande, mais pas les champs d'éclairement lumineux. Les lasers peuvent être utilisés, mais sont limités à une seule longueur d'onde. LED sont de plus en plus lumineux et peuvent en effet être la source de lumière de choix offrant de multiples longueurs d'onde et ne nécessitant pas un obturateur mécanique. - Monter les deux caméras CCD à la Déessrence microscope comme le montre la Figure 2D.
Remarque: La première caméra CCD a une résolution spatiale élevée et est utilisé pour l'identification d'une cellule exprimant le GEVI dans la membrane de plasma à tester. Pour les changements d'imagerie du potentiel de membrane, veiller à ce que la seconde caméra CCD a un taux de rafraîchissement élevé comme 1000 images par seconde (fps). Utiliser un adaptateur pour appareil photo à double accès (figure 2D (3)) pour passer la voie d'imagerie entre les deux caméras CCD. Dans cette configuration, un demagnifier est utilisé pour ajuster l'image à partir de l'objectif sur le capteur CCD dans la deuxième caméra CCD. - Installer un séparateur d'image entre le premier (lent) et deuxième (rapide) des caméras CCD pour l'imagerie de base GEVI FRET. Insérer un cube de filtre ayant un miroir dichroïque (560 nm) et deux filtres d'émission (520 nm / 645 nm et 40/75) dans l'image séparateur. Cela se traduira par deux champs de vue, l'une pour la fluorescence du donneur et l'autre représentant la fluorescence de l'accepteur. Retirer ce seuxième filtre cube lors de l'imagerie d'un GEVI avec un seul FP.
Remarque: La seule GEVI base FP testé cette méthode est Bongwoori qui utilise la FP, super écliptique pHluorin A227D (SE A227D). Le filtre d'excitation (472 nm / 30), un filtre d'émission (497 nm / temps de passage) et le miroir dichroïque (495 nm) ont été sélectionnés sur la base de son excitation et d'émission 5 spectres. En général, les filtres d'excitation et d'émission doivent avoir le plus grand chevauchement avec chaque spectre du fluorophore pour acquérir une image claire, tandis que les blocs de miroirs dichroïques toute la lumière d'excitation transmise à travers le filtre d'émission. Le choix de filtres et de miroirs dichroïques pour l'enregistrement sur la base de la paire de FRET GEVI 11 suit le même principe, sauf qu'elle nécessite un deuxième cube de filtre dans le diviseur d'image pour l'observation simultanée de donneur et l'accepteur de fluorescence. Le premier cube de filtre placé dans le boîtier de filtre à microscope a besoin d'avoir un filtre d'excitation (475 nm / 23) pour Clover. Ensuite, le émise fluorescence tant MF sera transmis au second cube de filtre à travers le premier miroir dichroïque (495 nm). Le deuxième cube de filtre comporte un miroir dichroïque (560 nm) et deux filtres d'émission (520 nm / 40 de trèfle et 645 nm / 75 pour mRuby2) pour chaque FP séparant ainsi la fluorescence à partir de deux points focaux différents.
- Placer un microscope à fluorescence inversée sur une table anti-vibrations. Utiliser un fort grossissement (60X lentille à immersion d'huile avec une ouverture numérique de 1,35) et une lentille d'objectif cube de filtre muni d'un miroir dichroïque et des filtres appropriés pour les protéines fluorescentes utilisées pour l'imagerie de tension.
| Simple GEVI base FP (Bongwoori) | FRET paire GEVI base (Nabi 2,42 et 2,44 Nabi) | ||
| Premier cube de filtre placé dans le microscope | filtre d'excitation | 472 nm / 30 | 475 nm / 23 |
| miroir dichroïque | 495 nm | 495 nm | |
| filtre d'émission | 497 nm / longue passe | - | |
| Deuxième cube de filtre placé dans le diviseur de faisceau | miroir dichroïque | - | |
| filtre d'émission 1 | - | 520 nm / 40 | |
| filtre d'émission 2 | - | 645 nm / 75 |
Tableau 1. Deux différents ensembles de filtre utilisé pour une GEVI FP base unique et une FRET à base de GEVI Recordings
- l'isolement de vibration
- Ne pas monter tout équipement avec le déplacement des composants sur la table de l'isolation des vibrations. Vérifiez que les câbles qui sont attachés à l'équipement non isolé sont lâches pour éviter les vibrations de l'échantillon.
- chambre de patch clamp
- Sceller le fond de la chambre de patch-clamp avec un mince # 0 couvercle verre depuis la distance de travail de l'objectif est relativement faible. Ceci est un inconvénient de la configuration de microscope inversé.
Remarque: Comme un compromis d'avoir une haute objectif NA, la distance de travail diminue. Afin de placer le SPECIMen deçà de la distance de travail très court, le verre de protection et de la lamelle (étape 2) besoin d'être aussi mince que possible.
- Sceller le fond de la chambre de patch-clamp avec un mince # 0 couvercle verre depuis la distance de travail de l'objectif est relativement faible. Ceci est un inconvénient de la configuration de microscope inversé.
- Contrôle de la température
- Assurez-vous que la solution de bain coule à travers un régulateur de température pour maintenir les cellules corrigées environ 33 o C pendant toute l'expérience.
- connexions d'équipement
- Raccordez l'amplificateur de patch-clamp et l'obturateur mécanique de la source lumineuse à la baïonnette Neill-Concelman (BNC) boîte de commande de la caméra CCD haute vitesse. Cela permettra au logiciel d'imagerie pour contrôler l'amplificateur, la caméra et la source de lumière simultanément.
Remarque: les composants électriques et d'imagerie doivent être synchronisées afin de fournir des enregistrements électriques et optiques simultanées de l'activité électrique.
- Raccordez l'amplificateur de patch-clamp et l'obturateur mécanique de la source lumineuse à la baïonnette Neill-Concelman (BNC) boîte de commande de la caméra CCD haute vitesse. Cela permettra au logiciel d'imagerie pour contrôler l'amplificateur, la caméra et la source de lumière simultanément.
Figure 2. ÉquipéInstallation ment pour l'imagerie de tension avec GeViS Le flux de travail suivant le chemin de lumière, (A) une lampe à arc 75W Xenon, (B) la lumière d'excitation de la lampe à arc est filtré par le filtre d'excitation et ensuite réfléchi par le premier miroir dichroïque avant de parvenir à la platine, un encart dans le coin supérieur droit montre la configuration cellule entière, (C) la caméra CCD de vitesse lente est utilisée pour aider à la fois le choix d'une pince de la cellule et le patch, (D) la partie d'acquisition d'image; (1) de la caméra CCD haute vitesse, (2) le séparateur de l'image à la fois paire de FRET et mono FP GeViS, (3) l'demagnifier pour adapter l'image sur le capteur CCD de la caméra CCD haute vitesse, (4) le double port adaptateur de caméra pour passer la voie d'imagerie et (5) la caméra CCD à vitesse lente à haute résolution spatiale pour l'identification de la cellule de patch, (E & F) l'acquisition d'image avec un GEVI base unique FP (E) et un GEVI base FRET(F). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
2. Expression de GeViS
- Dans rein embryonnaire humain 293 cellules
- La culture de rein embryonnaire humain 293 (HEK 293) avec les cellules du milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec du sérum de veau fœtal à 10% à 37 ° C dans un incubateur à CO2 (5% CO 2). Utilisez une boîte de culture de tissu avec 100 mm de diamètre et 20 mm de hauteur. Démarrer la culture avec 2 x 10 3 - 6 x 10 3 cellules / cm 2 et incuber jusqu'à ce qu'ils atteignent une confluence de 80 à 90% pour la transfection ultérieure.
- Le jour de la transfection, aspirer les milieux cellulaires et laver doucement une fois avec une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco. Disperser les cellules HEK 293 avec une solution de trypsine-EDTA 0,25% pendant 1-2 min, aspirer la solution et tapotez doucement le côté de la boîte de détacher le caunes. Ajouter DMEM frais (10% de FBS) et dissocier les cellules agglomérées par pipetage. Déterminer la concentration des cellules en utilisant un hémocytomètre.
- Placer 0,08 - 0,13 mm d'épaisseur, 10 mm de diamètre lamelles de pré-revêtue avec de la poly-L-lysine dans une plaque de culture tissulaire à 24 puits. Ensemencer les cellules HEK 293 sur des lamelles à 1 x 10 5 cellules / cm de densité cellulaire 2.
Remarque: Comme les cellules HEK 293 sont capables de former des jonctions lacunaires avec l'autre, le nombre des semences doit donner des cellules isolées. - Transfecter de manière transitoire des cellules avec une construction de gène codant pour une GEVI approprié en utilisant un réactif de lipofection en suivant les instructions du fabricant.
Remarque: Les constructions génétiques utilisées pour cette étape pcDNA3.1 utilisée (Bongwoori) et pUB2.1 (Nabi 2.242) en tant que vecteurs de squelette. La quantité d'ADN utilisée était de 100 ng de chaque lamelle; Toutefois, les conditions de transfection ont besoin d'être déterminée de manière empirique pour chaque GEVI à tester.
- Dans la hanche de la souris dissociéneurones primaires pocampal
- Disséquer hippocampes de jour embryonnaire 17 C57BL6 / N souris puis dissocier les neurones de l'hippocampe comme décrit précédemment 22,23.
- Plate neurones dissociés SUR DES poly-D-lysine revêtus 0,08-0,13 mm d'épaisseur, 10 lamelles mm de diamètre à 1 x 10 5 cellules / densité cellulaire ml. Incuber les cellules à 37 ° C dans l'incubateur CO2 (5% CO 2).
- Transfecter de manière transitoire des neurones dissociés à 6 - 7 jours in vitro (DIV) avec une construction de gène codant pour une GEVI en utilisant un réactif de transfection au phosphate de calcium comme décrit précédemment 24.
Remarque: Les constructions génétiques utilisées pour cette étape pcDNA3.1 utilisée (Bongwoori) et pUB2.1 (Nabi 2.244) en tant que vecteurs de squelette. La quantité d'ADN utilisée était de 1 pg pour chaque lamelle. Encore une fois, les conditions de transfection doivent être déterminées empiriquement pour chaque GEVI testé.
- Vérifier le niveau d'expression avant tension imaging
- Prendre la plaque de culture de tissu à partir du CO 2 incubateur et d'observer la fluorescence à partir des cellules transfectées dans un microscope à épifluorescence.
- Après confirmation de la fluorescence de la membrane, transférer la lamelle à la chambre patcher pour l'imagerie de tension dans la section 3.
Remarque: L'imagerie de tension est effectuée 16 à 24 heures après transfection. Cependant, comme différentes protéines fluorescentes ont différents temps de maturation, certains GeViS besoin de plus de temps en post transfection. Par exemple, les paires de FRET contenant mRuby2 dans ce protocole peuvent prendre plus de temps pour exprimer depuis la maturation des mRuby2 prend beaucoup plus de temps que Clover 11. La fluorescence du donneur et accepteur doit être vérifié.
3. Tension Protocole Imaging
- Choisissez une cellule saine avec une bonne expression membranaire
- En utilisant la microscopie, trouver une cellule saine (figure 4B) qui montre une fortemembrane fluorescence localisée par rapport à la fluorescence interne. Essayez de ne pas patcher cellules arrondies. cellules circulaires sont soit divisent ou mourants et sont difficiles à corriger. Appliquer une impulsion de test de 5,0 mV en ms amplitude et de 5,0 dans la durée pour aider ultérieures expériences de patch-clamp.
- Préparer la cellule pour l'imagerie de tension
- Après avoir choisi une cellule de patch, placez la pipette de patch-clamp dessus de la cellule. Apportez la pipette vers le bas jusqu'à ce qu'il touche la membrane cellulaire. À cette étape, observer 1 MQ - 2 MQ montée de la résistance de la membrane sur le logiciel de patch clamp 25.
NOTE: De temps en temps, un joint bonne giga-ohms peut se produire simplement en touchant la membrane cellulaire. Tant que le joint giga-ohms est stable, il devrait être OK. - Établir un joint giga-ohms en appuyant légèrement négative à travers la pipette. Réglez le potentiel de la pipette à un potentiel de maintien souhaitée.
- Tout en maintenant le sceau giga-ohms, l'image the cellule avec la caméra CCD à haute vitesse et de se concentrer à la surface de la membrane.
- Rompre la membrane cellulaire en appliquant des impulsions d'aspiration par la bouche ou de la seringue doucement pour effectuer une configuration cellule entière 26.
- Imager la pièce serrée cellule dans une configuration de serrage de l'ensemble de cellules en fonction de la conception expérimentale en utilisant un logiciel d'imagerie
- Démarrez le logiciel d'imagerie. Cliquez sur [Acquérir] - [SciMeasure Caméra] menu pour ouvrir la page 'CCD ACQUIRE'.
- Créer un nouveau fichier de données pour enregistrer les images.
- Cliquez sur [SORTIE ANALOGIQUE], puis [Lire ASCII] pour ouvrir un fichier de protocole d'impulsions de procéder à l'imagerie. Cliquez sur 'la moyenne des répétitions internes »si les données doivent être en moyenne. Puis fermez la page «Sortie analogique».
Remarque: Ce protocole d'impulsion doit être conçu et enregistré dans un fichier '.txt' selon le but de chaque expérience avant cette étape. - Réglez acquis spécifiqueparamètres de dé de la page «CCD ACQUIRE '. Saisissez les valeurs spécifiques pour 'Nombre de cadres pour l'acquisition »et« Nombre d'essais ».
Note: Le nombre de trames est déterminé par la vitesse de l'acquisition et le moment où le protocole d'impulsions. Par exemple, si l'imagerie à 1 kHz, 1.000 images est égal à 1 sec de temps d'enregistrement. - Cliquez sur [prendre des données (Optique + BNC)] pour lancer l'enregistrement. Alors que l'imagerie de tension est en cours, voir la fenêtre de l'oscilloscope à partir du logiciel de patch-clamp pour assurer configuration cellule entière stable tout au long de l'enregistrement.
Remarque: Pour tester gamme de tension sensible du GEVI, la taille du signal dans AF valeur / F ou résolution temporelle sur toute la plage de tension physiologique, mener ensemble une expérience de serrage de tension de cellule avec des impulsions de tension d'un protocole d'impulsions ayant intensifié allant de -170 mV à 130 mV. Pour déterminer la performance de l'GEVI dans la résolution des potentiels d'action évoqués de prima cultureneurones ry, l'image de la cellule dans une configuration de serrage courant de cellule entière.
- Après avoir choisi une cellule de patch, placez la pipette de patch-clamp dessus de la cellule. Apportez la pipette vers le bas jusqu'à ce qu'il touche la membrane cellulaire. À cette étape, observer 1 MQ - 2 MQ montée de la résistance de la membrane sur le logiciel de patch clamp 25.
4. Acquisition de données
- Calcul de AF / F
- Démarrez le logiciel d'imagerie. Cliquez sur [File] - [Fichier de données Lire] pour ouvrir un fichier de données à analyser. Observez l'image de la cellule dans son intensité repos Light (RLI) sur le côté droit
Remarque: Les moyennes de logiciels les 5 premières images pour déterminer RLI de l'enregistrement. - Cliquez sur «Afficher BNC» pour amener les valeurs de courant et de tension mesurées à l'écran.
- Changer le mode de «cadre RLI 'de la page de« soustraction de Frame' d'utiliser la fonction cadre de soustraction d'identifier pixels avec des signaux optiques sensibles. Telle est la véritable puissance de l'imagerie puisque chaque pixel peut être examiné pour des changements potentiels de fluorescence.
- Sélectionnez deux points dans le temps (F 0 et F 1) pour la soustraction. Identifier la zone de la cellule estmontrant des signaux sensibles à membrane changement potentiel.
Remarque: Le SNR pour les images cadre de soustraction peut être améliorée en sélectionnant plusieurs images pour chaque point de temps de la moyenne temporelle du signal. Le logiciel soustrait l'intensité lumineuse moyenne tirée des images sélectionnées et calcule les F 1 -F 0 valeurs (AF). Habituellement, on choisit un point acquis au point de potentiel et une autre fois maintenant pris au cours de la période de stimulation temps. - Désigner les pixels qui doivent être analysés en faisant glisser ou en cliquant sur chaque pixel avec la souris d'ordinateur. Observer la représentation graphique de l'intensité de fluorescence moyenne des pixels sélectionnés dans la partie gauche de la fenêtre de logiciel. Les figures 4B et 5B montrent des images représentatives de l'analyse cadre de soustraction.
- Diviser les pixels soustraits par le RLI (F 0). Cliquez sur [Diviser par RLI] pour acquérir des valeurs AF / F
- Démarrez le logiciel d'imagerie. Cliquez sur [File] - [Fichier de données Lire] pour ouvrir un fichier de données à analyser. Observez l'image de la cellule dans son intensité repos Light (RLI) sur le côté droit
- Exporter des données
- Retirer graphiques courant et de tension par décliquetage menu 'Show BNC de. Allez dans [SORTIE] - [Enregistrer Traces tel qu'il apparaît (ASCII)] pour exporter la trace de fluorescence dans un format de fichier ASCII pour la courbe d'analyse approprié par un logiciel graphique standard.
Analyse 5. Données
- Tension propriété détection du GEVI
- Dessinez le changement de fluorescence fonction de la tension graphique (FV) en reportant les valeurs AF / F fonction de la tension dans un programme d'analyse de données. Monter la courbe d'une fonction de Boltzmann (tableau 2) pour déterminer la plage de tension du signal optique en cliquant sur [Analyse] - [Appareillage] - [ajustement Sigmoidal] - [dialogue Ouvrir], puis choisissez la fonction Boltzmann.
Remarque: Montage d'une fonction rend possible de caractériser les propriétés de tension de détection de différentes sondes de tension et de comparer leurs performances dans des cellules différentes. La fonction Boltzmann peut être utilisé pour les sondes testées dans le présent document parce que les courbes de ces sondes FV montrent motif sigmoïde. - Normaliser chaque valeur AF / F en utilisant les valeurs initiales et finales (A 1 et A 2) calculé par la fonction.
Remarque: Dans l'équation de Boltzmann, le minimum est de 1 A et un maximum de A 2. Pour la normalisation, utiliser un logiciel de tableur pour ajuster les valeurs AF / F en définissant A 1 et A 2 zéro comme l'un. La moyenne des Af normalisée valeurs / F et calculer l'erreur-type pour l'analyse statistique. - Replot l'AF normalisée / valeurs de F par rapport à la tension tel que décrit précédemment dans la section 5.1.1).
- Dessinez le changement de fluorescence fonction de la tension graphique (FV) en reportant les valeurs AF / F fonction de la tension dans un programme d'analyse de données. Monter la courbe d'une fonction de Boltzmann (tableau 2) pour déterminer la plage de tension du signal optique en cliquant sur [Analyse] - [Appareillage] - [ajustement Sigmoidal] - [dialogue Ouvrir], puis choisissez la fonction Boltzmann.
- La vitesse de la réponse optique
- Ouvrez le fichier ASCII acquis de l'étape 4.2.2) avec une analyse de donnéesprogramme et tracer la trace AF / F en fonction du temps.
- Cliquez sur "sélecteur de données 'dans le logiciel d'analyse de données et de sélectionner un point de temps correspondant au début d'une impulsion de tension étagée et un second point lorsque le signal optique a atteint l'état d'équilibre du temps. Monter cette gamme à la fois une fonction de décroissance exponentielle simple et double en cliquant sur [Analyse] - [Appareillage] - [ajustement exponentiel] - [dialogue Ouvrir], puis choisissez une fonction de décroissance exponentielle. Signaler le meilleur ajustement.
Remarque: En ajustant les fonctions de décroissance exponentielle simple ou double, les constantes de temps quantifiés représentés par τ peuvent être acquises. Cela aidera expérimentateurs comparer la cinétique de leurs mesures effectuées avec différents indicateurs de tension. La trace de la fluorescence peut montrer des composants rapides et lents qui peuvent être décrits avec une double fonction exponentielle de décroissance. Dans ce cas, le calcul se traduira par deux constantes de temps avec des amplitudes différentes. - calculer ee constantes de T permet pondérée de comparer la cinétique de sondes présentant deux composantes temporelles à sondes avec un seul composant.
Remarque: Une tau pondérée est calculée comme la somme de τ 1, multipliée par l'amplitude relative, A 1, plus τ 2 multipliée par l'amplitude relative, A 2, tel que défini par la formule suivante;
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Representative Results
De manière transitoire des cellules transfectées peuvent présenter une variation significative de l'intensité de fluorescence et le degré d'expression de la membrane plasmique. Même sur le même lamelle certaines cellules auront divers niveaux de fluorescence interne. Ceci est probablement dû à la quantité d'agent de transfection absorbé par la cellule. Parfois, trop expression provoque la cellule de connaître la réponse de la protéine dépliée résultant de l'apoptose 27 (lumineux, cellules arrondies, avec fluorescence interne élevée). L'expérimentateur est donc averti de tester les deux cellules lumineuses et sombres cellules avec aussi peu de fluorescence interne que possible puisque l'expression interne crée une fluorescence non-réactif qui diminue le rapport signal sur bruit (SNR).
Une autre considération est la vitesse de maturation de chromophores. La figure 3 montre la disparité de la fluorescence de l'accepteur chromophminerai (mRuby2) qui a un temps de maturation plus longue que le chromophore donneur (trèfle).
Figure 3. Images confocale de cellules HEK 293 transfectées de façon transitoire avec un FRET à base de GEVI, Nabi2.242. (A) images confocale d'une cellule HEK montrant membrane fluorescence localisée de FRET donneur et accepteur, (B) images confocale montrant une conséquence potentielle de lente maturation des mRuby2. Les quatre cellules présentent Clover fluorescence alors que seulement deux présentent mRuby2 fluorescence. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Les images ont été acquises par un microscope confocal. Pour le donneur FRET, Clover, 488 nm laser a été utilisé pour l'excitation et l'émission a été CAPTured avec 525/50 nm filtre passe-bande. L'accepteur de FRET, mRuby2, a été illuminé avec 561 laser nm pour l'excitation et 595/50 nm filtre passe-bande a été utilisé pour l'émission. Les échantillons destinés à l'imagerie confocale ont été fixées avec du paraformaldehyde / solution à 4% de saccharose dans une solution saline tamponnée au phosphate ajusté à pH 7,4 et ensuite montées avec un réactif anti-fade.
Une fois que les conditions de transfection sont optimisées, la deuxième source de variation provient de la détermination de la région d'intérêt à analyser. Utilisation de soustraction d'une image afin d'identifier les régions de la cellule avec le changement de fluorescence plus élevé est souvent utilisé pour maximiser la valeur AF / F. Une alternative consiste à sélectionner tous les pixels recevant la lumière provenant de la cellule. Cela augmente le nombre de pixels résultant à la réduction du bruit, mais diminue la taille du signal de fluorescence depuis interne non réactive est comprise. Les deux méthodes sont très bien tant que l'expérimentateur reste cohérent.
Figure 4. imagerie de tension avec un seul FP Based GEVI Exprimédans des cellules HEK 293 et l'hippocampe neurones primaires. (A) AF / F de trace d'une seule base FP GEVI, Bongwoori, montrant des réponses aux impulsions de tension gradins enregistrées à 1 kHz avec une caméra CCD haute vitesse. (B) Un HEK 293 cellules imagé avec la caméra CCD à haute vitesse; (À gauche) de repos l'intensité lumineuse (RLI) d'une cellule exprimant (à droite) l'image de soustraction de trame indiquant les pixels où le changement de fluorescence a été observée Bongwoori &. (C) d'enregistrement optique de potentiels d'action induits de souris neurones primaires d'hippocampe exprimant Bongwoori. Les potentiels d'action ont été évoqués dans le mode de blocage de courant de la cellule entière. La trace AF / F a été sélectionné parmi les pixels en corrélation avec le soma. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Un représentant fluorescence lecture des chromophores donneur et accepteur est représenté sur la figure 5A. La polarité de la variation de fluorescence est à l'opposé du donneur et l'accepteur permettant une analyse ratiométrique pour réduire les sources de bruit corrélées, par exemple., Le mouvement. Par exemple, le bruit de la circulation corrélée présentera une variation de fluorescence dans le même sens à la fois pour le donneur et accepteur de fluorescence. Tandis que la sonde en fonction de FRET est capable d'imagerie ratiométrique, il est souvent préférable d'analyser seulement le chromophore lumineux. En effet, le chromophore gradateur peut augmenter considérablement le bruit de l'enregistrement. La figure 5B montre cet effet. La soustraction de trame sur la figure 5B du trèfle lumineux montre clairement où le signal optique est dans la cellule. En revanche, la soustraction d'image de fluorescence montre mRuby2 degrés plus élevés de bruit à travers la cellule. Par conséquent, seul le signal donneur de trèfle est exposée dans un neurone de l'hippocampe dans Fifigure 5C.
Figure 5. imagerie de tension avec un FRET à base de GEVI exprimé dans des cellules HEK 293 cellules de l'hippocampe et les neurones primaires (A). AF / F trace d'un FRET à base de GEVI, Nabi2.242, montrant des réponses à deux longueurs d'onde à impulsions de tension gradins enregistrées à 1 kHz avec une caméra CCD haute vitesse. (B) Haut; le donateur (Clover-RLI, Clover-cadre soustraction) et l'accepteur images traitées à deux seuils différents pour chaque FP, Bottom (mRuby2-RLI, mRuby2-cadre de soustraction); le même seuil a été utilisé à la fois pour les donateurs (Clover-RLI, Clover-cadre soustraction) et l'accepteur images (mRuby2-RLI, mRuby2-cadre soustraction) pour illustrer l'obscurité relative de mRuby2. Toutes les images ont été prises de la même HEK 293 cellule exprimant Nabi2.242. (C) La longueur d'onde de 520 nm tras de potentiels d'action induits par un hippocampe neurone principal de la souris exprimant capteur Nabi2.244. La trace AF / F a été sélectionné parmi les pixels en corrélation avec le soma. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. Conséquences de différents niveaux de lumière pour AF et AF / F valeurs. (A) une image d'un HEK 293 cellule exprimant une seule base FP GEVI, Bongwoori, présentés dans l'intensité de repos Light (RLI), (B) les traces de fluorescence montrant noyau moyenne AF (F x -F 0) les valeurs de trois régions différentes, région 1: région membrane avec signal de fluorescence bien localisée, la région 2: une région avec fluorescence interne lumineux, und région 3: région éloignée de signal optique, (C) les traces de fluorescence montrant noyau moyenne des valeurs AF / F à partir des mêmes régions en (B). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| concepts | équations | Remarque |
| changement de fluorescence fractionnée (AF / F) |  | F 1 = intensité lumineuse mesurée à un point de temps, F 0 = intensité de la lumière mesurée à potentiel de maintien |
| fonction Boltzmann |  | y = AF / F, V = potentiel de membrane en mV, V 2.1 est le potentiel de membrane en mV à la moitié du maximum AF / F, A |
| fonction de décroissance exponentielle Double | y = y 0 + A 1 e - (t - t 0) / τ 1 + A 2 e - (t - t 0) / τ 2 | T pour 1, τ 2 = des constantes de temps, A 1, A 2 = amplitudes, t, t = 0 deux points dans le temps, y = 0 compensés |
Tableau 2. Equations
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Discussion
Le système nerveux utilise une tension de plusieurs manières différentes, l'inhibition entraîne une légère hyperpolarisation, entrée synaptique provoque une légère dépolarisation et une action résultats potentiels d'une variation relativement importante de tension. La capacité de mesurer les changements dans le potentiel de membrane par GeViS offre le potentiel prometteur de l'analyse de plusieurs composants de circuits neuronaux simultanément. Dans ce rapport, nous démontrons une méthode fondamentale pour les changements d'imagerie dans le potentiel de membrane en utilisant GeViS.
Une clé principale pour les modifications de la tension d'imagerie est l'expression efficace du GEVI dans la membrane plasmique. l'expression intracellulaire crée une fluorescence non-réactif qui réduit le SNR de la sonde. L'optimisation des conditions de transfection améliore grandement la cohérence des mesures optiques. En effet, lors de l'essai d'un roman GEVI il est conseillé de tester également une sonde connue pour assurer que les différences dans l'activité optique sont entièrement due à la NEsonde w et non pas les conditions des cellules.
La figure 6 montre l'effet de la fluorescence interne pour diminuer la sensibilité de l'imagerie de tension, la valeur AF / F. La figure 6B montre AF valeurs d'une cellule HEK exprimant le GEVI à base mono-FP, Bongwoori. Trace 2 vient de la région 2 (de couleur bleue) où la fluorescence interne relativement brillant est visible dans la figure 6A. Cette trace a le niveau de la valeur AF comme trace 1. similaires Cependant, sur la figure 6C où les traces de la figure 6B ont été divisés par les valeurs RLI pour les valeurs AF / F, la trace 2 gouttes de manière significative en raison de la fluorescence interne lumineux qui diminue AF / F valeurs. Fluorescence trace 3 a une très petite AF mais elle a aussi une valeur très faible RLI (F). Il en résulte un / signal AF F trompeuse qui a une augmentation importante du bruit de l'enregistrement. Cet exemple a été inclus pour démontrer l'AF est égalementimportant. Un grand changement dans AF / F est pas utile si F est très faible au départ.
L'utilisation d'un séparateur d'images permet la mesure simultanée de deux longueurs d'onde sur une caméra CCD unique. Cela facilite grandement la mesure des changements fluorescents dépendantes FRET pour le développement de la sonde et réduit le coût de l'installation. Cependant, en raison de l'aberration chromatique, ces deux images seront légèrement floue nécessitant la nécessité d'un objectif apochromatique. Le plus de lumière mieux SNR, afin de choisir les objectifs avec l'ouverture numérique la plus élevée améliore également l'imagerie de fluorescence. En outre, on peut utiliser des sources lumineuses solides tels que des diodes électroluminescentes (LED) ou laser pour augmenter SNR. LED ne nécessite pas d'obturateur mécanique.
Dans ce rapport, nous montrons les signaux optiques provenant d'un seul FP GEVI et un GEVI base FRET. Le principal avantage d'un GEVI basé FRET est que l'imagerie ratiométrique permet de réduire le bruit corrélé due à la respiration et la circulation sanguine in vivo. La polarité opposée des signaux fluorescents confirme un véritable changement dans le potentiel de membrane. Cependant, étant donné que les intensités de fluorescence des deux chromophores varient souvent de manière significative, le RSB varie également. Cette confond l'analyse ratiométrique et limite son utilité 28. Il peut aussi être un signal de FRET indépendant 29. Il est donc parfois préférable d'utiliser uniquement le chromophore brillant fluorescent lors de l'utilisation FRET pour analyser les changements du potentiel de membrane.
imagerie de tension est plus difficile que l'imagerie de calcium en raison de la vitesse et de la variabilité des changements dans le potentiel de membrane par rapport à l'imagerie de calcium qui mesure le flux de calcium. La membrane changements potentiels dans des échelles de temps très rapides par rapport au flux d'ions de calcium, et les événements subliminales dans les neurones ne peuvent pas être mesurés avec l'imagerie calcique 30. En outre, la sonde de tension doit être dans la membrane plasmiquepour être efficace ce qui réduit la quantité de sonde à la disposition de rapport optiquement changements dans le potentiel de membrane. Par conséquent, le nombre de photons que l'on fait arriver à la puce CCD est relativement faible. Cela exige la nécessité d'une grande vitesse et à faible caméra lecture du bruit avec un rendement quantique élevé et une sonde qui suscite une grande SNR sur des modifications du potentiel de membrane. Par imagerie des cellules in vitro, les chercheurs de mieux comprendre les avantages potentiels et les pièges de GeViS avant de tenter des mesures in vivo.
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Disclosures
Les auteurs ont rien à révéler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| 60X objective lens (numerical aperture = 1.35) | Olympus | UPLSAPO 60XO | |
| Excitation filter | Semrock | FF02-472/30 | For voltage imaging of super ecliptic pHluorin in Bongwoori |
| Dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03-25x36 | |
| Emission filter | Semrock | FF01-497/LP | |
| 75W Xenon arc lamp | CAIRN | OptoSource Illuminator | LEDs and lasers are also effective light sources |
| Slow speed CCD camera | Hitachi | KP-D20BU | |
| Dual port camera adaptor | Olympus | U-DPCAD | |
| High speed CCD camera | RedShirtImaging, LLC | NeuroCCD-SM | |
| Image splitter | CAIRN | Optosplit 2 | |
| Excitation filter | Semrock | FF01-475/23-25 | For voltage imaging of FRET pair based GEVI consisting of Clover and mRuby2) |
| Dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03-25x36 | |
| Emission filter | Chroma | ET520/40 | |
| Dichroic mirror | Semrock | FF560-FDi01-25X36 | |
| Emission filter | Chroma | ET645/75 | |
| Vibration isolation system | Kinetic systems | 250BM-IC, 5702E-3036-31 | |
| Patching chamber | Warner instruments | RC-26G, 64-0235 | |
| #0 Micro Coverglass (22 x 40 mm) | Electron Microscopy Sciences | 72198-20 | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-344B | |
| #0 (0.08 ~ 0.13 mm) - 10 mm diameter glass coverslip | Ted Pella | 260366 | |
| Lipofection agent | Life Technologies | 11668-027 | |
| Calcium phosphate reagent | Clontech - Takara | 631312 | |
| Patch clamp amplifier | HEKA | EPC 10 USB amplifier | |
| Multi-channel data acquisition software | HEKA | Patchmaster | |
| Image acquisition and analysis software | RedShirtImaging | Neuroplex | |
| Spreadsheet application software | Microsoft | Microsoft Excel 2010 | |
| Data analysis software | OriginLab | OriginPro 8.6.0 | |
| Demagnifier | Qioptiq LINOS | Optem standard camera coupler 0.38x SC38 J clamp | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1R confocal microscope | |
| Anti-fade reagent | Life Technologies | P36930 |
References
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