Imaging membranpotential med två typer av genetiskt kodade fluorescerande Spänningssensorer
Summary
A method for imaging changes in membrane potential using genetically encoded voltage indicators is described.
Abstract
Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate goal is to image neuronal activity in vivo, one must be able to image activity of a single cell to ensure successful in vivo preparations. This procedure will describe how to image membrane potential in a single cell to provide a foundation to eventually image in vivo. Here we describe methods for imaging GEVIs consisting of a voltage-sensing domain fused to either a single fluorescent protein (FP) or two fluorescent proteins capable of Förster resonance energy transfer (FRET) in vitro. Using an image splitter enables the projection of images created by two different wavelengths onto the same charge-coupled device (CCD) camera simultaneously. The image splitter positions a second filter cube in the light path. This second filter cube consists of a dichroic and two emission filters to separate the donor and acceptor fluorescent wavelengths depending on the FPs of the GEVI. This setup enables the simultaneous recording of both the acceptor and donor fluorescent partners while the membrane potential is manipulated via whole cell patch clamp configuration. When using a GEVI consisting of a single FP, the second filter cube can be removed allowing the mirrors in the image splitter to project a single image onto the CCD camera.
Introduction
Den centrala uppgiften i denna uppsats är att visa optisk avbildning av förändringar i membranpotentialer in vitro med hjälp av genetiskt kodade fluorescerande proteiner. Imaging förändringar i membranpotential erbjuder spännande möjligheter att studera aktiviteten hos neuronala kretsar. När förändringar i membranpotential resulterar i en fluorescensintensitet förändring, varje pixel i kameran blir ett surrogat elektrod möjliggör nonintrusive mätningar av nervaktivitet. För över fyrtio år, har organiska spänningskänsliga färgämnen varit till nytta för att observera förändringar i membranpotential 1-4. Men dessa färgämnen saknar cellulär specificitet. Dessutom är vissa celltyper är svåra att färga. Genetiskt kodade spänningsindikatorer (GEVIs) övervinna dessa begränsningar genom att ha de celler som skall studeras specifikt uttrycka det fluorescerande spänningskänsliga sonden.
Det finns tre klasser av GEVIs. Den första klassen av GEVI använder voltage Kännande domän från den spänningskännande fosfatas med antingen en enda fluorescerande protein (FP) 5-9 eller ett Förster resonansenergiöverföring (FRET) -par 10-12. Den andra klassen av sensorer använder mikrobiell rhodopsin som en fluorescerande indikator direkt 13-15 eller via elektro FRET 16,17. Den tredje klassen utnyttjar två komponenter, den genetiska komponenten är ett membran förankrad FP och en andra komponent som är en membranbundna härd färgämne 18-20. Medan de andra och tredje klasserna är användbara för in vitro och skiva experiment 19,20, bara den första klassen av sensorer finns för närvarande användbara för in vivo-analyser 6.
I denna rapport kommer vi att visa avbildning av membranpotentialen med hjälp av den första klassen av GEVIs (Figur 1) in vitro. Denna första klass av spänningssensorer är det enklaste att övergången till in vivo imaging. Eftersom GEVIs utilizing en spänningskännande domän fusionerad till en FP är ca 50-faldigt ljusare än rhodopsin klass av sensorer, de kan avbildas med båglampa belysning snarare än att kräva en extremt kraftfull laser. En annan konsekvens av skillnaden i ljusstyrka är att den första klassen av GEVIs lätt kan överstiga auto-fluorescens av hjärnan. De rhodopsin-baserade prober kan inte. Den tredje klassen av sensor är lika ljus som den första klassen, men kräver tillsats av en kemisk quencher som är svår att administrera in vivo.
Vi kommer därför att visa att förvärvet av en sond med en enda FP (Bongwoori) 8 och en sond bestående av ett FRET par (Nabi 2) 12. FRET-konstruktioner i denna rapport är fjärils versioner av VSFP-CR (spänningskänsliga fluorescerande proteiner – Clover-mRuby2) 11 bestående av ett grönt fluorescerande givare, klöver, och en röd fluorescerande acceptor, mRuby2, som heter Nabi 2,242 och Nabi 2,244 <supp> 12. I inledningen till dessa typer av inspelningar bör ge forskare en bättre förståelse för vilken typ av information GEVIs kan ge.
Figur 1. Två typer av genetiskt kodade spänningsindikatorer (GEVIs) avbildas i denna rapport (A) En mono FP baserad GEVI har en transmembranspänningskännande domän och ett fluorescerande protein. (B) En FRET baserad GEVI består av en transmembranspänningskännande domän, en FRET donator och acceptor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nervsystemet använder spänning på flera olika sätt, orsakar inhibering en liten hyperpolarisation orsakar synaptiska mata in en liten depolarisation och en aktionspotential resulterar i en relativt stor spänningsändring. Förmågan att mäta ändringar i membranpotential genom GEVIs erbjuder lovande potential analysera flera komponenter av neuronala kretsar samtidigt. I denna rapport visar vi en grundläggande metod för avbildning förändringar i membranpotentialen med hjälp av GEVIs.
<p class="jove_content…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the World Class Institute (WCI) program of the National Research Foundation of Korea funded by Ministry of Education, Science, and Technology of Korea Grant WCI 2009-003 and Korea Institute of Science and Technology Institutional Program Project 2E24210. Sungmoo Lee was supported by Global Ph.D. Fellowship program (NRF-2013H1A2A1033344) of the National Research Foundation (NRF) under the Ministry of Education (MOE, Korea).
Materials
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| 60X objective lens (numerical aperture = 1.35) | Olympus | UPLSAPO 60XO | |
| Excitation filter | Semrock | FF02-472/30 | For voltage imaging of super ecliptic pHluorin in Bongwoori |
| Dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03-25×36 | |
| Emission filter | Semrock | FF01-497/LP | |
| 75W Xenon arc lamp | CAIRN | OptoSource Illuminator | LEDs and lasers are also effective light sources |
| Slow speed CCD camera | Hitachi | KP-D20BU | |
| Dual port camera adaptor | Olympus | U-DPCAD | |
| High speed CCD camera | RedShirtImaging, LLC | NeuroCCD-SM | |
| Image splitter | CAIRN | Optosplit 2 | |
| Excitation filter | Semrock | FF01-475/23-25 | For voltage imaging of FRET pair based GEVI consisting of Clover and mRuby2) |
| Dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03-25×36 | |
| Emission filter | Chroma | ET520/40 | |
| Dichroic mirror | Semrock | FF560-FDi01-25X36 | |
| Emission filter | Chroma | ET645/75 | |
| Vibration isolation system | Kinetic systems | 250BM-IC, 5702E-3036-31 | |
| Patching chamber | Warner instruments | RC-26G, 64-0235 | |
| #0 Micro Coverglass (22x40mm) | Electron Microscopy Sciences | 72198-20 | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-344B | |
| #0 (0.08~0.13mm) – 10mm diameter glass coverslip | Ted Pella | 260366 | |
| Lipofection agent | Life Technologies | 11668-027 | |
| Calcium phosphate reagent | Clontech – Takara | 631312 | |
| Patch clamp amplifier | HEKA | EPC 10 USB amplifier | |
| Multi-channel data acquisition software | HEKA | Patchmaster | |
| Image acquisition and analysis software | RedShirtImaging | Neuroplex | |
| Spreadsheet application software | Microsoft | Microsoft Excel 2010 | |
| Data analysis software | OriginLab | OriginPro 8.6.0 | |
| Demagnifier | Qioptiq LINOS | Optem standard camera coupler 0.38x SC38 J clamp | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1R confocal microscope | |
| Anti-fade reagent | Life Technologies | P36930 |
References
- Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system. Nature. 246, 508-509 (1973).
- Cohen, L. B., et al. Changes in axon fluorescence during activity: molecular probes of membrane potential. J. Membrane Biol. 19, 1-36 (1974).
- Tasaki, I., Warashina, A. Dye-membrane interaction and its changes during nerve excitation. Photochem Photobiol. 24, 191-207 (1976).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nat Rev Neurosci. 5, 874-885 (2004).
- Jin, L., Han, Z., Platisa, J., Wooltorton, J. R., Cohen, L. B., Pieribone, V. A. Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescent protein voltage probe. Neuron. 75, 779-785 (2012).
- Cao, G., Platisa, J., Pieribone, V. A., Raccuglia, D., Kunst, M., Nitabach, M. N. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 154, 904-913 (2013).
- St-Pierre, F., Marshall, J. D., Yang, Y., Gong, Y., Schnitzer, M. J., Lin, M. Z. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nat Neurosci. 17, 884-889 (2014).
- Piao, H. H., Rajakumar, D., Kang, B. E., Kim, E. H., Baker, B. J. Combinatorial mutagenesis of the voltage-sensing domain enables the optical resolution of action potentials firing at 60 Hz by a genetically encoded fluorescent sensor of membrane potential. J Neurosci. 35, 372-385 (2015).
- Jung, A., Garcia, J. E., Kim, E., Yoon, B. J., Baker, B. J. Linker length and fusion site composition improve the optical signal of genetically encoded fluorescent voltage sensors. Neurophoton. 2, 021012 (2015).
- Dimitrov, D., et al. Engineering and characterization of an enhanced fluorescent protein voltage sensor. PLoS One. 2, e440 (2007).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9, 1005-1012 (2012).
- Sung, U., et al. Developing fast fluorescent protein voltage sensors by optimizing FRET interactions. PLoS One. 10, e0141585 (2015).
- Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., Maclaurin, D., Cohen, A. E. Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin. Nat Methods. 9, 90-95 (2012).
- Flytzanis, N. C., et al. Archaerhodopsin variants with enhanced voltage-sensitive fluorescence in mammalian and Caenorhabditis elegans neurons. Nat Commun. 5, 4894 (2014).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nat Methods. 11, 825-833 (2014).
- Gong, Y., Wagner, M. J., Zhong Li, J., Schnitzer, M. J. Imaging neural spiking in brain tissue using FRET-opsin protein voltage sensors. Nat Commun. 5, 3674 (2014).
- Zou, P., et al. Bright and fast multicoloured voltage reporters via electrochromic FRET. Nat Commun. 5, 4625 (2014).
- Chanda, B., Blunck, R., Faria, L. C., Schweizer, F. E., Mody, I., Bezanilla, F. A hybrid approach to measuring electrical activity in genetically specified neurons. Nat Neurosci. 8, 1619-1626 (2005).
- Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice. J Neurophysiol. 108, 3147-3160 (2012).
- Weigel, S., Flisikowska, T., Schnieke, A., Luksch, H. Hybrid voltage sensor imaging of eGFP-F expressing neurons in chicken midbrain slices. J Neurosci Methods. 233, 28-33 (2014).
- Waters, J. C., Sluder, G., Wolf, D. E. Live-Cell Fluorescence Imaging. Methods in Cell Biology Volume 81. , 115-140 (2007).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
- Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat Protoc. 1, 695-700 (2006).
- Molleman, A. . Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , 101-102 (2003).
- Osorio, N., Delmas, P. Patch clamp recording from enteric neurons in situ. Nat Protoc. 6, 15-27 (2010).
- Schroder, M., Kaufman, R. J. The mammalian unfolded protein response. Annu Rev Biochem. 74, 739-789 (2005).
- Wilt, B. A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. Photon shot noise limits on optical detection of neuronal spikes and estimation of spike timing. Biophys J. 104, 51-62 (2013).
- Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Knopfel, T. Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements. PLoS One. 3, e2514 (2008).
- Peterka, D. S., Takahashi, H., Yuste, R. Imaging voltage in neurons. Neuron. 69, 9-21 (2011).
