Summary
脳室周囲結節性異 (PNH) は、成人期の皮質発達 (MCD) の奇形の最も一般的な形式が、その遺伝的基盤はほとんど散発的ケースで不明のまま。我々 は最近 MCDs の新しい候補者の遺伝子を識別するために、直接の原因となる役割の生体を確認するための戦略を開発しました。
Abstract
大脳皮質を含む先天性欠損症-脳開発 (MCD) の奇形として知られている-小児期に知的障害と薬剤抵抗性てんかんの 20-40% を占める重要な原因が考えられます。高解像度脳は体内MCD 表現型の大規模なグループの同定を促進しています。脳イメージング、ゲノム解析と動物モデルの世代の進歩にもかかわらず、候補者の遺伝子を体系的に優先して推定される突然変異の機能効果をテストするための簡単なワークフローがありません。この問題を克服するために MCD の新規原因遺伝子の同定を可能に実験的戦略の開発し、検証します。この戦略を識別候補ゲノム領域またはアレイ CGH または全エキソーム配列し、その不活性化または過剰発現で子宮経由で齧歯動物の頭脳の開発の特定の突然変異の効果を特徴付けるを介して遺伝子に基づくエレクトロポレーション。このアプローチは、脳室周囲結節性異所、故障ニューロンの移動によって引き起こされる MCD の病態の推定の小胞タンパク質のC6orf70遺伝子の同定につながった。
Introduction
大脳皮質は、認知・知的過程で重要な役割を果たしているし、感情のコントロールと同様、学習と記憶に関与しています。それ、多くの神経疾患、精神疾患が皮質の開発 (MCD) の奇形に起因驚くべきことではないです。両方取得以来 MCD の病因は複雑で、遺伝的要因が関与しています。MCD の割合が遺伝的に決定の累積的な有病率は約 2%、彼らはほとんどの場合散発的。例えば、先天性脳形成不全の発生率は、人口の 1% 以上推定された、すべててんかん患者の 14% を超えると重症または難治性てんかんの1,の 40%、MCD のいくつかの形態が観察されます。2。
脳室周囲結節性異所 (PNH) の 1 つ最も一般的な MCDs 大脳皮質へ (VZ) の心室の地帯からニューロンの異常な移動によって引き起こされます。通常磁気共鳴イメージ投射 (MRI) を使用して可視化したことが側脳室の壁に沿って異所性ニューロンのクラスターの結果を移行するニューロンの障害。PNH の臨床的、解剖学的および画像の機能は、異機種混在。結節は、両側性、対称性に小さく、片側から及ぶかもしれない。一般的な臨床的後遺症、てんかん、知的障害3があります。二国間 PNH の X-リンクされて連れの 100%、散発的な患者3,4の 26%、Xq28 のマップ、フィラミン A (またはFLNA) の遺伝子の変異が発見されました。Pnh 20q13 にマップ、 ARFGEF2遺伝子の変異によって引き起こされるまれな、劣性フォームは、2 つの近親家族5で報告されています。最近、遺伝子DCHS1とFAT4受容体リガンド カドヘリン ペアでシュミレーション変異は PNH6を含む全身性疾患によって影響を受ける 9 人の患者で同定されています。PNH に関連付けられてされている脆弱 X 症候群7、ウィリアムズ症候群8、22q11 重複症候群9、5 p 1510重複、1 p 3611、5q14.3 q1512、6 p 2513 での削除と 6q ターミナル削除症候群14,15,16,17,18,19, 追加の原因遺伝子が散在していることを示唆しています。全体ゲノム。ただし、散発的な PNH 患者の約 74% の遺伝の基礎は明らか17に残ります。
古典的な遺伝子マッピングに近づくような配列比較 Genomic の交配 (アレイ CGH) サブ顕微鏡による染色体異常、ただし、このアプローチを使用して特定ゲノム領域の検出のための強力なツールであると証明頻繁に大きいし、多数の遺伝子が含まれています。
大量並列シーケンス技術 (すなわち全エキソーム配列 (ウェス) で全ゲノム シーケンス (WGS)) の出現はコストと全体の人間エキソームまたはゲノムをシーケンス処理に必要な時間の両方大幅に削減しています。それにもかかわらず、ウェス WGS データの解釈はデータのフィルタ リングから各患者数十数百 (または解析のタイプに応じて、数千も) に亜種が出てくるため以来ほとんどの場合、挑戦的なままです。
アレイ CGH を組み合わせて新たな体系的な戦略、MCD の新規原因遺伝子を特定するプロセスをスピードアップするには、候補者の遺伝子のウェスと子宮内のエレクトロポレーション (IUE) スクリーニングに設計されました。井植は特定の遺伝子または齧歯動物の頭脳の変異を選択的に不活性化 (またはノザン) 内因18,19の関与の迅速な評価を有効にすることができます。RNAi によるノックダウンまたは 1 つまたは複数の候補遺伝子の過剰発現は、遺伝子が病気の開発、神経細胞移動や成熟のローカライズされた欠陥に関連付けられているときに発生する予定です。不活化 (または過剰発現) が再現齧歯動物の患者にみられる表現型遺伝子の同定、時に MCD 散発的な患者のスクリーニングのための優秀な人材になります。このアプローチを使用すると、最近明らかにC6orf70遺伝子 ( ERMARDとして知られている) の重要な貢献きょくひ 6q27 染色体欠失16患者の PNH の発症。
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Protocol
倫理ステートメント: Wistar 系ラットを交配、維持され、INMED の動物施設には、欧州連合とフランスの立法に一致しています。
1. DNA の抽出およびアレイ CGH とウェスの定量化
- 自動化された DNA 分離ロボットまたは製造元のプロトコルによると市販の手動 DNA 抽出キットを使用している患者からひと白血球から DNA (gDNA) を抽出します。分光光度計を使用してすべてのサンプルを定量化します。
2. 配列 CGH のプロトコル
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GDNA の制限の消化力
- 患者と 37 ° C で 2 時間の市販の人間管理つくっと AluI DNA から精製された gDNA のダブル ダイジェスト 500 ng各反作用のため 0.5 μ 10 U/μ L の酵素を使用します。酵素を不活性化し、氷にサンプル チューブを移動する 65 ° C で 20 分間インキュベートします。
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サンプル ラベル
- 各反作用の管を (例えば5 1 パック、2 パック、4 本パックのマイクロ アレイのための μ l) 使用中のマイクロ アレイ フォーマットに必要なランダムなプライマーの適切な量を追加します。上下に軽くピペッティングでよく混ぜます。
- サンプル チューブをサーマルサイクラーに転送します。95 ° C、3 分で、その後 4 ° C、5 分間インキュベートします。
- 準備 1 の 3 および 1 つのシアニン シアニン 5 次のボリュームを混合することによって氷の上のマスター ミックスのラベル: 10.0 μ l 5 X 反作用バッファー、5.0 μ l 10 x dNTPs、3.0 μ l シアニン 3 dUTP またはシアニン 5 dUTP 1.0 μ l エキソ (-) Klenow 酵素ヌクレアーゼ フリー水 2.0 μ l。使用しているマイクロ アレイ フォーマットに従って各試薬の量を選択します。
- GDNA を含む各反応チューブにラベル マスター ミックスを追加します。上下に軽くピペッティングでよく混ぜます。
- サンプル チューブをサーマルサイクラーに転送し、37 ° C 2 時間、65 ° C で 10 分間インキュベートし、4 ° C でサンプルを維持
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ラベル付けされた gDNA の精製
- 各反応管に 1 x テ (pH 8.0) の 430 μ l を追加します。
- 2 mL 採血管に精製カラムを配置し、適切な列にラベルを付けます。浄化列にそれぞれラベル付けされた gDNA をロードします。
- 室温で遠心で 14,000 x g で 10 分間遠心します。フロー ・ スルーを破棄し、2 ml のコレクションの管に戻って列を配置します。
- 1 x te (pH 8.0) 480 μ L を各列に追加します。室温で遠心で 14,000 x g で 10 分間遠心します。流れを破棄します。
- 新鮮な 2 mL 管と精製サンプルを収集するために室温で遠心機で 1,000 × g で 1 分間遠心に列を反転します。
- サンプル ボリュームを使用コンセントレーターを使用してまたは 1 x テ (pH 8.0) を追加することで、マイクロ アレイ フォーマットの要求にもたらします。たとえば、1 パック マイクロ アレイは 80.5 μ L にボリュームをもたらす 5 分の氷のサンプルをインキュベートし、ピペットの上下に 10 回ソリューション。
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ラベル付けされた gDNA の交配のための準備
- RNase フリーでは新鮮な 1.5 mL チューブの適切なシアニン 5 ラベル サンプル、シアニン 3 ラベル サンプルを使用してテストおよびリファレンスのサンプルを組み合わせます。たとえば、1 パック マイクロ アレイは、最終巻には 158 μ L。 使用中マイクロ アレイ フォーマットに従って各サンプルのボリュームを選択します。
- 分光光度計を使用して、収量、A260 nm (DNA)、A550 nm (シアニン 3) と A650 nm (シアニン 5) で吸光度を測定することによって特定またはラベルの活性度を測定します。
- 数式を使用して利回りを計算: [サンプル ボリューム (μ l) x concentration(ng/µl) DNA]/1,000 (ng/μ g)。計算式を使用して特定のアクティビティ: pmol gDNA の μ l あたり色素/μ g μ l あたり。
注: たとえば、入力 DNA の 0.5 μ g、収穫する必要があります 8 に 11 μ g、シアニン 3 ラベル サンプル、シアニン 5 ラベル サンプルの 35 に 20 の特定のアクティビティ (pmol/μ g) は 25 に 40 をする必要があります。
- 数式を使用して利回りを計算: [サンプル ボリューム (μ l) x concentration(ng/µl) DNA]/1,000 (ng/μ g)。計算式を使用して特定のアクティビティ: pmol gDNA の μ l あたり色素/μ g μ l あたり。
- 交配マスター ミックス使用でマイクロ アレイ フォーマットに必要な量を準備するには、次の試薬を混ぜる: 50 μ L ベッド 1 DNA (1.0 mg/ml)、aCGH 遮断剤と 260 μ l 2 x 52 μ 10 x HI RPM 交配バッファー。
- 使用中のマイクロ アレイ フォーマットに必要な容量を取得するラベル付けされた gDNA を含む RNase フリー 1.5 ml チューブに交配マスター ミックスの適切な量を追加します。たとえば、1 パック マイクロ アレイ 362 μ l を各反作用のための最終的なボリュームにあることを確認します。
- 上下、ピペッティングによりサンプルをミックス、14,000 × g で遠心分離し、すぐに 95 ° c、30 分の 37 ° C で 3 分間インキュベートします。
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チャンバー アセンブリおよび交配
- ガスケット ラベルに上向きとチャンバー ベースの長方形断面配置とチャンバー ベースにクリーン ケット スライドをロードします。ガスケット スライド チャンバー ベースと同じ高さ、半開きではないことを確認します。
- ガスケットだけでなく、サンプルが均一に分散されるかどうかを確かめるに交配サンプル混合物を塗布します。
- サンドイッチ ペアが正しく整列されている評価するガスケット スライド上にマイクロ アレイ スライドを置きます。その後、反応室に挟まスライド上にカバーを置くと手締めクランプを組み立てます。
- スライド組み立て室を垂直方向に回転させることによりぬれ性を確保します。泡が商工会議所に存在しないことを確認します。必要に応じて、固定泡を移動するハード面でアセンブリをタップします。
- 20 rpm で回転するように設定回転ラックの組み立てられたスライド室を置きます。ハイブリダイゼーション チャンバを入れてオーブンと使用中のマイクロ アレイ フォーマットによると 24 時間または 40 時間の 65 ° C で交配を実行します。
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マイクロ アレイの洗浄およびスキャン
- オーブンから取り出し交配商工会議所、洗浄バッファー 1 の水没します。その分解に進みます。
- マイクロ アレイ スライドを削除し、すぐに部屋の温度で洗浄バッファー 1 のスライド ラックに入れてください。
- (ノミを使用して、磁気攪拌) をかき混ぜながら 5 分の配列のスライドを洗います。ないあまりにも積極的な混合しますが、良いを取得する 4 (中速) の設定に攪拌速度を調整します。
- 90 s 攪拌洗浄バッファー 2 の配列のスライドを洗います。(それは乾燥が登場) バッファーからスライドをゆっくり回復し、スライド プロテクターの援助でスライド ホルダーに読み込みます。
- アレイ スキャナーにスライドを読み込み、配列の製造元の指示に従ってスキャンを実行します。
- 製造元の指示 (V.9.1.3.1) に従って使用中のスキャナーに付属の解凍ソフトを使用して結果を分析します。
3. ウェス プロトコル
- ターゲットの濃縮
- DsDNA BR アッセイを使用すると、計測器プロトコルに従って gDNA サンプルの濃度を決定します。
- 1 x 1.5 mL 低バインドが 50 μ L の総ボリュームで管内低 TE バッファーで高品質の二重鎖 DNA の 5 μ g を希釈します。
- 超音波発生装置を設定し、製造元の指示に従って読み込みとアンロード駅に、チューブを入れます。チューブにキャップをしてください。
- ゆっくりと気泡を導入することがなく事前分割隔壁を通して 50 μ l の DNA サンプルを転送します。
- 超音波発生装置の製造元から示唆された設定によると DNA をせん断し、製造元の指示に従ってバイオアナライザーを用いた品質を評価します。ターゲット DNA のフラグメント サイズは 150 に 200 bp。
- DNA の修復が終了します。
- 最後修理オリゴ ミックスの 10 μ L で終わり修復酵素ミックス 40 μ L を混合することによって最後の修復反応混合物を準備します。ボルテックス ミキサーでよく混ぜます。
- サーマルサイクラーに 30 分の 20 の ° c のサンプルをインキュベートし、4 ° C でそれらを押し温水のふたを使用しないでください。
- 3.2.1 各 50 μ L のステップで準備終わり修復反応混合物を 50 μ l 添加せん断も DNA のサンプルを追加します。よく上下にピペッティングすることによって穏やかなボルテックスをミックスします。
- メーカー プロトコルに従って基づいてビーズ精製キットのサンプルを浄化します。
- 3' 端の起こる。
- DA テーリング マスター ミックスの 20 μ l を各エンド修理、浄化された DNA サンプル (約 20 μ L) に追加します。
- よく上下にピペッティングすることによって穏やかなボルテックスをミックスします。
- サーマルサイクラーに 37 ° C でサンプルをインキュベートし、4 ° C でそれを押し温水のふたを使用しないでください。
- 前キャプチャ インデックスのアダプターの ligation。
- 結紮マスター ミックスの 5 μ L を各 A 尾の DNA サンプルに追加します。
- 適切なキャプチャ前のインデックス ソリューションの 5 μ L を各サンプルに追加します。
- 井戸を密封し、5 s の簡潔に遠心分離機サンプルのボルテックス混和します。
- 熱 cycler で 15 分間の 20 の ° c のサンプルをインキュベートし、4 ° C で押し温水のふたを使用しないでください。
- メーカー プロトコルに従って基づいてビーズ精製キットのサンプルを浄化します。
- インデックス付きのライブラリの増幅。
- プライマー ミックスの 1 μ L と PCR マスター ミックスの 25 μ L を混合することによってキャプチャ前の PCR の反作用の組合せの適切なボリュームを準備します。ボルテックス ミキサーでよく混ぜます。
- 26 μ L の PCR プレートの別の井戸で増幅混合物と各インデックス付き gDNA ライブラリ サンプルの 24 μ L を組み合わせます。
- PCR プログラム次の手順を実行: 30 98 ° C で 2 分の 98 ° C、5 サイクル s、60 ° C、30 秒、1 分、72 ° C で 10 分間で最終的な拡張のための 72 ° C は 4 ° C でサンプルを保持
- メーカー プロトコルに従って基づいてビーズ精製キットのサンプルを浄化します。
- メーカー プロトコルに従ってバイオアナライザーの品質を評価します。
- 交配のためのインデックス付きの DNA サンプルのプール
- 各キャプチャ反応プールに対して PCR プレートのウェル 1 個で各インデックス付き gDNA ライブラリのサンプルの適切なボリュームを組み合わせます。たとえば、人間またはマウス全エクソン キャプチャ ライブラリは、187.5 を使用してプールあたり 8 ライブラリを組み合わせて各インデックスのライブラリの ng。最終的なキャプチャ反応プールごとに 1,500 が含まれていることを確保するインデックス付き gDNA の ng。
- 同様に各ボリュームを減らす < 7 μ L 真空濃縮を使用しています。完全に、試料の乾燥は避けてください。
- 井戸の底で液体を収集するために遠心分離、またはミニ プレート スピナーで米遠心分離機 30 は積極的に gDNA を含むプレート 7 μ L と渦にも大詰めを持って各集中 gDNA プールに十分なヌクレアーゼ フリー水を追加します。
- GDNA をキャプチャ ライブラリ ライブラリ プールの交配
- 各インデックス 7 μ L gDNA プール ブロック ミックスの 9 μ l を追加します。上下のピペットをミックスします。
- 井戸キャップ、転送、サーマルサイクラーに gDNA を含むシール プレート、95 ° c、5 分間インキュベートし、65 ° c. でそれを保持プレートが少なくとも 5 分の 65 ° C で開催されることを確認します。
- キャプチャ ライブラリのサイズに基づいて RNase ブロックの適切な希釈を準備 (< 3.0 Mb、25% 希釈ライブラリ > ライブラリの 10% 希釈液 3.0 Mb)。
- キャプチャ ライブラリのサイズに従ってキャプチャ ライブラリの適切な量を組み合わせて、氷で保たれる PCR プレートに RNase ブロック ソリューションを希釈します。ピペッティングでよく混ぜます。キャプチャ ライブラリの < ライブラリの使用 2 μ l、5 μ L の 10% 希釈液で RNase ブロックの 3.0 Mb。キャプチャ ライブラリ > 3.0 Mb、ライブラリの使用 5 μ l と 25% 希釈液で RNase ブロックの 2 μ l。
- キャプチャ ライブラリ/RNase ブロック ミックスの 7 μ L を含む各ウェルに交配バッファーの 37 μ L を追加します。ピペッティングでよく混ぜるし、簡単にミックスを含むプレートを遠心します。
- マルチ チャンネル ピペットを使用してステップ 3.7.5 gDNA プール プレートの各サンプルからキャプチャ ライブラリ混合物の全体の 44 μ L を転送しながら 65 ° c gDNA プール プレートを維持します。ゆっくりと上下に 8 〜 10 倍ピペッティングでよく混ぜます。
- ドーム型ストリップ キャップと井戸を封印します。すべての井戸が完全に密封されていることを確認します。熱 cycler で PCR プレートに圧縮マットを置きます。
- 65 ° C で 24 h の交配混合物を孵化させなさい注: サンプル 72 h までのハイブリッドがありますが、拡張の交配がサンプル井戸の豊富な蒸発を引き起こさないことを確認する必要があります。
- ストレプトアビジン コートした磁気ビーズの作製
- 洗浄バッファー 2 水お風呂または熱ブロック 65 ° c を prewarm します。
- 渦のミキサーにストレプトアビジン磁気ビーズを積極的に再懸濁します。磁気ビーズは、貯蔵中に解決します。
- 各交配サンプルの PCR プレートのウェルに再懸濁のビーズの 50 μ L を追加します。
- ビーズを洗浄し、バッファーのバインドの 200 μ L でそれらを再懸濁します。
- ストレプトアビジン ビーズを用いたハイブリッド DNA をキャプチャします。
- 推定し、24 時間培養後に残るハイブリダイゼーション溶液の量を記録します。
- 65 ° C で交配プレートを維持し、洗浄ストレプトアビジン ビーズの 200 μ L を含む、プレートに各交配混合物のボリューム全体 (約 60 μ L) を転送するマルチ チャンネル ピペットを使用します。上下に 3 〜 5 回ゆっくりとピペッティングでよく混ぜます。
- 井戸キャップ、Nutator ミキサーまたは室温で 30 分に相当するキャプチャ プレートを孵化させなさい。井戸に正しくサンプルを混合していることを確認します。
- 簡単に遠心分離、またはミニ プレート スピナーのキャプチャ プレートを遠心分離機します。
- マグネットセパレーター、懸濁液からビーズを収集するためにキャプチャ皿を置きます。削除し、上澄みを廃棄します。
- 洗浄バッファー 1 の 200 μ L でビーズを再懸濁します。ビーズは完全に再停止されるまで上下にピペッティングで混ぜます。
- 遠心分離、またはミニ プレート スピンで簡単に遠心します。
- 磁選機に皿を置きます。
- オフにし、削除し、上澄みを廃棄ソリューションを待ちます。
- 後多重シーケンスの処理のサンプルをキャプチャします。
- 次を混合することによって PCR 反応混合物の適切なボリュームを準備: 9 μ L ヌクレアーゼ フリー水、25 μ L マスター ミックスと 1 μ L プライマー ミックスの拡大数による。ボルテックス ミキサーでよく混ぜ、氷の上を保ちます。
- 各増幅反応 PCR プレートの井戸の中 35 μ L のステップ 3.10.1 から PCR 反応混合物を配置します。
- 上下にビーズ懸濁液が均質であることを確認するビード区切キャプチャ ライブラリ プール サンプルのそれぞれをピペットします。
- 適切な PCR 反応混合物に各キャプチャされたライブラリのプール ビーズ懸濁液の 15 μ L を追加します。ピペッティング ビーズ懸濁液が均質になるまで徹底的にミックスします。
- 準備ポイント 3.10.2 サーマルサイクラーにプレートを置き、次の PCR 増幅プログラムを実行: 30 98 ° C で 8 に 11 サイクル 2 分の 98 ° C s、60 ° C 30 秒と 1 分の 72 ° C、72 ° C 10 分で最後の拡張が続きます。4 ° C でサンプルを保持します。
- メーカー プロトコルに従ってビーズによる精製とサンプルを浄化します。
- メーカー プロトコルに従ってバイオアナライザーの品質を評価します。
- 多重シーケンスのサンプルを準備します。
メモ: 最終的な濃縮サンプルには、8 または 16 インデックス ライブラリ、ライブラリのキャプチャ サイズに基づいて、プールの方法前のキャプチャのプールが含まれています。単一シーケンス レーンで多重がインデックス付きのライブラリの合計数は、キャプチャ ライブラリに必要なシーケンス データの量と、使用しているプラットフォームの出力仕様によって決まります。- プラットフォームの能力に応じて各レーン、組み合わせることのできるインデックス数を計算します。単一シーケンス レーンで多重がインデックス付きのライブラリの合計数は、キャプチャ ライブラリに必要なシーケンス データの量と、使用しているプラットフォームの出力仕様によって決まります。たとえば、人間のすべてのエクソン v5 ライブラリのインデックス作成、ライブラリごとのシーケンス データの推奨は 4 Gb、キャプチャ前プールあたり推奨シーケンス データは 32 Gb (8 インデックス プール)。
- ライブラリをシーケンスします。
- 選択の次世代シーケンシングのプラットフォームのライブラリをロードし、装置の仕様に従って実行シーケンスを実行します。
- エキソーム配列データを分析します。
- パイプラインと基本の通話に最適なソフトウェアを実行します。たとえば、マップの読み取り20ピカード (http://broadinstitute.github.io/picard/) と重複を除去し、カモノハシ21(オクターリピート) 塩基の欠失や挿入一塩基多型に Stampy を使用します。同義の亜種とアレル頻度で観察されたものをフィルター < 5%、 de novoの亜種を識別するために親の exomes からのそれらと比較データ。
4. 子宮内エレクトロポレーションのプラスミド DNA の準備
- コーディング シーケンスまたは 3' UTR22を前述のように、候補遺伝子のいくつかの短いヘアピン Rna (Shrna) を設計します。
- ターゲットから外れているように効果は標準的な方法を使用してデータベースに対する BLAST 検索で Shrna 特異性をテストします。Shrna 他ラットの遺伝子と相補性の 50% 以上の表示を除外します。
- として mU6 pro ベクターにクローン焼鈍オリゴヌクレオチドは前述23。
- プラスミド DNA を製造元の指示に従ってマキシ準備を浄化し、3 μ g/μ L の最終濃度を確認します。
- DNA (0.5 mg/ml pCAGGS-GFP いずれか単独で、または 1.5 mg/ml shRNA の構築) の 20 μ l 分注高速 2 μ L を追加し、緑の染料 (2 mg/mL) 注入のビジュアル監視を許可します。
5.子宮内エレクトロポレーション
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手術の手順
- E15.5 妊娠雌ラット (E0 は精子正膣にプラグを確認の日として定義された)、ケタミン ・ キシラジンの混合物との組み合わせを使用しての麻酔 (0.1 から 0.01 mg 体ごと重量、それぞれ)、腹腔内で与えられる注射麻酔導入。
- 動物はつま先ピンチ反射の消失を観察することによって完全に麻酔したことを確認します。
- 動物の下腹部の毛を削除する、クリッパーを使用してひげをそる。ポビドン ヨード、70% アルコールのスクラブを使用して皮膚を消毒します。麻酔中の乾燥を防ぐため目に獣医軟膏を適用します。
- 熱源に動物を置き、切開部位の上 (真ん中に 4-5 cm 開いているウィンドウ) で滅菌ドレープを置きます。マスクをつけた、白衣、キャップ、滅菌手術用手袋を着用します。手術が終了するまでには、無菌性を維持します。
- 尾鰭の腹部の正中線に沿って皮膚の縦切開 (2 〜 2.5 cm) を確認し、皮膚の下に筋肉壁の切開に鋭いはさみを使用して-2.5 cm のも、正中線に沿って。
- 腹腔内から 1 つの子宮角を慎重に公開します。胚に潤いを与える 37 ° C に予め温めておいた生理食塩をドロップします。子宮の潤いを保つすべての時間。
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DNA とエレクトロポレーションの注入
- 優しく環状鉗子で子宮の角の 1 つを保持し、慎重に 1 つの胚を子宮壁にプッシュします。胚 1 つの手と他の手挿入慎重に正中線から 1 mm のガラス管を左側の側脳室 (2-3 mm) に押しながら注射を使用しての視覚監視を許可する高速グリーンが付いている DNA の約 1 μ L を注入、マイクロインジェクターです。
- 3 × 7 mm2の電極表面に生理食塩水をドロップします。右心室に注入された側 (左側側脳室) 滅菌正極と負極滅菌を配置します。フィート制御ペダル (4000 の mF コンデンサーを遺伝子導入装置で 40 V まで充電) と、950 ms 間隔で 5 の電気パルスを提供します。
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エレクトロポレーション手順を掲示して
- 腹腔内に子宮角を戻すより自然に配置され胚を許可し、術中体液の損失を考慮する共振器に生理食塩水の滴を追加します。
- 簡単な中断のステッチを使用して皮膚の吸収性の縫合と腹部の筋肉壁を閉じます。
- ケージにラットを入れ、それが麻酔から出現するまで動物を監視します。
- 疼痛管理のため管理ブプレノルフィン (0.03 mg/kg) 動物に皮下注射 48 時間までのすべての 8-12 h。
6. 脳サンプル準備
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固定法
- 妊娠ラットを犠牲にガス麻酔 (イソフルラン) クイック頚部転位続いてを使用して手術後 5 日目。
- 腹腔内を再度開く縦切開を確認します。
- 子宮角を公開、胚を子宮から削除し、それらの首をはねる鋭いはさみを使用しています。
- 脳の組織に与えるダメージを最小限を削除: 鋭いはさみを使用して、後方 (小脳) に沿って小切開/皮膚とピンセットのペアを使用して、頭蓋骨に穴を開けるための頭部の前部 (香調電球) 軸が公開する頭蓋骨をはがす、脳し、小さなヘラを使用してそれを削除します。
- 一晩で 4 ° C 4% の脳を浸す 1 リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) x パラホルムアルデヒド。
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脳の断面
- 10 分の 1 × PBS で脳を洗います。
- プラスチック金型を埋め込み 4% 寒天に脳を埋め込みます。
- 50 mL の 1x PBS で 4% 寒天に備える 5 胚の脳を埋め込みします。その溶解アガロースを 50 ° C 以上で確実します。
- 4 ° C で 1 時間、少なくとも重合する agarose の脳を保つ脳の周り余分な agarose を削除します。
- 脳の前方/後方軸は刃に垂直の指向、vibratome ベース プレートに脳を接着します。乾燥し接着脳板 vibratome チャンバーに接着剤のために数分を待ちます。
- 1x PBS で、vibratome を入力します。100 μ m 厚いセクションをスライスします。
- 脳切片をスライドに転送、余分な液体を削除、メディアをマウントを数滴を追加、観察を重ねて脳
7. 共焦点イメージングと定量解析
- 一晩前にイメージング取付中辛口をしましょう。レーザー走査型共焦点顕微鏡の 10 X イメージ部分。
- 定量的画像解析ソフトウェアを使用して、8 ビット、1 つ代表的な GFP 蛍光細胞で画像を変換し、手動でその形状を定義します。「見積もり書」をクリックし、フリーハンド選択ツールを使用して、セルの境界線を描画します。この直径の方法とセルの輝度しきい値はソフトウェアによって自動的に保持されます。
- 「セルを検索」をクリックして transfected セル皮質全体をローカライズするためのソフトウェアを許可します。その後、必要な場合、誤検知を手動で削除します。
- 大脳皮質の厚さ全体を個々 のセクションで正規化された興味の 8 つの区域に分割します。これを達成する「地域ツール」をクリックして、場所 8「地域ストライプ」を選択 (1) 最初と最後 (8) ストライプ VZ と CP の上部をそれぞれ対応します。全体野 GFP transfected セルの相対位置をカウントするソフトウェアを許可する「適用」をクリックします。最後に、分析のための Excel ファイルのデータをエクスポートするのには「保存数量化」をクリックします。
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Representative Results
MCD の新規原因遺伝子を識別するために設計された実験的戦略の要約の図 1で。
発達脳異常常 PNH (図 2 a)、脳梁形成不全、colpocephaly、小脳形成不全、てんかんに関連付けられている polymicrogyria を組み合わせることで 155 人の患者のコホートにおけるアレイ CGH を実行することにより運動失調と認知障害患者 12 例 (図 2 b)21で共有 6q27 の 1.2 Mb の最小重要な削除を同定しました。ゲノム領域を含む 4 つの知られていた遺伝子 (THBS2、 PHF10、 TCTE3 、 DLL1) と 2 つの予測遺伝子 (WDR27およびC6orf70) (図 2 b)。
並行してアレイ CGH、ウェス分析 14 分離二国間 PNH 患者でないコピー数変化の分析を行った、 de novo変異を有する一人の患者を識別する (c.752T > a: pIle250Asn) 予測C6orf70遺伝子 (Genbank の受入番号 NM_018341.1) (図 3)。
C6orf70で識別される突然変異が PNH の原因となる役割を持っていたし、6q27 のマッピング、その他の遺伝子のハプロ不全によりが表現型に影響を及ぼすかもしれないかどうか調べるには、そのロール生体内神経移行に探検されたことを確認ラット大脳皮質神経前駆細胞での発現を沈黙させる子宮内でRNAi によるノックダウン アプローチ23,24を使用してください。発展途上ラット大脳皮質、 PHF10、 C6orf70 DLL1、発現する遺伝子だけを調べた (図 4 a)。これらの 3 つの遺伝子のコード配列をターゲット別の短いヘアピン Rna (Shrna) が生成されました。Shrna に導入されたラット大脳皮質 neuroprogenitors子宮内電気穿孔法による胚 (E15) 15 日目で上位皮質層にコミット ニューロンが生成されます。緑色蛍光タンパク質トランスフェクション記者として使用されました。GFP 陽性細胞の相対的な分布を調べたエレクトロポレーション後 5 日。Dll1とPhf10のノックダウンは橈骨神経移行 (データは示されていない) のわずかな遅延の結果C6orf70のノックダウンは神経細胞移動障害し、異所性結節の発展に高い上昇を与えたに対し連想させるFlnaノックダウン モデル (図 4 b)24で観察。逆に、効果がないC6orf70の不一致 shRNA の transfections には神経移行 (図 4 b) 上の明らかな影響はなかった。
図 1:小説 MCD 原因遺伝子同定を識別するためのワークフロー。新規疾患責任遺伝子を識別するために使用できるさまざまな方法の模式図。ボックスは本稿で説明した方法で黄色を表す色。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:6q27 削除 PNH と脳発達の異常が発生します。(A) 患者 2。T2-の重量を量ったコロナ (左側のパネル) と PNH 展開島皮質下左側頭葉 (白と黒の矢印) の壁のライニングを示す T1 体重軸 (右側のパネル) セクション。(B) 患者 11。T1 強調冠状断面、一時的な角 (白い矢印) の壁に沿って両側異所性結節を示します。(C) 患者 12。T2-の重量を量った冠状断面。左、PNH はまだ目に見える (黒い矢印) と心室は拡張され。PNH におけるアレイ CGH (上の部分) を使用して識別される 6q27 領域の削除の模式図 (D)。水平、破線ラインを表す削除患者で同定されました。サイズ最小重要な削除領域はまた示される、4 つの知られていた遺伝子が含まれています: THBS2、 PHF10、 TCTE3 、 DLL1と 2 つの予測遺伝子: WDR27とC6orf70 (上の部分)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:結果のシーケンスします。( ) T2 強調、c.752T を運ぶ患者 (白い矢印) の正面の角に二国間の PNH を示す軸断面 > C6orf70 の突然変異。示すシーケンス (B) サンガー ウェスで識別される突然変異・ デ ・ ノボが発生しました。突然変異の位置は黒矢印で示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4:6q27 最小限の重要な領域と C6orf70 ノックダウンにローカライズされて遺伝子の発現解析を変更皮質ニューロンの放射状移動します。(A) 定量的 RT-PCR ラット大脳皮質における 6q27 の重要な地域に含まれている遺伝子の発現を示します。サイクロフィリン A は、正規化に使用されました。(B) 代表的な新皮質コロナ セクション E20 ラット脳どちらかの緑色蛍光タンパク質とエレクトロポレーション後 5 日だけで (コントロール) を構築または shRNA コード配列 (C6orf70-shCDS) C6orf70をターゲットと組み合わせるまたは相対的な効果の不一致 (C6orf70 shCDSmm) を構築します。Flnaノックダウン (FLNA-shCDS) は、障害の神経細胞移動の制御として使用されました。C6orf70 shCDS または FLNA shCDS で子宮内でエレクトロポレーション (VZ) (白い矢印) の心室のゾーン内での GFP 陽性細胞の逮捕を誘発、一方、単独で、または不一致との組み合わせで GFP を発現している細胞を構築には影響しなかった神経細胞の移動。スケール バー = 200 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
MCDs は、知的障害と薬剤抵抗性小児てんかん1,2の 20-40% を占める重要な原因です。MCDs に関心は、2 つの主要な要因の結果として過去 10 年間大幅に増加しています。最初は改善脳画像 (特に MRI)、医者および科学者以前に認められなかった多くの脳奇形を視覚化するをできます。他の多くの小説 MCD 原因遺伝子の同定を許可している遺伝的ツールの進化です。これは、脳の発達や機能の根底にある、およびより正確な遺伝カウンセリングについてのメカニズムの知識を大幅に改善が。
過去には、研究者に重点を置いて彼らの努力原因遺伝子の同定、脳開発後の段階での役割を明らかにする機能アッセイのデザインを残してします。これはまれで、再発性の遺伝性疾患の研究から見つける方法は従順ではない伝統的な遺伝子のより一般的な散発的な障害への進行のためにより困難になっています。多くの場合原因遺伝子を識別する現在のアプローチは、多数の遺伝子 (アレイ CGH) または (ウェス WGS) を検証するは難しいである候補者の遺伝子の数のいくつかの変種を含むゲノムの比較的大きな領域の識別を可能します。
アレイ CGH とウェス (または WG) のアプローチは、多くの遺伝的疾患の突然変異スペクトルを広げています。それにもかかわらず、いくつかの重要な制限はまだ残っています。たとえば、アレイ CGH は高品質 DNA を必要し、平衡転座や単一の遺伝子の 1 つまたはいくつかのエクソンを含む小さな削除/重複を識別するために失敗します。この問題を克服するためにアレイ CGH は従来のプローブ間隔 (例えば1 M アレイ CGH キットを使用して) より高い解像度で実行する、SNP アレイ解析に置き換えられます。ウェスはしばしば大規模な遺伝子内領域をカバーしない、深いイントロンの突然変異を識別するために失敗します。さらに、時々 報道かもしれない (特に場合モザイクの割合が低いと変異) 原因となる突然変異を識別するためには低すぎます。ウェスのもう一つの重要なステップは、データの解析とフィルタ リングがかなりの努力を必要です。ウェスの適用範囲を広げて、単一の実験で患者数を削減可能性があります。 または異なるキャプチャ キットを同時に使用することがあります。
井植は神経細胞移動の遺伝子ノックダウンの影響を分析する最も適切なアプローチです。ただし、他の手順が大脳皮質の発達、神経など神経細胞の成熟に関する研究はいくつかの技術的な制限によって妨げられます。確かに、井植は、E13 はしばしば成功した後の段階での調査は、このプロシージャに関連付けられている産後の致死率が高いによって制限されているに対し前に実行されます。さらに、遺伝子ノックダウン効率はかなり表現型多様性につながる electroporated 胚の間で異なる場合があります。
全体的にみて、現在のプロトコルには、4 つの主要な重要なステップがあります。本稿で説明したプロトコルの一部ではない、考慮する最初の基本的なステップがこのような研究に登録する患者の選択であることを指摘するあります。確かに、新規の MCD の遺伝子を識別するプロセスでは、誰のため表現型はできるだけ均一にする必要があります患者のコホートにおける臨床的および画像の調査が必要です。高均一表現型患者を収集すると、ある特定の遺伝子の原因変異を識別できる可能性が大きくなります。ただし、最小を成功を達成するためにそのような研究の登録患者数は大きく異なる遺伝子の変異率に依存するため、予測するは難しい。たとえば、 FLNAX-リンクされている二国間 PNH の家族性症例の 100%、26% の散発的な患者に変異するなど遺伝子の遺伝子の多重衝突を識別するために必要な患者数が比較的低い可能性があります。逆に、低い突然変異率で遺伝子のために上映されると患者数は高いです。たとえば、 C6orf70の場合 64 患者をスクリーニング時にのみ単一の原因となる突然変異を識別することができました (ウェスと従来のサンガーを通じて 50 14 シーケンス)16、約 1.5% のこの遺伝子の突然変異率を推定します。2 番目の重要なステップ新規原因遺伝子を特定するためにすべての知られている MCD 遺伝子の突然変異の排除であります。次世代シーケンシング技術の出現により、知られており、候補者の遺伝子の突然変異スクリーニングが今単一の実験で行われます。ただし、偽陽性を実験的に確認して、潜在的な原因となる突然変異を除外するの過剰な数の存在を避けるために適切な変形フィルターを使用ください。確かに、候補遺伝子/亜種の数はウェスの実験で特に高いです。ある特定の遺伝子の関与が疑われる場合、変異のスクリーニングは MLPA による microdeletions または microduplications を除外する補完もする必要があります。3 番目の重要な点は、染色体再配列がブレークポイントの場所によって強く影響を受けているという事実です。このコンテキストでの中断またはシス要素削除/複製に含まれていない遺伝子の遠位の変位の最大の可能な範囲を除外する価値があります。最後に、RNAi 実験生体内では、原因遺伝子が胚段階で神経細胞移動の直接役割を担うことを想定しています。PNH を含む MCD の病因は異機種混在し、子宮内でアプローチの神経細胞の増殖や細胞生存を含む発達のステップに関与する遺伝子の影響を検出する失敗します。さらに、現地生産の影響または人間の脳より顕著なる可能性があります特定の候補者の遺伝子の過剰発現齧歯動物の頭脳の低複雑さのマスクでした。
新しい MCD の原因遺伝子の同定のための新しい診断ツールを開発するゲノミクス及び生体内での機能研究の統合が役立つと考えています。この戦略は、ところによって制限されている実験モデルと限定的なアクセスの欠如脳組織に影響を受ける患者の治療上のターゲットをテストし、MCD、病態生理を理解して新しいの動物モデルを提供することも。MCD に関連付けられている分子経路を解読する疾患も提供します生理学的な脳の発達についての貴重な新しい一般的な。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
我々 は感謝博士 G. マクギリブレー広報・ j ・ クレイトン-スミス、広報 w. b. ドビンズ、広報 P. Striano 広報すなわちシェファー、広報 s. p. ロバーストン広報 s. f. Berkovic MCD 患者を提供するため。技術アドバイスやヘルプ、博士・ f ・ ミシェルと + メイに感謝します。この作品は、EU の 7 つのフレームワーク ・ プログラムからの資金によって支えられた欲望プロジェクト、契約番号: 健康-f2 キー-602531-2013 (仮想、r. g. にアリフール、空軍、シー ・ シー ・)、(アリフールと c. c.) に向かわせる、財団ジェローム ・ ルジューン (A.F、E.P.P、c.c-製品 R13083AA) と地方プロヴァンス アルプ ・ コート ・ ダジュール (APO2014 - c. c. と A.A.D に DEMOTIC)。D.A.K は、エンボ若い調査官に支えられて FWF 付与 (I914 および P24367)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corp | P/N 051-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Fast green allow visual monitoring of the injection |
| BTX ECM 830 electroporator | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 | The ECM 830 is a Square Wave Pulse generator designed for in vitro and in vivo applications |
| Microtome HM 650 V | Microm | 10076838 | Microtome HM 650 V vibratome 240V 50/60Hz with vibrating blade |
| FluoView 300 | Olympus | The Olympus FluoViewTM 300 is a point-scanning, point-detection, confocal laser scanning microscope designed for biology research application | |
| eCELLence software | Glance Vision Technologies | eCELLence is software designed for the quantitive analysis of cell migration | |
| Agilent Microarray Scanner Bundle | Array slides | ||
| for 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K or 8 x 15K | Agilent | Agilent p/n G4900DA, G2565CA or G2565BA | |
| for 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K or 8 x 60K | Agilent | Agilent p/n G4900DA or G2565CA | |
| Hybridization Chamber, stainless | Agilent | Agilent p/n G2534A | Chamber for array CGH hybridization |
| Hybridization Chamber gasket slides, 5-pack | Gasket for array CGH hybridization | ||
| for 1-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60003 | |
| for 2-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60002 | |
| for 4-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60011 | |
| for 8-pack microarrays | Agilent | Agilent p/n G2534-60014 | |
| Hybridization oven | Agilent | Agilent p/n G2545A | |
| Hybridization oven rotator for Agilent Microarray Hybridization Chambers | Agilent | Agilent p/n G2530-60029 | |
| Thermal cycler with heated lid | Agilent | Agilent p/n G8800A or equivalent | Termal cycler for incubations |
| 1.5 mL RNase-free Microfuge Tube | Ambion | p/n AM12400 or equivalent | Microcentrifuge |
| Magnetic stir bar | Corning | p/n 401435 or equivalent | Instrument for stirring |
| Qubit Fluorometer | Life Technologies | p/n Q32857 | Instrument for DNA quantification |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit, for use with the Qubit fluorometer | Invitrogen | p/n Q32850 | Kit for Qubit fluorometer |
| UV-VIS spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 8000 or 2000, or equivalent | Instrument for DNA quantification |
| P10, P20, P200 and P1000 pipettes | Pipetman or equivalent | DNA dispensation | |
| Vacuum Concentrator | Thermo Scientific | p/n DNA120-115 or equivalent |
Instrument to concentrate DNA |
| SureTag Complete DNA Labeling Kit | Agilent | p/n 5190-4240 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| Purification Columns (50 units) | Agilent | p/n 5190-3391 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| AutoScreen A, 96-well plates | GE Healthcare | p/n 25-9005-98 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| GenElute PCR Clean-Up Kit | Sigma-Aldrich | p/n NA1020 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| Human Genomic DNA | p/n G1521 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) | |
| For CGH microarrays: | Promega | (female) or p/n G1471 (male) | Array CGH control DNA |
| For CGH+SNP microarrays: | Coriell | p/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878, or NA18579 | Array CGH control DNA |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer Kit or | Agilent | p/n 5188-5226 | Array CGH hybridization and wash |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and | Agilent | p/n 5188-5221 | Array CGH hybridization and wash |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2 | Agilent | p/n 5188-5222 | Array CGH hybridization and wash |
| Stabilization and Drying Solution | Agilent | p/n 5185-5979 | Array CGH hybridization and wash |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit | Agilent | p/n 5188-5220 (25) or p/n 5188-5380 (100) | Array CGH hybridization and wash |
| Human Cot-1 DNA | Agilent | p/n 5190-3393 | Array CGH hybridization and wash |
| Agilent C scanner | Agilent | Scanner for array CGH slides | |
| SureSelect XT2 Reagent Kit | Kit for target enrichment | ||
| HiSeq platform (HSQ), 16 Samples | Agilent | p/n G9621A | |
| HiSeq platform (HSQ), 96 Samples | Agilent | p/n G9621B | |
| HiSeq platform (HSQ), 480 Samples | Agilent | p/n G9621C | |
| MiSeq platform (MSQ), 16 Samples | Agilent | p/n G9622A | |
| MiSeq platform (MSQ), 96 Samples | Agilent | p/n G9622B | |
| MiSeq platform (MSQ), 480 Samples | Agilent | p/n G9622C | |
| DNA 1000 Kit | Agilent | p/n 5067-1504 | Kit for the separation, sizing and quantification of dsDNA fragments from 25 to 1000 bp. |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | p/n 5067-4626 | Kit for analysis of fragmented DNA or DNA libraries. |
| AMPure XP Kit | Kit for automated PCR purification. | ||
| 5 mL | Agencourt | p/n A63880 | |
| 60 mL | Agencourt | p/n A63881 | |
| 450 mL | Agencourt | p/n A63882 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Isolation and handling of biotinylated nucleic acids | ||
| 2 mL | Life Technologies | Cat #65601 | |
| 10 mL | Life Technologies | Cat #65602 | |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit, for the Qubit fluorometer | DNA quantification | ||
| 100 assays, 2-1000 ng | Life Technologies | Cat #Q32850 | |
| 500 assays, 2-1000 ng | Life Technologies | Cat #Q32853 | |
| Qubit assay tubes | Life Technologies | p/n Q32856 | DNA quantification |
| SureSelec tXT2 Capture Libraries | Agilent | depending on the experiment | Kit for libraries capture |
| SureCycler 8800 Thermal Cycler | Agilent | p/n G8800A | DNA amplification |
| 96 well plate module for SureCycler 8800 Thermal Cycler | Agilent | p/n G8810A | DNA amplification |
| SureCycler 8800-compatible 96-well plates | Agilent | p/n 410088 | DNA amplification |
| Optical strip caps | Agilent | p/n 401425 | DNA amplification |
| Tube cap strips, domed | Agilent | p/n 410096 | DNA amplification |
| Compression mats | Agilent | p/n 410187 | DNA amplification |
| 2100 Bioanalyzer Laptop Bundle | Agilent | p/n G2943CA | DNA amplification |
| 2100 Bioanalyzer Electrophoresis Set | Agilent | p/n G2947CA | DNA amplification |
| Covaris Sample Preparation System, E-series or S-series | Covaris | DNA shearing | |
| Covaris sample holders | p/n 520078 | DNA shearing | |
| Nutator plate mixer | BD Diagnostics | p/n 421105 or equivalent | Plate Mixer |
| GaIIx | Illumina | next generation sequencing machine |
References
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