Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Новые стратегии, сочетающей массив CGH, всего exome последовательности и в утробе матери электропорации грызунов для выявления причинных генов для пороки развития головного мозга

Published: December 1, 2017 doi: 10.3791/53570
Automatic Translation
*1, *2,3,15, 2,3,4, 5,6,7, 2,3,8, 1, 2,3, 2,3, 2,3,8, 9, 10, 10, 11, 10, 9,12, 2,3, 13, 1,14, 2,3, 2,3
1University of Florence, 2INSERM INMED, 3Aix-Marseille University, 4Plateforme Biologie Moléculaire et Cellulaire INMED, 5Royal Children's Hospital, 6Murdoch Children's Research Institute, 7University of Melbourne, 8Plateforme postgenomique INMED, 9University of Pavia, 10Wellcome Trust Centre for Human Genetics, 11Oxford Radcliffe NHS Trust, 12IRCCS Casimiro Mondino Foundation, 13Research Institute of Molecular Pathology, 14IRCCS Stella Maris, 15Columbia University
* These authors contributed equally

Summary

Перивентрикулярной узловой heterotopia (НПГ) является наиболее распространенной формой пороки развития коры головного мозга (MCD) в зрелом возрасте, но его генетической основы остается неизвестным в наиболее спорадических случаев. Недавно мы разработали стратегию выявления роман кандидат генов для МОРС и непосредственно подтвердить их причинных роль в естественных условиях.

Abstract

Врожденные дефекты, которые включают головного мозга — также известен как пороки развития коры головного мозга (MCD) — являются важными причинами умственной инвалидности и составляют 20-40% лекарственно-эпилепсии в детстве. Изображений с высоким разрешением мозга способствовала в естественных условиях идентификации большой группы MCD фенотипов. Несмотря на успехи в томографии головного мозга, геномного анализа и генерации животных моделей отсутствует простой рабочий процесс для систематически приоритеты кандидата генов и тестирования функциональных последствий предполагаемого мутаций. Для преодоления этой проблемы, экспериментальной стратегии, позволяющие идентифицировать Роман причинных генов для MCD разработан и проверен. Эта стратегия основана на выявления геномной регионах кандидат или генов через массив CGH или целое exome секвенирования и характеризующих последствия их инактивации или гиперэкспрессия специфических мутаций в разработке грызунов мозги через в утробе матери Электропорация. Этот подход привел к выявлению гена C6orf70 , кодирование для предполагаемого везикулярного белка, в патогенезе перивентрикулярной узловой heterotopia, МКД, вызванных дефектных миграции нейронов.

Introduction

Коре играет ключевую роль в процессах когнитивных и интеллектуальной и участвует в эмоциональной регуляции, а также обучения и памяти. Поэтому не удивительно, что многие неврологические и психические заболевания в результате пороков развития коры головного мозга (MCD). Этиология MCD сложной так как приобрел и генетических факторов. Накопительное распространения генетически детерминированных доля MCD составляет около 2%, и они являются спорадические в большинстве случаев. Например распространенность врожденных мозга дисгенезия оценивается выше, чем 1% населения, и некоторые виды MCD наблюдаются в более чем 14% всех пациентов с эпилепсией и 40% тяжелой или неразрешимыми эпилепсии1, 2.

Перивентрикулярной узловой Heterotopia (НПГ) является одним из наиболее распространенных MCDs и вызвано ненормальное миграции нейронов из желудочков зоны (VZ) для развивающихся коры головного мозга. Неспособность нейронов переносить результаты в кластерах heterotopic нейронов вдоль стены боковых желудочков, которые обычно могут быть визуализированы с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ). Клинико-анатомических и изображений функции НПГ неоднородны. Конкреций могут варьироваться от небольших и односторонних двусторонних и симметричный. Общие клинические осложнения включают эпилепсию и интеллектуальной инвалидностью3. Мутации в гене Filamin A (или FLNA), которая сопоставляет в Xq28, были найдены в 100% семей с Х-хромосомой двусторонних НПГ и 26% спорадических больных3,4. Редкие, рецессивный форма НПГ, вызванных мутациями в гене ARFGEF2 , который карты в 20q13, были зарегистрированы в двух кровосмесительных семей5. Недавно в девяти больных, пострадавших от мультисистемной расстройство, которое включает в себя НПГ6было выявлено biallelic мутации генов, кодирующих рецептор лиганд Кадгерины пара DCHS1 и FAT4 . НПГ также было связано с ломкой Х синдром7, Уильямс синдром8, 22q11 микроделеций синдром9, дублирования 5 p 1510, удалений в 1 p 3611, 5q14.3-q1512, 6 p 2513 и 6q терминала исключить синдром14,15,16,17,18,19, предполагая, что дополнительные причинных генов разбросаны на протяжении всего генома. Однако для примерно 74% больных спорадических НПГ генетическую основу остается проясненного17.

Классические Джин сопоставления подходы, такие, как массив Сравнительная геномная гибридизация (массив CGH) доказали, что мощные инструменты для обнаружения югу микроскопических хромосомных аномалий, однако геномные регионов, выявленных с помощью этого подхода часто большие и содержат многочисленные гены.

Появление массивной параллельной последовательности методов (то есть целое-Exome последовательности (Уэс) и целом-геном последовательности (РГ)) существенно сократить затраты и время, необходимое для последовательности всей человеческой exome или генома. Тем не менее интерпретация данных Уэс и WGS остается сложной задачей в большинстве случаев, поскольку для каждого пациента десятков до сотен (или даже тысяч, в зависимости от типа анализа) варианты выйти из фильтрации данных.

Чтобы ускорить процесс идентификации Роман MCD причинных генов, Роман систематической стратегии, сочетающей массив CGH, был разработан Уэс и в утробе матери электропорации (МСЭ) отбора кандидата генов. МСЭ позволяет выборочно отключить (или overexpress) специфических генов мутации в грызунов мозги, быстрой оценки их участия в corticogenesis18,19. Ожидается, что при посредничестве RNAi-нокдаун или гиперэкспрессия генов одного или более кандидата вызвать, когда ген связан с развития болезни, локализованные дефекты нейронной миграции и/или созревания. После определения гена, чьи инактивация (или гиперэкспрессия) воспроизводит фенотип, наблюдается у больных грызунов она становится выдающийся кандидатом для скрининга в спорадических больных с MCD. Используя этот подход, мы недавно выявили решающий вклад гена C6orf70 (также известный как ERMARD) в патогенезе НПГ в укрывательстве 6q27 хромосомных удаления16пациентов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этика заявление: Крыс Вистара были вязка, поддерживается и используется в INMED животных зал, по согласованию с Европейским союзом и французского законодательства.

1. ДНК добычи и количественной оценки для массива CGH и Уэс

  1. Извлечь из лейкоцитов крови человека от больных с использованием автоматизированных роботов изоляции ДНК или коммерчески доступных ручной комплекты экстракции ДНК согласно протоколу производителя геномной ДНК (геномная ДНК). Подсчитать все образцы с помощью спектрофотометра.

2. массив CGH протокол

  1. Пищеварение ограничения геномная ДНК
    1. Двухместный Дайджест 500 нг очищенный геномная ДНК от пациента и коммерчески доступных человеческого контроля ДНК с RsaI и другие втечение 2 ч при 37 ° C. Используйте 0.5 мкл 10 U/мкл фермента для каждой реакции. Проинкубируйте втечение 20 мин при 65 ° C для инактивации ферментов и перемещения образца трубки для льда.
  2. Образец маркировки
    1. Добавьте соответствующий объем случайных праймеров, необходимый для использования формата microarray используется для каждой пробке реакции (например 5 мкл для microarrays 1-пакет, 2-пакет и 4-пакет). Смешайте хорошо закупорить вверх и вниз осторожно.
    2. Передача образцов труб тепловая велосипедист. Инкубируйте на 95 ° C в течение 3 мин, а затем на 4 ° C за 5 мин.
    3. Подготовка одного цианиновые 3 и один цианиновые 5 маркировки Мастер микс на льду, смешивая следующие тома: 10,0 мкл 5 X буфер реакции, 5.0 мкл 10 x dNTPs, 3.0 мкл цианиновые 3-dUTP или цианиновые 5-dUTP и 1.0 мкл Exo (-) фрагменты фермента, 2.0 мкл воды, свободной от нуклеиназы. Выберите объем каждого реагента по microarray формат используется.
    4. Добавьте смесь мастер маркировки для каждой реакции трубка, содержащая геномная ДНК. Смешайте хорошо аккуратно закупорить вверх и вниз.
    5. Передать тепловая велосипедист пробоотборные трубки и инкубировать при 37 ° C 2 h, 65 ° C для 10 мин и затем сохранить образцы на 4 ° C.
  3. Очистка помечены геномная ДНК
    1. Мкл 430 1 x МЭ (рН 8,0) к каждой пробке реакции.
    2. Поместить столбец очистки в 2 мл коллекции трубок и метки столбцов соответствующим образом. Нагрузки каждого помечены геномная ДНК на столбец очистки.
    3. Центрифуги для 10 мин на 14 000 x g в microcentrifuge при комнатной температуре. Отказаться от потока через и поместить столбец обратно в 2-мл пробирку коллекции.
    4. 480 мкл 1 x TE (рН 8,0), для каждого столбца. Центрифуги для 10 мин на 14 000 x g в microcentrifuge при комнатной температуре. Отказаться от потока через.
    5. Инвертируйте столбца в коллекции свежий 2-мл пробирку и центрифуги за 1 мин на 1000 x g в microcentrifuge при комнатной температуре для сбора очищенной образца.
    6. Довести объем образца для запрошенной microarray формата используется с помощью концентратора или добавление 1 x TE (рН 8,0). Например для 1-Пак microarray доводят объем до 80.5 мкл. инкубации образца на льду на 5 мин и затем Пипетка решение вверх и вниз по 10 раз.
  4. Подготовка помечены геномная ДНК гибридизации
    1. Совместить тест и ссылки образцы, используя соответствующие цианиновые 5-меченых образца и цианиновые 3-меченых образца в трубке свежие 1,5 мл, RNase бесплатно. Например для 1-Пак microarray обеспечить окончательный объем является 158 мкл. Выберите объем каждого образца в формате microarray дна в использовании.
    2. Используйте спектрофотометр для измерения доходности, степень маркировки или конкретных активности путем измерения оптической плотности в A260 Нм (ДНК), A550 Нм (цианиновые 3) и A650 Нм (цианиновые 5).
      1. Вычислить доходность по формуле: [ДНК concentration(ng/µl) x объем образца (мкл)] / 1000 (нг/мкг). Расчет удельной активности с использованием формулы: пмоль за мкл краска/мкг на мкл геномная ДНК.
        Примечание: например, для 0,5 мкг ввода ДНК, выход должен быть 8-11 мкг и удельная активность (пмоль/мкг) должна быть 25-40 для цианиновые-3 помечены образца и 20-35 для маркированных образца цианиновые-5.
    3. Подготовить количество гибридизации Мастер микс, необходимый для использования формата microarray используется смесь следующих реагентов: 50 мкл Cot-1 ДНК (1,0 мг/мл), 52 мкл 10 x aCGH блокирование агента и 260 мкл 2 x HI-RPM гибридизации буфера.
    4. Добавьте соответствующие объемы гибридизации Мастер микс труба 1,5 мл, RNase бесплатно, содержащий помечены геномная ДНК для получения общего объема для microarray формата используется. Например 1 пачка microarray дна, убедитесь, что конечный объем для каждой реакции 362 мкл.
    5. Смешать образца, закупорить вверх и вниз, а затем быстро центрифуг в 14.000 x g и Инкубируйте 3 мин при 95 ° C и при 37 ° C за 30 мин.
  5. Палаты собрания и гибридизации
    1. Загрузите чистой прокладка слайд в камере базу с прокладка этикеткой вверх и согласованы с прямоугольного сечения камеры базы. Обеспечить, чтобы слайд прокладку заподлицо с базой камеры и не приоткрытой.
    2. Отказаться от гибридизации образца смесь на прокладку колодец, убедившись, что образец равномерно распределены.
    3. Положите microarray слайд на слайд прокладку, оценке что сэндвич пара правильно выровнен. Затем соберите реакционной камере положить крышку на слоеное слайды и ручной затяжки зажима.
    4. Обеспечить слайды, смачивание, поворачивая зале собраны по вертикали. Убедитесь, что пузыри не присутствует в зале. При необходимости нажмите Ассамблеи на твердой поверхности для перемещения стационарных пузыри.
    5. Положите в собранном виде слайд камеры в ротатор стойку для поворота на 20 об/мин. Поставьте камеру гибридизации в духовке и выполнить гибридизации при 65 ° C для 24-40 h согласно microarray формат используется.
  6. Microarray мытья и сканирование
    1. Гибридизации камеры из печи и погрузите его в мыть буфера 1. Перейти к его разборки.
    2. Удалить слайд microarray и быстро положил его в стойку слайд в буфере 1 мыть при комнатной температуре.
    3. Вымойте массива слайд 5 мин с перемешивания (используйте блох и магнитной мешалкой). Регулировать скорость мешалки параметру 4 (средняя скорость), чтобы получить хорошее, но не слишком энергичные смешения.
    4. Вымойте слайд массива в буфере 2 мыть для 90 s перемешивания. Аккуратно восстановить слайд из буфера (она должна выйти сухой) и загрузить его в слайд держатель с помощью слайд-протектор.
    5. Загрузить слайд в массив сканера и выполнять сканирование согласно инструкциям производителя массива.
    6. Анализировать результаты, используя программное обеспечение извлечения с сканера используются согласно инструкции производителя (V.9.1.3.1).

3. Уэс протокол

  1. Обогащение целевой
    1. Для определения концентрации геномная ДНК образца согласно протоколу инструмент используйте dsDNA BR Assay.
    2. Разбавьте 5 мкг высокое качество двойной нити ДНК с 1 x температура TE буфер в трубке низкий связывать 1,5 мл в суммарный объем 50 мкл.
    3. Настройка sonicator и положить Микропробирка станцию погрузки и разгрузки согласно инструкции производителя. Держите крышку на трубе.
    4. Медленно передачи образцов ДНК 50 мкл через предварительно разделенное перегородками без введения пузыри.
    5. Сдвига ДНК в соответствии с параметрами, предложил от производителя sonicator и оценить качество, с использованием Bioanalyzer согласно инструкции производителя. Целевой размер фрагментов ДНК-150-200 bp.
  2. Заканчивается ремонт ДНК
    1. Подготовка конце ремонта реакция смеси путем смешивания 40 мкл конце ремонта фермент смесь с 10 мкл конце ремонта Oligo смеси. Смесь хорошо на вихревой смеситель.
    2. Проинкубируйте образцы при 20 ° C на 30 мин в тепловая велосипедист и затем, удерживая их на 4 ° C. Не пользуйтесь крышкой с подогревом.
    3. Добавьте 50 мкл конце ремонта реакция смеси подготовлен на шаге 3.2.1 каждый 50 мкл стриженый, образец ДНК хорошо. Смесь хорошо закупорить вверх и вниз или нежные vortexing.
    4. Очищение образца с комплектом очистки бусы на основе согласно протоколу производителя.
  3. Сплайсингу 3' концы.
    1. 20 мкл Mix мастер да хвостохранилища, в каждый конец отремонтированы, очищенная ДНК образца (примерно 20 мкл).
    2. Смесь хорошо закупорить вверх и вниз или нежные vortexing.
    3. Проинкубируйте образцы при 37 ° C в тепловая велосипедист и затем, удерживая его на 4 ° C. Не пользуйтесь крышкой с подогревом.
  4. Лигирование индексации адаптер до захвата.
    1. 5 мкл лигирование Master Mix, для каждого образца A-белохвост ДНК.
    2. 5 мкл соответствующего решения индекс до захвата, для каждого образца.
    3. Уплотнение скважин и тщательно перемешать, vortexing для 5 s. кратко центрифуги образцы.
    4. Проинкубируйте образцы при 20 ° C 15 мин в тепловая велосипедист и затем провести на 4 ° C. Не пользуйтесь крышкой с подогревом.
    5. Очищайте образцы с комплектом очистки бусы на основе согласно протоколу производителя.
  5. Усиление индексированного библиотеки.
    1. Подготовьте соответствующий объем смеси реакции PCR до захвата, смешивая 1 мкл смеси праймера и 25 мкл ПЦР Мастер микс. Смесь хорошо на вихревой смеситель.
    2. Объединить 26 мкл амплификации смеси в отдельных скважинах ПЦР плиты и 24 мкл каждого образца библиотеки индексированных геномная ДНК.
    3. Запустить программу ПЦР с следующими шагами: 98 ° C на 2 мин, 5 циклов на 98 ° C за 30 сек, 60 ° C за 30 s и 72 ° C за 1 мин и окончательное расширение при 72 ° C для 10 min. удерживайте образцов при 4 ° C.
    4. Очищение образца с комплектом очистки бусы на основе согласно протоколу производителя.
    5. Оцените качество с Bioanalyzer согласно протоколу производителя.
  6. Объединение индексированного образцов ДНК для гибридизации
    1. Для каждого пула реакции захвата объединять соответствующий объем каждого образца библиотеки индексированных геномная ДНК в одной скважиной ПЦР-планшете. Например, для человека или библиотек захвата мыши все-экзона, объединить 8 библиотек в пул с помощью 187,5 нг каждого индексированного библиотеки. Убедитесь, что каждый пул реакции окончательного захвата содержит 1500 нг индексированных геномная ДНК.
    2. Уменьшить объем в каждом хорошо < 7 мкл, с помощью вакуума концентратор. Избегайте полностью сушка образца.
    3. Добавьте достаточно воды, свободной от нуклеиназы каждый пул концентрированной геномная ДНК довести окончательный объем хорошо до 7 мкл и затем вихревой пластину, содержащие геномная ДНК энергично за 30 с. Центрифуга в центрифуге или мини-плита spinner для сбора жидкости в нижней части скважины.
  7. Гибридизация геномная ДНК библиотека пулов для захвата библиотеки
    1. Каждый пул геномная ДНК 7 мкл индексируются мкл 9 блокирования микс. Пипетка вверх и вниз, чтобы смешать.
    2. Крышки колодцев, передачи запечатанном пластины, содержащие геномная ДНК к тепловая велосипедист и Инкубируйте на 95 ° C за 5 минут, а затем провести его на 65 ° C. Убедитесь, что пластины проводится при 65 ° C для по крайней мере 5 минут.
    3. Подготовить соответствующие разрежения РНКазы блока, на основе размера библиотеки захвата (10% раствора для библиотек < 3.0 МБ и 25% разрежения для библиотек > 3.0 МБ).
    4. Размерам захватить библиотека объединить необходимое количество захвата библиотеки и разбавить раствор РНКазы блока в ПЦР-планшете, хранится на льду. Смешайте хорошо закупорить. Для захвата библиотек < 3.0 МБ, используйте 2 мкл библиотеки и 5 мкл РНКазы блока на 10% разрежения. Для захвата библиотек > 3,0 МБ, использование 5 мкл библиотеки и 2 мкл РНКазы блока на 25% разрежения.
    5. Мкл 37 гибридизации буфера для каждой скважины, содержащий 7 мкл захвата блока библиотеки/РНКазы смеси. Смесь хорошо закупорить и кратко центрифуга пластину, содержащие смеси.
    6. Поддерживать пластину бассейн геномная ДНК при 65 ° C при использовании многоканальных дозаторов для передачи всего 44 мкл захвата библиотека смеси от шага 3.7.5 для каждого образца также пластину бассейн геномная ДНК. Смешайте хорошо закупорить медленно вверх и вниз по 8-10 раз.
    7. Уплотнение скважин с куполом газа шапки. Убедитесь, что все скважины полностью опечатаны. Поместите циновку сжатия пластины ПЦР в тепловая велосипедист.
    8. Инкубировать гибридизации смесь для 24 h на 65 ° C. Примечание: Образцы могут быть гибридизированных до 72 часов, но необходимо убедиться, что расширенная гибридизации не вызывает обширные испарения в скважинах образца.
  8. Подготовка стрептавидина покрытием магнитные бусы
    1. Prewarm мыть буфера 2 при 65 ° C в блоке водой ванну или тепла.
    2. Энергично Ресуспензируйте стрептавидина магнитные бусы на вихревой смеситель. Магнитные бусы поселиться во время хранения.
    3. Для каждого образца гибридизации 50 мкл ресуспензированы бусы из скважин ПЦР-планшете.
    4. Вымойте бисер и Ресуспензируйте их в 200 мкл буфера привязки.
  9. Захват гибридизированные ДНК с помощью стрептавидина бусины.
    1. Оценить и фиксируют объем гибридизации решения, которое остается после 24 ч инкубации.
    2. Поддерживать пластину гибридизации при 65 ° C и использовать многоканальные пипетки для передачи всего тома (примерно 60 мкл) каждого гибридизации смеси лунках, содержащие 200 мкл промывают стрептавидина бусины. Смешайте хорошо закупорить медленно вверх и вниз по 3-5 раз.
    3. Крышки колодцев и инкубировать захвата плиты на Nutator смесителя или эквивалент для 30 мин при комнатной температуре. Убедитесь, что образцы правильно смешивания в скважинах.
    4. Кратко центрифуга захвата пластины в центрифуге или мини-плита spinner.
    5. Положите пластину захвата в магнитный сепаратор для сбора бисер от приостановки. Снимите и выбросьте супернатант.
    6. Ресуспензируйте бисер в 200 мкл мыть буфера 1. Смешайте закупорить вверх и вниз до тех пор, пока бисер полностью высокомобильна.
    7. Кратко центрифуги в центрифуге или мини-плита spinner.
    8. Установите пластину в магнитный сепаратор.
    9. Ждать решение очистить, затем удалить и удалить супернатант.
  10. После захвата образец обработки мультиплексированные последовательности
    1. Подготовить соответствующий объем реакционной смеси ПЦР, смешивая следующее: 9 мкл нуклеиназы свободной воды, 25 мкл Мастер микс и 1 мкл грунт смешать зависимости количества амплификации. Смеси хорошо с помощью вихревой смеситель и держать на льду.
    2. Для каждой реакции амплификации место 35 мкл реакционной смеси ПЦР из шага 3.10.1 в скважинах ПЦР-планшете.
    3. Пипетка каждого из бисера прыгните захваченных библиотека бассейн образцов вверх и вниз, чтобы обеспечить однородное подвески из бисера.
    4. Добавьте 15 мкл каждого подвески из бисера бассейн захваченных библиотеки в соответствующие смеси реакции PCR хорошо. Тщательно перемешать, дозирование до тех пор, пока шарик подвеска является однородной.
    5. Место пластину, подготовленных в точке 3.10.2 в тепловая велосипедист и запустите следующую программу амплификации PCR: 98 ° С в течение 2 мин., 8-11 циклов на 98 ° C за 30 с, 60 ° C 30 s и 72 ° C в течение 1 мин, затем окончательное расширение при 72 ° C для 10 мин. Держите образцов при 4 ° C.
    6. Очищение образца с бисер на основе очистки согласно протоколу производителя.
    7. Оцените качество с Bioanalyzer согласно протоколу производителя.
  11. Подготовка образцов для мультиплексированных виртуализации
    Примечание: Окончательный обогащенного образцы содержат бассейны 8 или 16 индексированных библиотек, основано на размере захватить библиотеки и в результате до захвата, объединение стратегии. Общее количество индексированных библиотек, которые могут быть мультиплексируются в одной последовательности Лейн определяется выходной характеристики платформы используется вместе с количеством последовательности данных, необходимых для захвата библиотеки.
    1. Рассчитайте количество индексов, которые могут быть объединены в одну полосу движения, по словам возможностей платформы. Общее количество индексированных библиотек, которые могут быть мультиплексируются в одной последовательности Лейн определяется выходной характеристики платформы используется вместе с количеством последовательности данных, необходимых для захвата библиотеки. Например для человека все экзона v5 библиотеки, рекомендовал виртуализации данных каждой индексации библиотеки составляет 4 ГБ и рекомендовал виртуализации данных пулу до захвата 32 ГБ (8-индекс бассейны).
  12. Последовательность библиотек.
    1. Загрузка библиотек на платформе виртуализации следующего поколения выбора и выполнить последовательность запуска согласно спецификации инструмента.
  13. Анализ exome последовательности данных.
    1. Запуск конвейера и программное обеспечение выбора для базового вызова. Например используйте Stampy для сопоставления считывает20, удалить дубликаты с Пикар (http://broadinstitute.github.io/picard/) и определения единичных нуклеотидных полиморфизмов и вставки или удаления баз (indels) с утконоса21. Фильтр синонимом вариантов и теми, которые наблюдались в частота аллеля < 5% и сравнения данных с теми, кто из родителей exomes для определения вариантов de novo .

4. плазмида ДНК подготовка для электропорации в утробе матери

  1. Дизайн несколько коротких шпильки РНК (процессируются) ориентации кодирующая последовательность или 3' УТР кандидат генов, как было описано ранее22.
  2. Чтобы предотвратить створ эффекты проверить процессируются специфика взрыв Поиск баз данных с использованием стандартных методов. Исключите процессируются отображение более чем 50% взаимодополняемости с другими генами крыса.
  3. Клон отожженная олигонуклеотиды в mU6-про вектор как описано ранее,23.
  4. Очистить плазмидной ДНК с макси prep согласно инструкции производителя и сделать окончательный концентрации 3 мкг/мкл.
  5. Аликвота 20 мкл ДНК (0.5 мг/мл pCAGGS-GFP либо самостоятельно или с 1,5 мг/мл индуцируемый построить) и 2 мкл быстро зеленый краситель (2 мг/мл) для обеспечения визуального контроля впрыска.

5. в утробе матери Электропорация

  1. Хирургическая процедура
    1. Анестезировать E15.5 беременных самок крыс (E0 был определен как днем подтверждения Вагинальные вилка спермы позитивных), используя комбинацию с смесь кетамина/Ксилазина (0.1 и 0,01 мг на тело вес, соответственно), которая предоставляется через внутрибрюшинного инъекции для индукции анестезии.
    2. Убедитесь, что животное находится полностью под наркозом, наблюдая за исчезновение мыс щепотку рефлекс.
    3. Бритье животных в нижней части живота с помощью машинки для удаления шерсти. Дезинфекция кожи с помощью скрабов повидон йода и 70% спирта. Примените мазь ветеринар на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
    4. Поместите животное на источник тепла и положить стерильные драпировки (с открытым окном в середине 4-5 см) на сайте разрез. Носите маски, лаборатории пальто, шапки и перчатки стерильные хирургические. Поддерживать стерильность до конца операции.
    5. С помощью острых ножниц сделать вертикальный разрез (2-2,5 см) в кожу вдоль средней линии в хвостовой части живота и затем сделать разрез стены мышц под кожу — также от 2,5 см — вдоль средней линии.
    6. Тщательно предоставляют один рога матки из брюшной полости. Падение 37 ° C подогретым нормальный физиологический раствор для увлажнения эмбрионов. Держите матки влажные все время.
  2. Инъекции ДНК и Электропорация
    1. Аккуратно прижмите один из маточные рожки кольчатой пинцетом и аккуратно протолкните одного эмбриона в стенку матки. Держите эмбриона в одной руке и с другой стороны вставки тщательно стеклянные капилляры 1 мм от средней линии в левый боковой желудочек (2-3 мм в глубину) и придать примерно в 1 мкл ДНК с быстро зеленый возможность визуального контроля с помощью инъекций microinjector.
    2. Падение нормальный физиологический раствор на поверхности электродов2 3 x 7 мм. Место позитивные стерильные электрода на введенный стороне (левый боковой желудочек) и негативные стерильные электрода на правый желудочек. Доставить 5 электрические импульсы интервалы 950 ms с контролируемой ног педалью (4000 mF конденсатор взимается 40 V с electroporator).
  3. Электропорация процедуры POST
    1. Положить обратно маточные рожки брюшной полости, добавить капель нормального физиологического раствора в полость позволить эмбрионов, расположены более естественно и приходится интраоперационной потери жидкости.
    2. Закройте мышц брюшной стены с рассасывающиеся хирургические шовные материалы, затем кожи с помощью простой прервана стежком.
    3. Положите крысу обратно к клетке и контролировать животное до тех пор, пока он возникает от анестезии.
    4. Для управления боли бупренорфин (0,03 мг/кг) для животного по администрированию подкожной инъекции каждые 8-12 ч, до 48 ч.

6. мозг пробоподготовки

  1. Метод крепления
    1. Пожертвуйте беременных крыс через 5 дней после хирургической процедуры, с помощью газа анестезии (изофлюрановая) следуют быстро шейки матки дислокации.
    2. Сделайте вертикальный разрез вновь открыть брюшной полости.
    3. Разоблачить маточные рожки, удалить из матки эмбрионы и обезглавить их с помощью острых ножниц.
    4. Удаление мозга с минимальным ущербом для ткани: с помощью острых ножниц, сделать небольшой надрез вдоль задней (мозжечка) / Передняя (olfactive луковицы) оси головы для прокалывания кожи и черепа, затем с помощью пары щипцы удаляйте череп подвергать мозг и удалить его с помощью небольшой лопаткой.
    5. Погружать мозги на ночь при 4 ° C в 4% параформальдегида в 1 x Buffered фосфатный (PBS).
  2. Мозг секционирование
    1. Промойте мозги в однократном ПБС втечение 10 мин.
    2. Внедрите мозги в 4% агар в пластик, встраивание формы.
      1. Подготовка 50 мл 4% агара в 1 x PBS для встраивания 5 эмбриональных мозги. Убедитесь, что растворенной агарозы находится не более чем на 50 ° C.
    3. Держите мозги в агарозы для полимеризации для по крайней мере 1 час при 4° C. Удалите избыток агарозы вокруг мозга.
    4. Клей мозг vibratome основание, ориентированные так передней/задней оси мозга перпендикулярно лопасти. Подождите несколько минут для клея для сухой и место пластину с клееный мозга в vibratome камеру.
    5. Заполните vibratome с ПБС. Нарежьте 100 µm толщиной секций.
    6. Передача срезы мозга на слайдах, удалить лишнюю жидкость, добавьте несколько капель монтажа средних и место coverslip на вершине мозги

7. конфокальная томография и количественный анализ

  1. Пусть монтажа полусухое ночь перед изображений. Изображения разделы в 10 X на сканирование лазерного конфокального микроскопа.
  2. С помощью программного обеспечения для анализа количественных изображений, конвертировать изображения в 8-разрядный, выберите один представитель GFP позитивные люминесцентные клеток и вручную определить свою форму. Чтобы сделать это, нажмите на «Оценки» и нарисуйте границы ячейки, используя инструмент freehand выделения. В этом путь диаметр и интенсивности порог ячейки автоматически сохраняются от программного обеспечения.
  3. Нажмите на «Найти клетки» позволяет программное обеспечение для локализации transfected клеток по всему коры. Затем при необходимости, вручную удалите ложных срабатываний.
  4. Разделите весь толщина коры в 8 областях, представляющих интерес, нормализованы в отдельных разделах. Для достижения этой цели, нажмите на «Регион инструмент», где выберите 8 «регион полосы» (1) первый и последний (8) полосы соответствуют VZ и верхней части CP соответственно. Нажмите на «Применить», чтобы позволить программное обеспечение подсчитать относительное положение GFP transfected клеток в целом коры. Наконец, нажмите на «Сохранить количественной», чтобы экспортировать данные в файле Excel для анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Экспериментальной стратегии, призванной определить Роман MCD причинных генов изъятый в рисунке 1.

Выполняя массив CGH в когорте 155 пациентов с аномалиями развития мозга, переменно объединения НПГ (рисунок 2A), дисгенезия мозолистого тела, colpocephaly, мозжечковая гипоплазия и polymicrogyria, связанные с эпилепсией, атаксия и когнитивные нарушения, мы определили 1.2 МБ минимальной критической удаления в 6q27, разделяют 12 больных (рис. 2B)21. Геномный регион содержит четыре известных генов (THBS2, PHF10, TCTE3 и DLL1) и два предсказал генов (WDR27 и C6orf70) (рис. 2B).

Параллельно массив CGH, Уэс в 14 больных с изолированной двусторонних НПГ и не копировать количество вариаций анализ был проведен анализ, выявление одного пациента с мутацией de novo (c.752T > A: pIle250Asn) предсказал (гена C6orf70 GenBank присоединения номер NM_018341.1) (рис. 3).

Чтобы подтвердить, что мутации, определенных в C6orf70 каузативных роль в НПГ и расследовать ли haploinsufficiency других генов, картирование в 6q27 может влиять фенотипа, их роль в естественных условиях на нейронной миграции была изучена использование в утробе матери опосредованного системой РНК-интерференции нокдаун подход23,24 заставить замолчать их выражения в крыса кортикального слоя нейронной прародителями. Были протестированы только гены, выраженные в развивающихся крыса коры, PHF10, C6orf70 и DLL1, (рис. 4A). Различные шпильки короткие РНК (процессируются) были созданы ориентации кодирования последовательности этих трех генов. Процессируются были затем введено в neuroprogenitors в коры головного мозга крыс в утробе матери электропорации в эмбриональных день 15 (E15), когда формируются совершенные в верхние слои атмосферы корковых нейронов. Зеленый флуоресцентный белок использовался как трансфекции репортер. Относительное распределение GFP-положительных клеток было рассмотрено 5 дней после электропорации. Нокдаун Dll1 и Phf10 привело к небольшой задержке радиальным нейрональных миграции (данные не показаны), тогда как сногсшибательно C6orf70 препятствуют миграции нейронов и привело к развитию heterotopic узелки высоко напоминает о тех, кто замечен в Flna нокдаун модель (рис. 4B)24. И наоборот transfections с неэффективными индуцируемый несоответствие C6orf70 не очевидным сказались на миграции нейронов (рис. 4В).

Figure 1
Рисунок 1: Рабочий процесс для идентификации Роман MCD причинных генов идентификации. Схематическое представление различных подходов, которые могут быть использованы для выявления роман болезнетворные гены. Коробки окрашены в желтый представляют подходов, описанных в настоящем документе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: 6q27 удаления вызывают развитие аномальных мозга с НПГ. Пациент (A) 2. T2-весил корональный (левая панель) и T1-весил осевой (правая панель) секции показаны НПГ, подкладка стены левой височной доли (белые и черные стрелки) ниже развернулось островной коры. Пациент (B) 11. T1-взвешенный корональных разделе, показаны двусторонних heterotopic узелки вдоль стен височной рогами (белые стрелки). Пациент (C) 12. T2-весил корональных разделе. На левой стороне НПГ является до сих пор видны (черная стрелка) и расширенные желудочки. (D) схематическое представление удаления 6q27 региона, указанных в НПГ больных с использованием массива CGH (верхняя часть). Горизонтальные, пунктирные линии представляют собой изъятия, выявленных больных. Размер минимального критического исключить регион указывается также и содержит четыре известных генов: THBS2, PHF10, TCTE3 и DLL1 и два прогнозируемых генов: WDR27 и C6orf70 (верхняя часть). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Секвенирование результаты. ( ) T2 - взвешенный осевой секции показаны двусторонние НПГ в фронтальные рога (белые стрелки) в пациента, перевозящих c.752T > мутации в C6orf70. (B) Сэнгер виртуализации, показывая, что мутации, выявленные Уэс произошла de novo. Черные стрелки указывается положение мутации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Выражение анализ генов, локализованные в минимальной критической области 6q27 и C6orf70-нокдаун изменяет радиальная миграция корковых нейронов. (A) количественного RT-PCR показаны экспрессии генов, содержащихся в регионе критических 6q27 коры головного мозга крысы. A циклофилина был использован для нормализации. (B) представитель кортикальное корональных секции E20 крыса мозги 5 дней после электропорации с либо зеленого флуоресцентного белка построить только (управления), или в сочетании с индуцируемый ориентации C6orf70 кодирования последовательности (C6orf70-shCDS) или с относительное неэффективной несоответствие построить (C6orf70-shCDSmm). FLNA -нокдаун (FLNA-shCDS) был использован в качестве управления нарушением миграции нейронов. Внутриутробно электропорации с C6orf70-shCDS или FLNA-shCDS индуцированных арест GFP-положительных клеток в зоне желудочков (VZ) (белые стрелки), тогда как клетки, выражая GFP отдельно или в сочетании с несоответствием построить не изменяют нейронной миграции. Масштаб баров = 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Морс являются важными причинами умственной инвалидности и составляют 20-40% лекарственно-детства эпилепсии1,2. Интерес к MCDs резко возросло за последнее десятилетие в результате два основных фактора. Во-первых, улучшение в мозга, томография (особенно МРТ), который позволяет врачей и ученых, чтобы визуализировать многие пороки развития головного мозга, которые не были ранее признаны. Другой является эволюция генетических инструменты, которые позволили идентификации многих Роман MCD причинных генов. Это значительно улучшить наши знания механизмов, которые лежат в основе развития мозга и функции и позволило для более точной генетического консультирования.

В прошлом исследователи сосредоточили свои усилия главным образом на определение причинных генов, оставляя дизайн функциональных анализов уточнить их роль в развитии мозга на более поздних этапах. Это стало труднее из-за переход от изучения редких, рецидивирующий генетических расстройств в чаще спорадические расстройства, для которых традиционные ген находить методы не поддаются. Нынешние подходы для выявления причинных генов часто позволяют идентифицировать сравнительно крупных регионов генома, содержащий многочисленные гены (массив CGH) или несколько вариантов в ряде генов кандидата, которые трудно проверить (WES или WGS).

Массив-CGH и Уэс (или WGS) подходы расширили спектр мутаций для многих генетических расстройств. Тем не менее все еще остаются некоторые критические ограничения. Например массив CGH потребности высокого качества ДНК и не удается определить сбалансированные транслокации или небольших удаления/дублирования, в том числе с участием одного или нескольких экзонов одного гена. Для преодоления этой проблемы, массив CGH могут быть выполнены с более высоким разрешением, чем обычные зонд интервал (например с помощью массива CGH kit 1 М) или заменить анализа SNP-массив. Уэс часто не охватывают большой intragenic регионов и идентифицировать глубоко intronic мутации не удалось. Кроме того иногда охват может быть слишком низкой для выявления причинных мутации (особенно в случае мутации с низким процентом мозаичностью). Еще один важный шаг для WES является, что анализ данных и фильтрации по-прежнему требуют значительных усилий. Для увеличения охвата Уэс, может уменьшить количество пациентов в одном эксперименте или захвата различные наборы могут быть использованы в то же время.

МСЭ является наиболее целесообразным подходом к анализировать влияние генов нокдаун нейронной миграции. Однако исследования на другие шаги корковых развития, например Нейрогенез и нейрональных созревания, препятствуют некоторые технические ограничения. Действительно МСЭ выполняется до E13 часто неудачной, тогда как на более поздних этапах расследований ограничены высокий уровень послеродовой летальность, связанные с этой процедурой. Кроме того эффективность нокдаун гена могут отличаться между electroporated эмбрионы, ведущих к значительные фенотипической неоднородности.

В целом настоящий протокол имеет четыре основных критических шагов. Хотя он не является частью протокола, описанных в настоящем документе, мы должны отметить, что первый основной шаг, чтобы быть приняты во внимание при отборе пациентов, чтобы быть зачислены в таких исследованиях. Действительно, процесс идентификации Роман MCD генов клинических и изучена изображений в когорте пациентов, для которых должно быть максимально возможной однородности фенотипа. Сбор у пациентов с очень однородной фенотип увеличивает вероятность выявления причинных мутации в данного гена. Однако минимальное количество пациентов, чтобы быть зачислены в таких исследований для достижения успеха трудно предсказать, так как она сильно зависит от скорости мутации различных генов. Например для генов, например FLNA, который является мутировал в 100% семейных случаев двусторонние НПГ, Х-хромосомой и 26% спорадических пациентов, количество больных, необходимо определить несколько хитов в ген может быть относительно низкой. И наоборот для генов с низкой мутация скорость, количество пациентов, чтобы быть проверены выше. Например, в случае C6orf70, мы смогли определить один причинный мутации только после проверки 64 больных (14 через Уэс и 50 через обычные Сэнгер секвенирования)16, Оценка частоты мутаций для этого гена около 1,5%. Вторым важным шагом является исключением мутаций в всех известных MCD генов для выявления роман причинных генов. Благодаря появлению новых технологий виртуализации следующего поколения скрининг мутации генов известных и кандидата теперь может выполняться в одном эксперименте. Однако соответствующие варианты фильтрации следует использовать чтобы избежать наличие чрезмерного количества ложных срабатываний экспериментально подтверждены и отфильтровать потенциальных причинный мутации. Действительно количество кандидатов генов/вариантов особенно высока в WES экспериментов. Если подозревается в участии данного гена, скрининг мутации также должны дополняться ММПУ анализа, чтобы исключить microdeletions или microduplications. Третья точка критической является тот факт, что хромосомных перестроек сильно зависит от местоположения точки останова. В этом контексте стоит исключить, чтобы в максимально возможной степени, нарушение или перемещение СНГ регуляторные элементы дистальнее генов, не включенные в дублирования исключить. Наконец в естественных условиях интерференции эксперименты предположить, что причинных генов играть непосредственную роль в нейрональных миграции эмбриональных стадиях. Однако этиология MCD, включая НПГ, является неоднородной и подход в утробе матери может не обнаружить эффекты генов, участвующих в развития шаги, включая выживаемость нейронов распространения или ячейки. Кроме того низкая сложность грызунов мозга может маскировать влияние нокдаун или Избыточная экспрессия гена данного кандидата, который может быть более очевидным в человеческом мозге.

Мы считаем, что поможет интеграции геномики и в естественных условиях функциональных исследований для разработки новых диагностических инструментов для выявления новых MCD причинных генов. Эта стратегия могла бы также предоставить новые животные модели для тестирования терапевтических целей и понимать патофизиологию MCD, которые пока что были ограничены отсутствием экспериментальных моделей и ограниченный доступ к мозговой ткани от пострадавших пациентов. Расшифровка молекулярные пути, которые связаны с MCD расстройства также предоставит ценную новую информацию о развитии физиологических мозга в целом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы благодарим д-р G. Макгилливрей, Pr. Клейтон-Смит, Pr. ВБ Dobyns, Pr. P. Стриано, Pr. т.е. Шеффер, Pr. с.п. Roberston и Pr. с.ф. Berkovic для предоставления MCD пациентов. Мы благодарим д-р F. Мишель и D. Мэй за технические консультации и помощь. Эта работа была поддержана финансирование от 7 Рамочной программы ЕС, желание проекта, номер договора: здоровье-F2-602531-2013, (чтобы V.C., р.г., а.р., а.ф. и C.C.), INSERM (чтобы а.р. и C.C.), Фонд Жером Лежен (R13083AA А.Ф, E.P.P и C.C) и Округов Провинция Альпы Лазурный (APO2014 - ДЕМОТИЧЕСКИЙ C.C. и A.A.D). D.A.K является молодой следователя ЭМБО и поддерживается FWF грантов (I914 и P24367).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Picospritzer III Parker Hannifin Corp P/N 051-0500-900 Intracellular Microinjection Dispense Systems
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252 Fast green allow visual monitoring of the injection
BTX ECM 830 electroporator BTX Harvard Apparatus 45-0002 The ECM 830 is a Square Wave Pulse generator designed for in vitro and in vivo applications
Microtome HM 650 V Microm 10076838 Microtome HM 650 V vibratome 240V 50/60Hz with vibrating blade
FluoView 300 Olympus The Olympus FluoViewTM 300 is a point-scanning, point-detection, confocal laser scanning microscope designed for biology research application
eCELLence software Glance Vision Technologies eCELLence is software designed for the quantitive analysis of cell migration
Agilent Microarray Scanner Bundle Array slides
for 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K or 8 x 15K Agilent Agilent p/n G4900DA, G2565CA or G2565BA
for 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K or 8 x 60K Agilent Agilent p/n G4900DA or G2565CA
Hybridization Chamber, stainless Agilent Agilent p/n G2534A Chamber for array CGH hybridization
Hybridization Chamber gasket slides, 5-pack Gasket for array CGH hybridization
for 1-pack microarrays or Agilent Agilent p/n G2534-60003
for 2-pack microarrays or Agilent Agilent p/n G2534-60002
for 4-pack microarrays or Agilent Agilent p/n G2534-60011
for 8-pack microarrays Agilent Agilent p/n G2534-60014
Hybridization oven Agilent Agilent p/n G2545A
Hybridization oven rotator for Agilent Microarray Hybridization Chambers Agilent Agilent p/n G2530-60029
Thermal cycler with heated lid Agilent Agilent p/n G8800A or equivalent Termal cycler for incubations
1.5 mL RNase-free Microfuge Tube Ambion p/n AM12400 or equivalent Microcentrifuge
Magnetic stir bar Corning p/n 401435 or equivalent Instrument for stirring
Qubit Fluorometer Life Technologies p/n Q32857 Instrument for DNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit, for use with the Qubit fluorometer Invitrogen p/n Q32850 Kit for Qubit fluorometer
UV-VIS spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 8000 or 2000, or equivalent Instrument for DNA quantification
P10, P20, P200 and P1000 pipettes Pipetman or equivalent DNA dispensation
Vacuum Concentrator Thermo Scientific p/n DNA120-115 or
equivalent		 Instrument to concentrate DNA
SureTag Complete DNA Labeling Kit Agilent p/n 5190-4240 DNA Labeling Kit (for Human Samples)
Purification Columns (50 units) Agilent p/n 5190-3391 DNA Labeling Kit (for Human Samples)
AutoScreen A, 96-well plates GE Healthcare p/n 25-9005-98 DNA Labeling Kit (for Human Samples)
GenElute PCR Clean-Up Kit Sigma-Aldrich p/n NA1020 DNA Labeling Kit (for Human Samples)
Human Genomic DNA p/n G1521 DNA Labeling Kit (for Human Samples)
For CGH microarrays: Promega (female) or p/n G1471 (male) Array CGH control DNA
For CGH+SNP microarrays: Coriell p/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878, or NA18579 Array CGH control DNA
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer Kit or Agilent p/n 5188-5226 Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and Agilent p/n 5188-5221 Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2 Agilent p/n 5188-5222 Array CGH hybridization and wash
Stabilization and Drying Solution Agilent p/n 5185-5979 Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit Agilent p/n 5188-5220 (25) or p/n 5188-5380 (100) Array CGH hybridization and wash
Human Cot-1 DNA Agilent p/n 5190-3393 Array CGH hybridization and wash
Agilent C scanner Agilent Scanner for array CGH slides
SureSelect XT2 Reagent Kit Kit for target enrichment
HiSeq platform (HSQ), 16 Samples Agilent p/n G9621A
HiSeq platform (HSQ), 96 Samples Agilent p/n G9621B
HiSeq platform (HSQ), 480 Samples Agilent p/n G9621C
MiSeq platform (MSQ), 16 Samples Agilent p/n G9622A
MiSeq platform (MSQ), 96 Samples Agilent p/n G9622B
MiSeq platform (MSQ), 480 Samples Agilent p/n G9622C
DNA 1000 Kit Agilent p/n 5067-1504 Kit for the separation, sizing and quantification of dsDNA fragments from 25 to 1000 bp.
High Sensitivity DNA Kit Agilent p/n 5067-4626 Kit for analysis of fragmented DNA or DNA libraries.
AMPure XP Kit Kit for automated PCR purification.
5 mL Agencourt p/n A63880
60 mL Agencourt p/n A63881
450 mL Agencourt p/n A63882
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Isolation and handling of biotinylated nucleic acids
2 mL Life Technologies Cat #65601
10 mL Life Technologies Cat #65602
Quant-iT dsDNA BR Assay Kit, for the Qubit fluorometer DNA quantification
100 assays, 2-1000 ng Life Technologies Cat #Q32850
500 assays, 2-1000 ng Life Technologies Cat #Q32853
Qubit assay tubes Life Technologies p/n Q32856 DNA quantification
SureSelec tXT2 Capture Libraries Agilent depending on the experiment Kit for libraries capture
SureCycler 8800 Thermal Cycler Agilent p/n G8800A DNA amplification
96 well plate module for SureCycler 8800 Thermal Cycler Agilent p/n G8810A DNA amplification
SureCycler 8800-compatible 96-well plates Agilent p/n 410088 DNA amplification
Optical strip caps Agilent p/n 401425 DNA amplification
Tube cap strips, domed Agilent p/n 410096 DNA amplification
Compression mats Agilent p/n 410187 DNA amplification
2100 Bioanalyzer Laptop Bundle Agilent p/n G2943CA DNA amplification
2100 Bioanalyzer Electrophoresis Set Agilent p/n G2947CA DNA amplification
Covaris Sample Preparation System, E-series or S-series Covaris DNA shearing
Covaris sample holders p/n 520078 DNA shearing
Nutator plate mixer BD Diagnostics p/n 421105 or equivalent Plate Mixer
GaIIx Illumina next generation sequencing machine

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meencke, H. J., Veith, G. Migration disturbances in epilepsy. Epilepsy Res. 9, 31-39 (1992).
  2. Shorvon, S., Stefan, H. Overview of the safety of newer antiepileptic drugs. Epilepsia. 38 (1), 45-51 (1997).
  3. Parrini, E., et al. Periventricular heterotopia: phenotypic heterogeneity and correlation with Filamin A mutations. Brain. 129 (7), 1892-1906 (2006).
  4. Fox, J. W., et al. Mutations in filamin 1 prevent migration of cerebral cortical neurons in human periventricular heterotopia. Neuron. 21 (6), 1315-1325 (1998).
  5. Sheen, V. L., et al. Mutations in ARFGEF2 implicate vesicle trafficking in neural progenitor proliferation and migration in the human cerebral cortex. Nat Genet. 36 (1), 69-76 (2004).
  6. Cappello, S., et al. Mutations in genes encoding the cadherin receptor-ligand pair DCHS1 and FAT4 disrupt cerebral cortical development. Nat Genet. 45 (11), 1300-1308 (2013).
  7. Moro, F., et al. Periventricular heterotopia in fragile X syndrome. Neurology. 67 (4), 713-715 (2006).
  8. Ferland, R. J., Gaitanis, J. N., Apse, K., Tantravahi, U., Walsh, C. A., Sheen, V. L. Periventricular nodular heterotopia and Williams syndrome. Am J Med Genet A. 140 (12), 1305-1311 (2006).
  9. van Kogelenberg, M., et al. Periventricular heterotopia in common microdeletion syndromes. Mol Syndromol. 1 (1), 35-41 (2010).
  10. Sheen, V. L., et al. Periventricular heterotopia associated with chromosome 5p anomalies. Neurology. 60 (6), 1033-1036 (2003).
  11. Neal, J., Apse, K., Sahin, M., Walsh, C. A., Sheen, V. L. Deletion of chromosome 1p36 is associated with periventricular nodular heterotopia. Am J Med Genet A. 140 (15), 1692-1695 (2006).
  12. Cardoso, C., et al. Periventricular heterotopia, mental retardation, and epilepsy associated with 5q14.3-q15 deletion. Neurology. 72 (9), 784-792 (2009).
  13. Cellini, E., et al. Periventricular heterotopia with white matter abnormalities associated with 6p25 deletion. Am J Med Genet A. 158 (7), 1793-1797 (2006).
  14. Bertini, V., De Vito, G., Costa, R., Simi, P., Valetto, A. Isolated 6q terminal deletions: an emerging new syndrome. Am J Med Genet A. 140 (1), 74-81 (2006).
  15. Dobyns, W. B., et al. Consistent chromosome abnormalities identify novel polymicrogyria loci in 1p36.3, 2p16.1-p23.1, 4q21.21-q22.1, 6q26-q27, and 21q2. Am J Med Genet A. 146 (13), 1637-1654 (2008).
  16. Conti, V., et al. Periventricular heterotopia in 6q terminal deletion syndrome: role of the C6orf70 gene. Brain. 136 (11), 3378-3394 (2013).
  17. Sheen, V. L., et al. Etiological heterogeneity of familial periventricular heterotopia and hydrocephalus. Brain Dev. 26 (5), 326-334 (2004).
  18. Jaglin, X. H., et al. Mutations in the beta-tubulin gene TUBB2B result in asymmetrical polymicrogyria. Nat. Genet. 41 (6), 746-752 (2009).
  19. Falace, A., et al. TBC1D24 regulates neuronal migration and maturation through modulation of the ARF6-dependent pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (6), 2337-2342 (2014).
  20. Lunter, G., Goodson, M. Stampy: a statistical algorithm for sensitive and fast mapping of Illumina sequence reads. Genome Res. 21 (6), 936-939 (2011).
  21. Pagnamenta, A. T., et al. Exome sequencing can detect pathogenic mosaic mutations present at low allele frequencies. J Hum Genet. 57 (1), 70-72 (2012).
  22. Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (9), 6047-6052 (2002).
  23. Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. 6 (12), 1277-1283 (2003).
  24. Carabalona, A., et al. A glial origin for periventricular nodular heterotopia caused by impaired expression of Filamin-A. Hum Mol Genet. 21 (5), 1004-1017 (2012).

Tags

Нейробиология выпуск 130 мальформации корковых развития массив CGH целом exome последовательности в утробе матери электропорация животную модель РНК-интерференция
Новые стратегии, сочетающей массив CGH, всего exome последовательности и <em>в утробе матери</em> электропорации грызунов для выявления причинных генов для пороки развития головного мозга
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Conti, V., Carabalona, A.,… More

Conti, V., Carabalona, A., Pallesi-Pocachard, E., Leventer, R. J., Schaller, F., Parrini, E., Deparis, A. A., Watrin, F., Buhler, E., Novara, F., Lise, S., Pagnamenta, A. T., Kini, U., Taylor, J. C., Zuffardi, O., Represa, A., Keays, D. A., Guerrini, R., Falace, A., Cardoso, C. A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations. J. Vis. Exp. (130), e53570, doi:10.3791/53570 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter