Une stratégie novatrice alliant CGH-Array, séquençage de l’exome-ensemble et électroporation de In Utero chez les rongeurs afin d’identifier les gènes pour les Malformations du cerveau

Summary

Hétérotopie nodulaire périventriculaire (PNH) est la forme la plus courante de malformations du développement cortical (MCD) à l’âge adulte, mais sa base génétique reste inconnue dans des cas plus sporadiques. Nous avons récemment mis au point une stratégie pour identifier les gènes candidats nouveaux pour MCD et de confirmer directement leur rôle causal in vivo.

Abstract

Malformations congénitales qui impliquent le cortex cérébral — aussi connu sous le nom des malformations du développement cortical (MCD) — sont des causes importantes de la déficience intellectuelle et représentent 20 à 40 % des épilepsies pharmacorésistantes dans l’enfance. L’imagerie cérébrale à haute résolution a facilité en vivo l’identification d’un grand groupe de phénotypes MCD. Malgré les progrès de l’imagerie cérébrale, de l’analyse génomique et de génération de modèles animaux, un workflow simple d’accorder systématiquement la priorité gènes candidats et pour tester les effets fonctionnels de mutations putatives est manquant. Pour contourner ce problème, une stratégie expérimentale permettant d’identifier de nouveaux gènes pour MCD a été développée et validée. Cette stratégie repose sur l’identification des régions génomiques candidat ou gènes via CGH-array ou ensemble-l’exome séquençage et de caractériser les effets de leur inactivation ou de la surexpression de mutations spécifiques dans le développement de cerveau rongeurs via in utero électroporation. Cette approche a conduit à l’identification du gène C6orf70 , codant pour une protéine vésiculaire, à la pathogenèse de la leucomalacie hétérotopie nodulaire, un MCD causé par la migration neuronale défectueuse.

Introduction

Le cortex cérébral joue un rôle clé dans les processus cognitifs et intellectuels et est impliqué dans la mémoire comme apprentissage et contrôle des émotions. Il n’est donc pas étonnant que beaucoup de maladies neurologiques et psychiatriques résulte des malformations du développement cortical (MCD). L’étiologie de la MCD est complexe puisque tous deux acquis et les facteurs génétiques sont impliqués. La prévalence cumulée de proportion déterminée génétiquement de MCD est d’environ 2 %, et ils sont sporadiques dans la plupart des cas. Par exemple, l’incidence de la dysgénésie cérébrale congénitale a été estimée à plus de 1 % dans la population humaine, et certaines formes de MCD sont observées dans plus de 14 % des patients souffrant d’épilepsie et dans 40 % des épileptiques graves ou réfractaires^{1, 2}.

Hétérotopie nodulaire périventriculaire (PNH) est l’un de la plus commune MCDs et est causée par une migration anormale des neurones de la zone ventriculaire (VZ) pour le cortex cérébral en voie de développement. L’échec des neurones pour migrer les résultats en amas de neurones hétérotopiques le long des parois des ventricules latéraux qui peuvent habituellement être visualisées à l’aide de l’imagerie par résonance magnétique (IRM). Les caractéristiques cliniques, anatomiques et d’imagerie de la PNH sont hétérogènes. Nodules peuvent varier de petites et unilatérale à bilatérale et symétrique. Des séquelles cliniques communs concernent l’épilepsie et intellectuel handicap³. Des mutations du gène Filamine A (ou FLNA), qui correspond en Xq28, trouvées chez 100 % des familles avec l’HPN bilatérale liée à le X et dans 26 % des patients sporadique^3,4. Une forme récessive rare de PNH causée par des mutations dans le gène ARFGEF2 , qui correspond à 20q13, a été signalée dans deux familles consanguines⁵. Récemment, des mutations bialléliques gènes codant pour la paire de cadhérine récepteur-ligand DCHS1 et saturées4 ont été identifiées chez neuf patients touchés par une maladie multisystémique qui comprend⁶de la PNH. PNH a également été associé fragile X syndrome⁷, Williams syndrome⁸, de syndrome microdélétion 22 q 11⁹, duplications à 5 p 15¹⁰, destructions à 1P 36¹¹, 5q14.3-q15¹², 6 p 25¹³ et 6 q délétion terminale syndrome^{14,15,16,17,18,19}, ce qui suggère que les gènes supplémentaires sont dispersés dans l’ensemble du génome. Cependant, environ 74 % de patients PNH sporadiques le fondement génétique reste à être élucidé¹⁷.

Les approches de cartographie génétique classique tels qu’array hybridation génomique Comparative (CGH-array) se sont avérés pour être des outils puissants pour la détection des anomalies chromosomiques submicroscopique, cependant, les régions génomiques identifiées à l’aide de cette approche sont souvent de grande taille et contiennent de nombreux gènes.

L’avènement des techniques de séquençage parallèle massive (c.-à-d. séquençage de l’Exome-ensemble (WES) et Whole-Genome séquençage (WGS)) a considérablement réduit le coût et le temps requis pour séquencer un ensemble humain exome ou du génome. Interprétation des données de l’EMTE et gt reste néanmoins difficile dans la plupart des cas, depuis, pour les variantes de chaque patient des dizaines à des centaines (ou même des milliers, en fonction du type d’analyse) émergent du filtrage des données.

Pour accélérer le processus d’identification de nouveaux gènes MCD, une stratégie systématique novatrice alliant CGH-array, WES et in utero électroporation (IUE) de dépistage des gènes candidats a été conçu. IUE permet de désactiver sélectivement (ou surexpriment) des gènes spécifiques ou des mutations dans les cerveaux de rongeurs, ce qui permet une évaluation rapide de leur implication dans l’exocytosis^18,19. Arni médié-knockdown ou la surexpression d’un ou plusieurs gènes candidats devrait entraîner, quand le gène est associé de développement de la maladie, de défauts localisés de la migration neuronale et/ou de maturation. Lors de l’identification d’un gène dont l’inactivation (ou surexpression) reproduit le phénotype observé chez les patients chez les rongeurs, il devient un candidat exceptionnel pour le dépistage chez les patients sporadiques avec MCD. En utilisant cette approche, nous avons récemment révélé la contribution essentielle du gène C6orf70 (également connu sous le nom ERMARD) dans la pathogenèse de la PNH chez les patients abritant de destructions chromosomiques en 6 q 27¹⁶.

Protocol

Énoncé d’éthique : Des rats Wistar ont été accouplés, entretenus et utilisés dans les animaleries Invest in Med, en accord avec la législation de l’Union européenne et les Français.

1. ADN Extraction et Quantification de CGH-Array et WES

1. Extraire l’ADN génomique (ADNg) de leucocytes du sang humain provenant de patients à l’aide d’un robot automatisé d’isolement ADN ou trousses manuels disponibles dans le commerce d’extraction d’ADN selon le protocole du fabricant. Quantifier tous les échantillons à l’aide d’un spectrophotomètre.

2. tableau-CGH protocole

1. Digestion de restriction de l’ADNg
   1. Double digest 500 ng de génomique purifié provenant d’un patient et un contrôle disponible dans le commerce humain ADN avec RsaI et AluI pendant 2 h à 37 ° C. Utiliser 0,5 μl de 10 enzymes U/μl de chaque réaction. Incuber pendant 20 min à 65 ° C pour inactiver les enzymes et déplacer les tubes à échantillon à la glace.
2. Étiquetage des échantillons
   1. Ajouter le volume approprié des amorces aléatoires requis pour le format « microarray » en usage dans chaque tube de réaction (par exemple 5 µl de microarrays 1-pack, pack de 2 et 4-pack). Mélangez bien en pipettant également monter et descendre doucement.
   2. Transférer les tubes échantillon dans un thermocycleur. Incuber à 95 ° C pendant 3 min, puis à 4 ° C pendant 5 min.
   3. Préparer un cyanine cyanine 3 et un 5 étiquetage Master Mix sur la glace en mélangeant les volumes suivants : 10,0 µl 5 X tampon de réaction, 5,0 µl 10 x dNTPs, 3,0 µl Cyanine 3-dUTP ou Cyanine 5-dUTP et 1,0 µl Exo (-) enzyme Klenow, 2,0 µl eau exempte de nucléase. Choisissez le volume de chaque réactif selon le format « microarray » en cours d’utilisation.
   4. Ajouter le mélange réactionnel étiquetage dans chaque tube de réaction contenant l’ADNg. Bien mélanger en doucement pipetage de haut en bas.
   5. Transférer les tubes échantillon dans un thermocycleur et incuber à 37 ° C pendant 2 h, 65 ° C pendant 10 min et ensuite maintenir les échantillons à 4 ° C.
3. Purification de l’ADNg étiqueté
   1. Ajouter 430 µl de TE 1 x (pH 8,0) dans chaque tube à essais.
   2. Placer une colonne de purification dans les tubes de prélèvement de 2 mL et étiqueter les colonnes correctement. Charge de chaque étiquette ADNg sur une colonne de purification.
   3. Centrifuger pendant 10 min à 14 000 x g dans une micro-centrifugeuse à température ambiante. Jeter le cheminement et replacez la colonne dans le tube de prélèvement de 2 ml.
   4. Ajouter 480 µL de TE 1 x (pH 8,0) dans chaque colonne. Centrifuger pendant 10 min à 14 000 x g dans une micro-centrifugeuse à température ambiante. Jeter le cheminement.
   5. Inverser la colonne dans un tube de prélèvement de frais 2 mL et centrifuger pendant 1 min à 1 000 x g dans une micro-centrifugeuse à température ambiante pour recueillir des échantillons purifiés.
   6. Porter le volume de l’échantillon de celles exigées pour le format « microarray » utilisé à l’aide d’un concentrateur ou en ajoutant 1 x TE (pH 8,0). Par exemple, pour 1-pack microarray porter le volume à 80,5 µL. Incuber l’échantillon sur la glace pendant 5 min et ensuite déposer la solution monter et descendre de 10 fois.
4. Préparation d’ADNg marqué pour l’hybridation
   1. Combiner des échantillons d’essai et de référence à l’aide de la cyanine appropriée marqués 5 échantillon et cyanine 3 marqués dans un tube frais 1,5 mL RNase-libre. Par exemple, pour 1-pack microarray veiller à ce que le volume final est 158 µL. choisir le volume de l’échantillon selon le format « microarray » en cours d’utilisation.
   2. Utilisez un spectrophotomètre pour mesurer le rendement, degré d’activité étiquetage ou spécifique en mesurant l’absorbance à A260 nm (ADN), A550 nm (cyanine 3) et A650 nm (cyanine 5).
      1. Calculer le rendement moyen de la formule : [ADN concentration(ng/µl) x volume (µl) de l’échantillon] / 1 000 (ng/µg). Calculer l’activité spécifique à l’aide de la formule : pmol par µl de colorant/µg / µl d’ADNg.
         NOTE : par exemple, pour 0,5 µg d’ADN d’entrée, le rendement doit être 8 à 11 µg et l’activité spécifique (pmol/µg) devrait être de 25 à 40 pour la Cyanine-3 portant l’étiquette échantillon et 20 à 35 pour l’échantillon étiqueté Cyanine-5.
   3. Pour préparer la quantité d’hybridation Master Mix requis pour le format « microarray » en cours d’utilisation, mélanger les réactifs suivants : 50 µL Cot-1 ADN (1,0 mg/ml), 52 µL 10 x aCGH Agent de blocage et µl 260 2 x tampon d’hybridation HI-tr/min.
   4. Ajouter le volume approprié de l’hybridation Master Mix dans le tube de 1,5 ml exempte de RNase qui contient l’ADNg marqué pour obtenir le volume total requis pour le format « microarray » en cours d’utilisation. Par exemple, pour 1 paquet microarray, assurez-vous que le volume final de chaque réaction 362 µl.
   5. Mélanger l’échantillon de pipetage de haut en bas, puis rapidement centrifuger à 14 000 x g et incuber pendant 3 min à 95 ° C et à 37 ° C pendant 30 min.
5. Assemblée des chambres et l’hybridation
   1. Charger une lame propre joint dans la base de la chambre avec l’étiquette de joint vers le haut et alignée sur la section rectangulaire de la base de la chambre. Veiller à ce que la diapositive joint soit alignée avec la base de chambre et qu’il n’est pas entrouverte.
   2. Diluer le mélange témoin hybridation sur le puits de joint, en s’assurant que l’échantillon est répartie uniformément.
   3. Posez une diapositive « microarray » sur la diapositive de joint évaluer que la paire "sandwich" est correctement alignée. Ensuite, assembler la chambre de réaction, mettre le couvercle sur les diapositives de sandwich et de main-serrer la pince.
   4. S’assurer que les diapositives mouiller en tournant la chambre Assemblée verticalement. Assurez-vous que les bulles ne sont pas présents dans la salle. Si nécessaire, tapez sur l’Assemblée sur une surface dure pour déplacer les bulles stationnaires.
   5. Mettre les chambres à glissière assemblés dans un rack de rotator mis en place pour faire tourner à 20 tr/min. Mettre la chambre de l’hybridation dans une étuve et effectuer l’hybridation à 65 ° C pendant 24 ou 40 h selon le format « microarray » en cours d’utilisation.
6. Microarray lavage et balayage
   1. Chambre d’hybridation sortir de four et il submerge dans le tampon de lavage 1. Procéder à son démontage.
   2. Retirer la glissière de microarray et mettre rapidement en une grille coulissante dans le tampon de lavage 1 à température ambiante.
   3. Laver la lame de tableau pendant 5 min avec agitation (l’aide d’une puce et un agitateur magnétique). Ajuster la vitesse d’agitation dans un cadre de 4 (vitesse moyenne), pour obtenir le bon, mais un mélange pas trop vigoureuse.
   4. Laver la lame de tableau dans le tampon de lavage 2 pour brasser de s 90. Récupérer doucement la lame de la mémoire tampon (il doit sortir sec) et la placer dans un support de diapositives à l’aide d’un protecteur de lame.
   5. Charger la diapositive dans le scanner de tableau et effectuer l’analyse conformément aux instructions du fabricant de la gamme.
   6. Analyser les résultats en utilisant le logiciel d’Extraction fourni avec le scanner utilisé conformément aux instructions du fabricant (V.9.1.3.1).

3. WES protocole

1. Enrichissement de la cible
   1. Le dsDNA BR dosage permet de déterminer la concentration de l’échantillon ADNg selon le protocole de l’instrument.
   2. Diluer 5 µg de haute qualité double brin ADN avec 1 x tampon faible TE dans un tube de liaison faible de 1,5 mL dans un volume total de 50 µL.
   3. Mettre en place un sonicateur et mettre un microtube dans la station de chargement et de déchargement selon les instructions du fabricant. Garder le bouchon sur le tube.
   4. Lentement, transférer l’échantillon d’ADN de 50 µl à travers le septum avant fractionnement sans introduire des bulles.
   5. L’ADN selon les paramètres suggérés du fabricant de la sonicateur de cisaillement et d’évaluer la qualité à l’aide d’un Bioanalyzer selon les instructions du fabricant. La cible de la taille de fragment d’ADN est de 150 à 200 bp.
2. Réparation de l’ADN se termine
   1. Préparer le mélange de réaction de réparation fin en mélangeant 40 µL de fin mélange de réparation enzymatique avec 10 µL de fin réparation Oligo Mix. Mélangez bien sur un vortex.
   2. Incuber les échantillons à 20 ° C pendant 30 min dans un thermocycleur et puis tenez-les à 4 ° C. Ne pas utiliser un couvercle chauffé.
   3. Ajouter 50 µL du mélange réaction réparation fin préparé à l’étape 3.2.1 à chaque 50 µL cisaillé échantillon d’ADN bien. Mélangez bien en pipettant également de haut en bas ou par agitation douce.
   4. Purifier l’échantillon avec un kit de purification de perles basés selon le protocole du fabricant.
3. Polyadénylation des extrémités 3'.
   1. Ajouter 20 µl du mélange réactionnel dA-Tailing à chaque échantillon d’ADN purifié, réparé à la fin (environ 20 µL).
   2. Mélangez bien en pipettant également de haut en bas ou par agitation douce.
   3. Incuber les échantillons à 37 ° C dans un thermocycleur et puis maintenez-le à 4 ° C. Ne pas utiliser un couvercle chauffé.
4. Ligature de l’adaptateur de pré-saisie d’indexation.
   1. Ajouter 5 µL de ligature Master Mix pour chaque échantillon d’ADN A queue.
   2. Ajouter 5 µL de la solution d’Index pré-saisie appropriée à chaque échantillon.
   3. Sceller les puits et homogénéiser au vortex pour 5 s. brièvement centrifuger les échantillons.
   4. Incuber les échantillons à 20 ° C pendant 15 min dans un thermocycleur et puis maintenez à 4 ° C. Ne pas utiliser un couvercle chauffé.
   5. Purifier les échantillons avec un kit de purification de perles basés selon le protocole du fabricant.
5. Amplification de la bibliothèque indexée.
   1. Préparer le volume approprié de mélange de réaction PCR pré-saisie en mélangeant 1 µL du mélange de Primer et 25 µL du mélange réactionnel PCR. Mélangez bien sur un vortex.
   2. Combiner les 26 µL du mélange dans le puits distincts d’une PCR amplification et 24 µL de chaque échantillon de bibliothèque ADNg indexée.
   3. Exécuter un programme PCR avec les étapes suivantes : 98 ° C pendant 2 min, 5 cycles à 98 ° C pendant 30 s, 60 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 1 min et une extension finale à 72 ° C pendant 10 min. maintenir les échantillons à 4 ° C.
   4. Purifier l’échantillon avec un kit de purification de perles basés selon le protocole du fabricant.
   5. Évaluer la qualité avec un Bioanalyzer selon le protocole du fabricant.
6. Mise en commun des échantillons d’ADN indexés pour l’hybridation
   1. Pour chaque pool de réaction de capture, combiner le volume approprié de chaque échantillon de bibliothèque ADNg indexée dans un puits d’une plaque PCR. Par exemple, pour l’homme ou souris All-Exon capturer bibliothèques, combiner 8 bibliothèques par pool à l’aide de 187,5 ng de chaque bibliothèque indexée. S’assurer que chaque pool de réaction de capture finale contienne 1 500 ng d’ADNg indexée.
   2. Réduire le volume de chaque bien de < 7 µL à l’aide d’une pompe à vide. Évitez complètement sécher l’échantillon.
   3. Ajouter suffisamment d’eau exempte de nucléase à chaque piscine ADNg concentré pour faire le volume final bien 7 µL et vortex puis la plaque contenant ADNg vigoureusement pendant 30 s. centrifugeuse dans une essoreuse centrifugeuse ou mini-plaque pour recueillir le liquide au fond des puits.
7. Hybridation ADNg piscines de bibliothèque à la bibliothèque de Capture
   1. Pour chaque pool d’ADNg 7 µL indexé, ajouter 9 µl du mélange de blocage. Pipetter en haut et en bas pour mélanger.
   2. Cap des puits, transférer la plaque scellée contenant ADNg pour le thermocycleur et incuber à 95 ° C pendant 5 min, puis maintenez-le à 65 ° C. Assurez-vous que la plaque est maintenue à 65 ° C pendant au moins 5 min.
   3. Préparer la dilution appropriée de l’édifice de la RNase, sur la base de la taille de la bibliothèque de capture (dilution à 10 % pour < 3,0 Mo et 25 % dilution pour les bibliothèques > les bibliothèques 3,0 Mo).
   4. Selon la taille de Capture de bibliothèque, combiner la quantité appropriée de la bibliothèque de Capture et diluer la solution bloc RNase dans une plaque PCR gardée sur glace. Mélangez bien en pipettant également. Pour les bibliothèques de capture < 3,0 Mo, utilisation 2 µl de bibliothèque et 5 µL de RNase bloc à dilution à 10 %. Pour les bibliothèques de capture > 3,0 Mo, l’utilisation de 5 µl de bibliothèque et 2 µl de RNase bloc à dilution de 25 %.
   5. Ajouter 37 µL de tampon d’hybridation dans chaque cupule contenant 7 µL du mélange de Capture Library/RNase bloc. Bien mélanger en pipetage et centrifuger brièvement la plaque contenant le mélange.
   6. Maintenir la plaque de piscine ADNg à 65 ° C tout en utilisant une pipette multi-canaux pour transférer l’ensemble µL 44 du mélange de la bibliothèque de Capture de l’étape 3.7.5 à chaque échantillon puits de la plaque de piscine ADNg. Bien mélanger en pipettant également lentement monter et descendre de 8 à 10 fois.
   7. Sceller les puits avec les couvercles de barrette bombé. Assurez-vous que tous les puits sont complètement étanches. Placer un tapis de compression sur la plaque de la PCR dans le thermocycleur.
   8. Incuber le mélange d’hybridation pour 24h à 65 ° C. Remarque : Les échantillons peuvent être hybridées jusqu'à 72 h, mais doivent vérifier que l’hybridation étendue ne provoque pas d’évaporation vaste dans les puits d’échantillon.
8. Préparation des billes magnétiques-streptavidine
   1. Préchauffer le tampon de lavage 2 à 65 ° C dans un bloc de baignoire ou de la chaleur de l’eau.
   2. Resuspendre vigoureusement les billes magnétiques de streptavidine sur un vortex. Les billes magnétiques s’installer pendant le stockage.
   3. Pour chaque échantillon d’hybridation, ajouter 50 µL des suspension perles aux puits d’une plaque PCR.
   4. Laver les perles et les remettre en suspension dans 200 µL de tampon de liaison.
9. Capture de l’ADN hybride billes de streptavidine.
   1. Évaluer et noter le volume de solution d’hybridation qui reste après le 24 h d’incubation.
   2. Maintenir la plaque de l’hybridation à 65 ° C et utiliser une pipette multicanaux pour transférer la totalité du volume (environ 60 µL) de chaque mélange d’hybridation dans les puits de la plaque contenant 200 µL de streptavidine lavé perles. Bien mélanger en pipettant également lentement monter et descendre de 3 à 5 fois.
   3. Boucher les puits et incuber la plaque de capture sur une table de mixage Nutator ou équivalent pendant 30 min à température ambiante. Veillez à ce que les échantillons sont correctement mélange dans les puits.
   4. Brièvement, centrifuger la plaque de capture dans une essoreuse centrifugeuse ou mini-plaque.
   5. Mettre la plaque de capture dans un séparateur magnétique de collecter les perles de la suspension. Retirer et jeter le surnageant.
   6. Remettre en suspension les perles dans 200 µL de tampon de lavage 1. La composition de pipetage de haut en bas jusqu'à ce que les perles sont entièrement remises en suspension.
   7. Centrifuger brièvement dans une essoreuse centrifugeuse ou mini-plaque.
   8. Mettre la plaque dans le séparateur magnétique.
   9. Attendez que la solution effacer, puis retirer et jeter le surnageant.
10. Capturer après traitement pour multiplexé séquençage des échantillons
    1. Préparer le volume approprié de mélange réactionnel PCR en mélangeant ce qui suit : l’eau sans nucléase 9 µL, 25 µL Master Mix et 1 µL Amorce mélanger selon le nombre d’amplification. Mélangez bien à l’aide d’un agitateur Vortex et rester sur la glace.
    2. Pour chaque réaction d’amplification, placez 35 µL du mélange réactionnel PCR de l’étape 3.10.1 dans les puits d’une plaque PCR.
    3. Pipetter chacun des échantillons perle lié aux saisies bibliothèque piscine haut et en bas pour que la suspension de la perle soit homogène.
    4. Ajouter 15 µL de chaque suspension de perle de piscine bibliothèque capturés au milieu réactionnel PCR approprié. Bien mélanger en pipettant également, jusqu'à ce que la suspension de la perle est homogène.
    5. Placez la plaque préparée au point 3.10.2 dans un thermocycleur et exécutez le programme d’amplification PCR suivant : 98 ° C pendant 2 min, 8 à 11 cycles à 98 ° C pendant 30 s, 60 ° C pour 30 s et 72 ° C pendant 1 min, suivi d’une extension finale à 72 ° C pendant 10 min. Maintenir les échantillons à 4 ° C.
    6. Purifier l’échantillon avec une purification de perles basés selon le protocole du fabricant.
    7. Évaluer la qualité avec un Bioanalyzer selon le protocole du fabricant.
11. Préparer les échantillons pour multiplexés séquençage
    Remarque : Les échantillons enrichis finales contiennent des piscines de 8 ou 16 bibliothèques indexées, basée sur la taille de la bibliothèque de Capture et résultant de pré-saisie mise en commun de la stratégie. Le nombre total de bibliothèques indexées qui peuvent être multiplexées dans une ruelle de séquençage de l’unique est déterminé par les spécifications de sortie de la plate-forme utilisée, ainsi que la quantité de données de séquençage requises pour la bibliothèque de Capture.
    1. Calculer le nombre d’index qui peuvent être combinés par voie de circulation, selon la capacité de la plate-forme. Le nombre total de bibliothèques indexées qui peuvent être multiplexées dans une ruelle de séquençage de l’unique est déterminé par les spécifications de sortie de la plate-forme utilisée, ainsi que la quantité de données de séquençage requises pour la bibliothèque de Capture. Par exemple, pour la bibliothèque de v5 Exon tous les humains, les données de séquençage recommandé par bibliothèque indexé est de 4 Go et les données de séquençage recommandé par pré-saisie Pool est 32Go (indice de 8 piscines).
12. Les bibliothèques de la séquence.
    1. Charger les bibliothèques sur la prochaine génération de plates-formes de séquençage de choix et d’effectuer le séquençage exécuter selon les spécifications de l’appareil.
13. Analyser les données de séquençage de l’exome.
    1. Exécuter le pipeline et le logiciel de choix pour les appels de base. Par exemple, utilisez Stampy de carte lectures²⁰, de supprimer les doublons avec Picard (http://broadinstitute.github.io/picard/) et d’identifier des polymorphismes de nucléotides simples et insertion ou suppression de bases (indels) avec Platypus²¹. Filtrer les variantes synonymes et ceux observés à une fréquence de l’allèle < 5 % et comparer des données avec celles d’exomes parental afin d’identifier les variantes de novo .

4. préparation d’ADN plasmidique pour In Utero électroporation

1. Concevoir plusieurs ARN en épingle à cheveux courts (interférents) ciblant la séquence codante ou la région 3' UTR des gènes candidats comme décrit plus haut²².
2. Pour empêcher les éloignent effets tester interférents spécificité en recherche BLAST contre les bases de données à l’aide de méthodes standard. Exclure les interférents affichant plus de 50 % de la complémentarité avec d’autres gènes de rat.
3. Oligonucléotides clone recuit dans un vecteur mU6-pro comme décrit précédemment²³.
4. Purifier l’ADN avec un Maxi-prep conformément aux instructions du fabricant de plasmide et faire une concentration finale de 3 µg/µL.
5. Aliquote 20 µl d’ADN (0,5 mg/ml pCAGGS-GFP soit seul ou avec 1,5 mg/ml de shARN construire) et ajouter 2 µL de Fast vert colorant (2 mg/mL) afin de permettre un contrôle visuel de l’injection.

5. in Utero électroporation

1. Intervention chirurgicale
   1. Anesthésier E15.5 rates gravides (E0 a été définie comme le jour de la confirmation de plug vaginal sperme-positif), en utilisant une combinaison d’un mélange de kétamine/xylazine (0,1 à 0,01 mg / corps poids, respectivement), qui est donné par une voie intrapéritonéale injection pour l’induction anesthésique.
   2. Assurez-vous que l’animal est complètement anesthésié en observant la disparition du réflexe pincée orteil.
   3. Raser le bas du ventre de l’animal avec la pince pour enlever la fourrure. Désinfecter la peau à l’aide de scrubs de povidone-iode et d’alcool à 70 %. Pommade de vétérinaire sur les yeux pour prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie.
   4. Placez l’animal sur une source de chaleur et de mettre un drap stérile (avec une fenêtre ouverte de 4 à 5 cm au milieu) sur le site d’incision. Porter des masques faciaux, blouse de laboratoire, chapeaux et gants chirurgicaux stériles. Maintenir la stérilité jusqu'à la fin de la chirurgie.
   5. À l’aide de ciseaux pointus pour faire une incision verticale (2 à 2,5 cm) de la peau le long de la ligne médiane de l’abdomen caudal et puis faire une incision de la paroi musculaire sous la peau — également de 2,5 cm, le long de la ligne médiane.
   6. Soigneusement exposer une corne utérine de la cavité abdominale. Baisse de 37 ° C préchauffé solution saline normale pour hydrater les embryons. Garder l’utérus humide en permanence.
2. Injection d’ADN et d’électroporation
   1. Une des cornes utérines tenir doucement avec une pince le phoque annelé et pousser un embryon à la paroi utérine. Maintenir l’embryon dans une main et avec l’autre main insertion avec soin capillaires en verre 1 mm de la ligne médiane dans le ventricule latéral gauche (2-3 mm de profondeur) et injecter environ 1 µL d’ADN avec Fast Green pour permettre une surveillance visuelle de l’injection à l’aide une microinjector.
   2. Laisser tomber une solution saline normale à la surface d’électrodes² 3 x 7 mm. Placer l’électrode positive stérile du côté injecté (ventricule latéral gauche) et l’électrode négative stérile sur le ventricule droit. Livrer 5 impulsions électriques à intervalles de 950 ms avec une pédale de pied (4000 condensateur mF facturés à 40 V avec un électroporateur).
3. Procédures d’électroporation post
   1. Remettre les cornes utérines de la cavité abdominale, ajouter des gouttes de solution saline normale de la cavité pour permettre des embryons positionnés plus naturellement et pour tenir compte des pertes de fluides peropératoire.
   2. Fermer la paroi musculaire abdominale avec des sutures chirurgicales résorbables, puis la peau à l’aide d’une maille simple-interrompu.
   3. Remettre le rat dans la cage et surveiller l’animal jusqu'à ce qu’il ressort de l’anesthésie.
   4. Pour la gestion de la douleur administrer buprénorphine (0,03 mg/kg) à l’animal par une injection sous-cutanée tous les 8-12 h, pendant 48 h.

6. préparation des échantillons de cerveau

1. Méthode de fixation
   1. Sacrifier l’enceinte rat 5 jours après l’intervention chirurgicale avec anesthésie de gaz (isoflurane) suivie d’une rapide dislocation cervicale.
   2. Pratiquer une incision verticale de ré-ouvrir la cavité abdominale.
   3. Exposer les cornes utérines, enlever l’embryon de l’utérus et décapiter les à l’aide de ciseaux pointus.
   4. Enlever le cerveau avec un minimum de dommages au tissu : à l’aide de ciseaux pointus, faire une petite incision le long de la partie postérieure (cervelet) / axe antérieur (bulbes olfactifs) de la tête pour percer la peau et le crâne, puis à l’aide d’une paire de pinces, Décollez le crâne d’exposer la cerveau et supprimez-la à l’aide d’une petite spatule.
   5. Immerger le cerveau pendant la nuit à 4 ° C dans un 4 % paraformaldéhyde à 1 x Phosphate Buffered Saline (PBS).
2. Coupes de cerveau
   1. Laver le cerveau dans du PBS 1 x pendant 10 min.
   2. Incorporer des cerveaux dans 4 % d’agar en plastique intégrant des moules.
      1. Préparer 50 mL de gélose de 4 % en solution 1 PBS x pour l’enrobage 5 cerveaux embryonnaires. Faire en sorte qu’agarose dissous est à pas plus de 50 ° C.
   3. Garder le cerveau en gel d’agarose à polymériser pendant au moins 1 h à 4° C. Enlever l’excès d’agarose autour du cerveau.
   4. Coller le cerveau à la plaque de base vibratome, axé sur l’axe antérieur/postérieur du cerveau est perpendiculaire à la lame. Attendre quelques minutes que la colle sécher et placer la plaque avec le cerveau collé dans la chambre vibratome.
   5. Remplir le vibratome avec PBS 1 x. Tranche de 100 µm de coupes épaisses.
   6. Transfert des tranches de cerveau sur des lames, enlever l’excès de liquide, ajouter quelques gouttes de milieu de montage et placer une lamelle sur le dessus de cerveaux

7. confocal imagerie et analyse Quantitative

1. Laissez le sécher moyen de montage pendant la nuit avant d’imagerie. Sections d’image à 10 X sur un microscope confocal à balayage laser.
2. À l’aide de logiciels pour l’analyse quantitative d’image, convertir l’image en 8 bits, sélectionnez un représentant GFP fluorescent cellules positives et définissez manuellement la forme. Pour ce faire, cliquez sur « Devis » et dessiner la bordure de la cellule à l’aide de l’outil de sélection à main levée. Dans cette façon le diamètre et le seuil d’intensité de la cellule sont automatiquement conservés par le logiciel.
3. Cliquez sur « Rechercher les cellules » qui permet au logiciel de localiser les cellules transfected dans le cortex. Puis, le cas échéant, supprimer manuellement des faux positifs.
4. Diviser toute l’épaisseur du cortex dans 8 domaines d’intérêt normalisés dans différentes sections. Pour ce faire, cliquez sur « Outil de la région », sélectionnez 8 « région Stripes » où le premier (1er) et le dernier (8) bandes correspondent respectivement à la VZ et vers le haut du CP. Cliquez sur « Appliquer » pour permettre au logiciel de compter la position relative des cellules transfectée de GFP dans le cortex entier. Enfin cliquez sur « Enregistrer la Quantification » pour exporter les données dans un fichier Excel pour l’analyse.

Representative Results

La stratégie expérimentale conçue pour identifier de nouveaux gènes causatifs MCD est récapitulée dans la Figure 1.

En effectuant la CGH-array dans une cohorte de 155 patients présentant des anomalies de développement de cerveau combinant variablement PNH (Figure 2 a), dysgénésie du corps calleux, colpocéphalie, hypoplasie du cervelet et polymicrogyria associées à l’épilepsie, ataxie et troubles cognitifs, nous avons identifié une délétion critique minimale de 1,2 Mo chez en 6 q 27 partagée par 12 patients (Figure 2 b)²¹. La région génomique contient quatre gènes connus (THBS2, PHF10, TCTE3 et DLL1) et deux prédit gènes (WDR27 et C6orf70) (Figure 2 b).

En parallèle de CGH-array, WES analyse dans 14 patients atteints d’HPN bilatéraux isolé et aucune analyse des Variations de nombre de copie a été réalisée, identifier un patient présentant une mutation de novo (c.752T > r : pIle250Asn) dans les prédites (gène de C6orf70 Numéro d’accession GenBank NM_018341.1) (Figure 3).

Pour confirmer que la mutation identifiée dans C6orf70 avait eu un rôle causal dans la PNH et étudier si Sim1 des autres gènes de la cartographie en 6 q 27 peut-être influer sur le phénotype, leur rôle in vivo sur la migration neuronale a été explorée en utilisant le dans l’utérus par l’ARN-knockdown approche^23,24 pour faire taire leur expression dans des progéniteurs neuronaux corticale de rat. Seulement les gènes exprimés dans le cortex de rat en développement, PHF10, C6orf70 et DLL1, ont été mis à l’essai (Figure 4 a). Épingle à cheveux courts différents ARN (interférents) ont été générés en ciblant les séquences codantes de ces trois gènes. Interférents ont été ensuite mis en neuroprogenitors dans le néocortex de rat par in utero électroporation embryonnaire jour 15 (E15), lorsque les neurones s’est engagés à couches corticales supérieures sont générés. Protéine fluorescente verte a été utilisée comme journaliste de transfection. Répartition des cellules positives GFP a été examinée 5 jours après l’électroporation. Précipitation de Dll1 et Phf10 a entraîné un léger retard de la migration neuronale radial (données non présentées), alors qu’avec facultés affaiblies de la migration neuronale et a donné lieu au développement de nodules hétérotopiques hautement de choc des C6orf70 réminiscent de celles observées chez les Flna modèle démontable (Figure 4 b)²⁴. À l’inverse, transfections avec le shARN inefficace de discordance C6orf70 eu aucun impact évident sur la migration neuronale (Figure 4 b).

Figure 1 : Flux de travail pour l’identification du roman identification de gènes MCD. Représentation schématique des différentes approches qui peut être utilisé pour identifier de nouveaux gènes pathogènes. Cases colorées en jaune représentent les approches décrites dans le présent document. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : destructions en 6 q 27 provoquent un développement anormal du cerveau avec l’HPN. (A) Patient 2. Coronale pondérée T2 (panneau de gauche) et les sections pondérée T1 axiales (panneau de droite) montrant la PNH qui tapissent la paroi du lobe temporal gauche (pointe de flèche blanche et noire) ci-dessous un cortex insulaire déplié. Patient (B) 11. Coupe coronale pondérée T1, montrant bilatéraux nodules hétérotopiques le long des murs des cornes temporelles (flèches blanches). (C) Patient 12. Section coronale pondérée T2. Sur la gauche, HPN est encore visible (flèche noire) et les ventricules sont dilatées. (D) Représentation schématique des destructions de la région en 6 q 27 identifiés chez les patients PNH tableau-CGH (partie supérieure). Les lignes horizontales, en pointillés représentent les destructions identifiées chez des patients. La région de la taille de la minimale critique supprimé est également indiquée et contient quatre gènes connus : THBS2, PHF10, TCTE3 et DLL1 et deux gènes prédits : WDR27 et C6orf70 (partie supérieure). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Résultats de séquençage. ( ) T2 pondéré coupe axiale montrant la PNH bilatéral dans les cornes frontales (flèches blanches) chez les patients porteurs de la c.752T > une mutation dans C6orf70. (B) Sanger sequencing montrant que la mutation identifiée par WES a eu lieu de novo. La position de la mutation est indiquée par des flèches noires. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Analyse de l’expression des gènes localisés dans la région critique minimale en 6 q 27 et C6orf70-knockdown modifie radiale migration des neurones corticaux. (A) RT-PCR Quantitative montrant l’expression des gènes contenus dans la région critique en 6 q 27 dans le cortex cérébral de rat. Cyclophiline A a été utilisé pour la normalisation. (B) représentant néocorticales coronales sections du cerveau de rat E20 5 jours après l’électroporation avec soit Green Fluorescent Protein construire seul (contrôle) ou combiné avec les shARN ciblant les C6orf70 coding sequence (C6orf70-shCDS) ou avec l’incompatibilité relative inefficace de la construire (C6orf70-shCDSmm). Flna -knockdown (FLNA-shCDS) a été utilisé comme contrôle de la migration neuronale avec facultés affaiblies. Électroporation in utero avec le FLNA-shCDS C6orf70-shCDS ou provoquée par l’arrestation de cellules de GFP-positives au sein de la zone ventriculaire (VZ) (flèches blanches), tandis que les cellules exprimant GFP, seul ou en combinaison avec l’incompatibilité de construire n’a pas altéré migration neuronale. Barreaux de l’échelle = 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

MCDs sont des causes importantes de la déficience intellectuelle et représentent 20 à 40 % de l’enfance pharmacorésistant épilepsie^1,2. Intérêt pour MCDs a considérablement augmenté ces dix dernières années grâce à deux facteurs principaux. Le premier est l’amélioration dans d’imagerie cérébrale (en particulier l’IRM), qui permet de visualiser de nombreuses malformations du cerveau qui n’étaient pas précédemment reconnues de médecins et de scientifiques. L’autre est l’évolution des outils génétiques qui ont permis l’identification de nombreux gènes causatifs MCD. Cela a considérablement amélioré notre connaissance des mécanismes qui sous-tendent la fonction et le développement du cerveau et prévoyait une consultation génétique plus précis.

Dans le passé, les chercheurs ont concentré leurs efforts principalement sur l’identification du gène responsable, laissant la conception de tests fonctionnels pour clarifier leur rôle dans le développement du cerveau à des stades avancés. C’est devenu plus difficile en raison de la progression de l’étude de maladies génétiques rares, récurrentes pour des troubles sporadiques plus courants pour quel gène traditionnel trouver des méthodes ne se prêtent pas. Les approches actuelles pour identifier les gènes souvent permettent l’identification des régions relativement importantes du génome contenant de nombreux gènes (CGH-array) ou plusieurs variantes dans un certain nombre de gènes candidats qui sont difficiles à valider (WES ou WGS).

Approches de CGH-array et WES (ou WGS) ont élargi le spectre de mutation de nombreux troubles génétiques. Néanmoins, certaines limites critiques restent encore. Par exemple, CGH-array a besoin d’ADN de qualité et ne parvient pas à identifier les translocations équilibrées ou petites destructions/duplications, y compris celles impliquant un ou plusieurs exons d’un seul gène. Pour contourner ce problème, CGH-array peut être effectué à une résolution supérieure à sonde conventionnelle espacement (p. ex. à l’aide de 1 M kit de CGH-array) ou substitué avec analyse de SNP-tableau. WES a souvent ne couvre pas les grandes régions intragéniques et ne parvient pas à identifier les mutations profondes intronic. En outre, parfois la couverture peut être trop faible pour identifier les mutations causatifs (surtout dans le cas de mutations avec faible pourcentage de mosaïcisme). Une autre étape critique pour WES est que l’analyse des données et filtrage encore besoin d’un effort considérable. Pour augmenter la couverture de WES, le nombre de patients en une seule expérience peut être réduit ou trousses de capture différentes peuvent être utilisées en même temps.

IUE est l’approche la plus appropriée pour analyser l’impact de l’inactivation de gènes sur la migration neuronale. Toutefois, les enquêtes sur les autres étapes de la corticale du développement, tels que la neurogenèse et maturation neuronale, sont gênées par certaines limitations techniques. En effet, IUE effectuée avant E13 est souvent infructueuses, alors que les enquêtes aux stades ultérieurs sont limités par le taux élevé de mortalité postnatale associé à cette procédure. En outre, gène-knockdown efficacité peut-être différer chez les embryons d’électroporation menant à une hétérogénéité phénotypique considérable.

Dans l’ensemble, le présent protocole a quatre grandes étapes critiques. Bien qu’il ne fait pas partie du protocole décrit dans le présent document, il faut souligner que la première étape fondamentale à prendre en compte est la sélection des patients à s’inscrire à ces études. En effet, le processus d’identification de nouveaux gènes MCD exige des enquêtes cliniques et d’imagerie dans une cohorte de patients pour lesquels le phénotype doit être aussi homogène que possible. Collecte des patients atteints de phénotype très homogène augmente les chances d’identifier des mutations dans un gène donné causatifs. Toutefois, le nombre minimal de patients à s’inscrire à ces études pour réussir est difficile à prévoir, puisque cela dépend grandement le taux de mutation des gènes différents. Par exemple, pour les gènes tels que FLNA, qui subit une mutation dans 100 % des cas familiaux de PNH bilatérale liée à le X et dans 26 % des cas sporadiques, le nombre de patients nécessaires afin d’identifier les occurrences multiples du gène pourrait être relativement faible. À l’inverse, pour les gènes avec des taux de mutation faible, le nombre de patients à être projeté est plus élevé. Par exemple, dans le cas de C6orf70, nous avons été en mesure d’identifier une mutation causative uniquement sur le dépistage de 64 patients (14 par WES et 50 par Sanger classique séquençage)¹⁶, estimer un taux de mutation de ce gène d’environ 1,5 %. La deuxième étape critique est l’exclusion des mutations dans les gènes connus de MCD afin d’identifier de nouveaux gènes causatifs. Grâce à l’avènement des nouvelles technologies de séquençage de génération suivante, dépistage de la mutation des gènes connu et candidat peut-être désormais être effectuée en une seule expérience. Cependant, des variantes appropriées de filtrage devraient servir à éviter la présence d’un trop grand nombre de faux positifs à confirmer expérimentalement et pour filtrer les éventuelles mutations causatifs. En effet, le nombre de candidats/variantes de gènes est particulièrement élevé dans les expériences de WES. Si l'on soupçonne l’implication d’un gène donné, dépistage mutation devrait également être complété par analyse MLPA, d’exclure des microdélétions ou inframicroscopiques. Le troisième point critique est le fait que les réarrangements chromosomiques sont fortement influencées par l’emplacement du point d’arrêt. Dans ce contexte, il convient d’exclure, à la mesure du possible, la perturbation ou le déplacement des éléments cis-régulateurs distales de gènes non inclus dans la suppression ou de double emploi. Enfin, des expériences in vivo Arni supposent que les gènes jouent un rôle direct dans la migration neuronale pendant les étapes embryonnaires. Toutefois, l’étiologie de la MCD, y compris la PNH, est hétérogène et l’approche dans l’utérus peut échouer détecter les effets des gènes impliqués dans les étapes du développement dont la survie neuronale prolifération ou cellule. En outre, la faible complexité du cerveau rongeur pourrait masquer l’impact de la précipitation ou la surexpression d’un gène candidat donné, qui peut être plus évidente dans le cerveau humain.

Nous pensons que l’intégration de la génomique et in vivo études fonctionnelles contribuera à développer de nouveaux outils de diagnostic pour l’identification de nouveaux gènes MCD. Cette stratégie pourrait également fournir de nouveaux modèles animaux pour tester des cibles thérapeutiques et de comprendre la physiopathologie de la MCD, qui ont jusqu'à présent été limités par l’absence de modèles expérimentaux et un accès limité aux tissus du cerveau de patients affectés. Déchiffrer les voies moléculaires qui sont associés à la MCD troubles fournira aussi précieux de nouvelles informations sur le développement du cerveau physiologique en général.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Picospritzer III	Parker Hannifin Corp	P/N 051-0500-900	Intracellular Microinjection Dispense Systems
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252	Fast green allow visual monitoring of the injection
BTX ECM 830 electroporator	BTX Harvard Apparatus	45-0002	The ECM 830 is a Square Wave Pulse generator designed for in vitro and in vivo applications
Microtome HM 650 V	Microm	10076838	Microtome HM 650 V vibratome 240V 50/60Hz with vibrating blade
FluoView 300	Olympus		The Olympus FluoViewTM 300 is a point-scanning, point-detection, confocal laser scanning microscope designed for biology research application
eCELLence software	Glance Vision Technologies		eCELLence is software designed for the quantitive analysis of cell migration
Agilent Microarray Scanner Bundle			Array slides
for 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K or 8 x 15K	Agilent	Agilent p/n G4900DA, G2565CA or G2565BA
for 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K or 8 x 60K	Agilent	Agilent p/n G4900DA or G2565CA
Hybridization Chamber, stainless	Agilent	Agilent p/n G2534A	Chamber for array CGH hybridization
Hybridization Chamber gasket slides, 5-pack			Gasket for array CGH hybridization
for 1-pack microarrays or	Agilent	Agilent p/n G2534-60003
for 2-pack microarrays or	Agilent	Agilent p/n G2534-60002
for 4-pack microarrays or	Agilent	Agilent p/n G2534-60011
for 8-pack microarrays	Agilent	Agilent p/n G2534-60014
Hybridization oven	Agilent	Agilent p/n G2545A
Hybridization oven rotator for Agilent Microarray Hybridization Chambers	Agilent	Agilent p/n G2530-60029
Thermal cycler with heated lid	Agilent	Agilent p/n G8800A or equivalent	Termal cycler for incubations
1.5 mL RNase-free Microfuge Tube	Ambion	p/n AM12400 or equivalent	Microcentrifuge
Magnetic stir bar	Corning	p/n 401435 or equivalent	Instrument for stirring
Qubit Fluorometer	Life Technologies	p/n Q32857	Instrument for DNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit, for use with the Qubit fluorometer	Invitrogen	p/n Q32850	Kit for Qubit fluorometer
UV-VIS spectrophotometer	Thermo Scientific	NanoDrop 8000 or 2000, or equivalent	Instrument for DNA quantification
P10, P20, P200 and P1000 pipettes	Pipetman or equivalent		DNA dispensation
Vacuum Concentrator	Thermo Scientific	p/n DNA120-115 or equivalent	Instrument to concentrate DNA
SureTag Complete DNA Labeling Kit	Agilent	p/n 5190-4240	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
Purification Columns (50 units)	Agilent	p/n 5190-3391	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
AutoScreen A, 96-well plates	GE Healthcare	p/n 25-9005-98	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
GenElute PCR Clean-Up Kit	Sigma-Aldrich	p/n NA1020	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
Human Genomic DNA		p/n G1521	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
For CGH microarrays:	Promega	(female) or p/n G1471 (male)	Array CGH control DNA
For CGH+SNP microarrays:	Coriell	p/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878, or NA18579	Array CGH control DNA
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer Kit or	Agilent	p/n 5188-5226	Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and	Agilent	p/n 5188-5221	Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2	Agilent	p/n 5188-5222	Array CGH hybridization and wash
Stabilization and Drying Solution	Agilent	p/n 5185-5979	Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit	Agilent	p/n 5188-5220 (25) or p/n 5188-5380 (100)	Array CGH hybridization and wash
Human Cot-1 DNA	Agilent	p/n 5190-3393	Array CGH hybridization and wash
Agilent C scanner	Agilent		Scanner for array CGH slides
SureSelect XT2 Reagent Kit			Kit for target enrichment
HiSeq platform (HSQ), 16 Samples	Agilent	p/n G9621A
HiSeq platform (HSQ), 96 Samples	Agilent	p/n G9621B
HiSeq platform (HSQ), 480 Samples	Agilent	p/n G9621C
MiSeq platform (MSQ), 16 Samples	Agilent	p/n G9622A
MiSeq platform (MSQ), 96 Samples	Agilent	p/n G9622B
MiSeq platform (MSQ), 480 Samples	Agilent	p/n G9622C
DNA 1000 Kit	Agilent	p/n 5067-1504	Kit for the separation, sizing and quantification of dsDNA fragments from 25 to 1000 bp.
High Sensitivity DNA Kit	Agilent	p/n 5067-4626	Kit for analysis of fragmented DNA or DNA libraries.
AMPure XP Kit			Kit for automated PCR purification.
5 mL	Agencourt	p/n A63880
60 mL	Agencourt	p/n A63881
450 mL	Agencourt	p/n A63882
Dynabeads MyOne Streptavidin T1			Isolation and handling of biotinylated nucleic acids
2 mL	Life Technologies	Cat #65601
10 mL	Life Technologies	Cat #65602
Quant-iT dsDNA BR Assay Kit, for the Qubit fluorometer			DNA quantification
100 assays, 2-1000 ng	Life Technologies	Cat #Q32850
500 assays, 2-1000 ng	Life Technologies	Cat #Q32853
Qubit assay tubes	Life Technologies	p/n Q32856	DNA quantification
SureSelec tXT2 Capture Libraries	Agilent	depending on the experiment	Kit for libraries capture
SureCycler 8800 Thermal Cycler	Agilent	p/n G8800A	DNA amplification
96 well plate module for SureCycler 8800 Thermal Cycler	Agilent	p/n G8810A	DNA amplification
SureCycler 8800-compatible 96-well plates	Agilent	p/n 410088	DNA amplification
Optical strip caps	Agilent	p/n 401425	DNA amplification
Tube cap strips, domed	Agilent	p/n 410096	DNA amplification
Compression mats	Agilent	p/n 410187	DNA amplification
2100 Bioanalyzer Laptop Bundle	Agilent	p/n G2943CA	DNA amplification
2100 Bioanalyzer Electrophoresis Set	Agilent	p/n G2947CA	DNA amplification
Covaris Sample Preparation System, E-series or S-series	Covaris		DNA shearing
Covaris sample holders		p/n 520078	DNA shearing
Nutator plate mixer	BD Diagnostics	p/n 421105 or equivalent	Plate Mixer
GaIIx	Illumina		next generation sequencing machine