Een nieuwe strategie combinatie matrix-CGH, geheel-exome Sequencing en In Utero Electroporation bij knaagdieren ter identificatie van de oorzakelijke genen voor hersenen misvormingen

Summary

Nodulair heterotopia van de Periventricular (PNH) is de meest voorkomende vorm van misvorming van corticale ontwikkeling (MCD) in volwassenheid maar haar genetische basis blijft onbekend in meest sporadische gevallen. Onlangs hebben we een strategie nieuwe kandidaat om genen te identificeren voor MCDs en direct bevestigen hun oorzakelijke rol in vivo.

Abstract

Aangeboren afwijkingen waarbij de hersenschors — ook bekend als misvormingen van corticale ontwikkeling (MCD) — zijn belangrijke oorzaken van verstandelijke beperking en 20-40% van resistente epilepsie in de kindertijd. Hoge resolutie brain imaging heeft in vivo identificatie van een grote groep van MCD fenotypen vergemakkelijkt. Ondanks de vooruitgang in de beeldvorming van de hersenen, genomic analyse en generatie van diermodellen ontbreekt een eenvoudige werkstroom systematisch prioriteren kandidaat-genen en het testen van functionele gevolgen van vermeende mutaties. Om dit probleem te verhelpen, was een experimentele strategie waardoor de identificatie van nieuwe genen van de oorzakelijke voor MCD ontwikkeld en gevalideerd. Deze strategie is gebaseerd op identificeren genomic regio's van kandidaat- of genen via matrix-CGH of geheel-exome sequencing en karakteriseren van de effecten van hun inactivatie of overexpressie van specifieke mutaties bij de ontwikkeling van knaagdier hersenen via in utero Electroporation. Deze aanpak heeft geleid tot de identificatie van het C6orf70 gen, codering voor een vermeende vesiculaire eiwit, aan de pathogenese van periventricular nodulair heterotopia, een MCD veroorzaakt door defecte neuronale migratie.

Introduction

De hersenschors speelt een sleutelrol in cognitieve en intellectuele processen en is betrokken bij emotionele controle evenals leren en geheugen. Het is daarom niet verwonderlijk dat veel neurologische en psychiatrische aandoeningen leiden misvormingen van corticale ontwikkeling (MCD tot). De etiologie van MCD is complex aangezien beide verworven en genetische factoren betrokken zijn. De cumulatieve prevalentie van genetisch bepaalde deel van de MCD is ongeveer 2%, en ze zijn sporadisch in de meeste gevallen. Bijvoorbeeld, de incidentie van aangeboren hersenen dysgenesie was naar schatting meer dan 1% in de menselijke populatie, en sommige vormen van MCD worden waargenomen bij meer dan 14% van alle patiënten met epilepsie en in 40% van de ernstige of hardnekkige epilepsie^{1, 2}.

Periventricular nodulair Heterotopia (PNH) is één van de gemeenschappelijkste MCDs en wordt veroorzaakt door abnormale migratie van neuronen van de ventriculaire zone (VZ), aan de ontwikkelende hersenschors. Het falen van de neuronen te migreren van resultaten in clusters van heterotopic neuronen langs de muren van de laterale ventrikels die kunnen meestal worden gevisualiseerd met behulp van magnetische resonantie beeldvorming (MRI). De beeldvorming, klinische en anatomische kenmerken van PNH zijn heterogeen. Knobbeltjes kunnen variëren van kleine en eenzijdige te bilaterale symmetrische. Gemeenschappelijke klinische gevolgen omvatten epilepsie en intellectuele handicaps³. Mutaties in het gen Filamin A (of FLNA), die in Xq28 kaarten, werden gevonden in 100% van de gezinnen met bilaterale PNH X-gebonden en 26% van sporadische patiënten^3,4. Een zeldzame, recessieve vorm van PNH veroorzaakt door mutaties in het ARFGEF2 -gen, die in 20q13 kaarten, heeft gemeld in twee consanguïne gezinnen⁵. Biallelic mutaties in de genen coderend voor het receptor-ligand cadherine paar DCHS1 en FAT4 zijn onlangs geïdentificeerd bij negen patiënten getroffen door een multisystemic aandoening waarin PNH⁶. PNH heeft ook zijn geassocieerd met fragiele X syndroom⁷, Williams syndroom⁸, 22q11 Microdeletie syndroom⁹, doublures op 5 p 15¹⁰, verwijderingen op 1 p 36¹¹, 5q14.3-q15¹², 6 p 25¹³ en 6q terminal schrapping syndroom^{14,15,16,17,18,19}, suggereren dat extra oorzakelijke genen verspreid zijn gedurende het genoom. De genetische basis blijft echter voor ongeveer 74% van sporadische PNH patiënten worden opgehelderd¹⁷.

Klassieke gene toewijzing benaderingen zoals matrix vergelijkende Genomic hybridisatie (matrix-CGH) hebben bewezen te zijn een krachtige hulpmiddelen voor het opsporen van sub microscopische chromosomale afwijkingen, echter de genomic regio's geïdentificeerd met behulp van deze aanpak zijn vaak grote en talrijke genen bevatten.

De komst van massale parallelle sequencing technieken (d.w.z. geheel-Exome Sequencing (WES) en geheel-genoom sequencing (WGS)) is aanzienlijk verminderd, zowel de kosten en de benodigde tijd voor het volgnummer van een hele menselijke exome of genoom. Interpretatie van WES en WGS gegevens blijft echter in de meeste gevallen, sinds een uitdaging voor elke patiënt tientallen tot honderden (of zelfs duizenden, afhankelijk van het soort analyse) varianten uit gegevens filteren voortkomen.

Om te versnellen het proces van identificatie van nieuwe MCD oorzakelijke genen, een roman systematische strategie matrix-CGH combineren, werd WES en in utero electroporation (ÇÉ) screening van de kandidaat-genen ontworpen. ÇÉ kunt selectief inactivering (of overexpress) specifieke genen of mutaties in knaagdier hersenen, waardoor snelle evaluatie van hun betrokkenheid in corticogenesis^18,19. RNAi gemedieerde-knockdown of overexpressie van een of meer kandidaat-genen wordt verwacht te veroorzaken wanneer het gen geassocieerd met ziekte ontwikkeling, gelokaliseerde defecten in neuronale migratie en/of rijping is. Bij de identificatie van een gen waarvan inactivering (of overexpressie) het fenotype waargenomen bij patiënten in knaagdieren reproduceert, wordt het een uitstekende kandidate voor de screening bij sporadische patiënten met MCD. Met behulp van deze aanpak, we onlangs de beslissende bijdrage van het C6orf70 gen (ook bekend als ERMARD) geopenbaard in PNH pathogenese bij patiënten 6q27 chromosomale verwijderingen¹⁶herbergen.

Protocol

Ethische verklaring: Wistar ratten werden gekruist, onderhouden en gebruikt in de INMED dierlijke faciliteiten, in overleg met de Europese Unie en de Franse wetgeving.

1. DNA-extractie en kwantificering voor Array-CGH en WES

1. Pak Genomic DNA (gDNA) uit menselijk bloed leukocyten van patiënten met behulp van een geautomatiseerde DNA isolatie robot of commercieel beschikbare handmatige DNA-extractie kits volgens protocol van de fabrikant. Kwantificeren van alle monsters met behulp van een spectrofotometer.

2. array-CGH Protocol

1. Beperkingsspijsvertering van gDNA
   1. Dubbele digest 500 ng van gezuiverde gDNA van een patiënt en een commercieel beschikbare menselijke controle DNA met RsaI en AluI gedurende 2 uur bij 37 ° C. Gebruik 0,5 μl van 10 U/μL enzym voor elke reactie. Incubeer gedurende 20 minuten bij 65 ° C tot inactivering van de enzymen en verplaatsen van de buizen van de steekproef aan ijs.
2. Monster etikettering
   1. Voeg de juiste hoeveelheid willekeurige inleidingen die nodig zijn voor de indeling van de microarray in gebruik voor elke reactiebuis (bv 5 µl voor 1-pack, 2-pack en 4-pack microarrays). Meng goed door pipetteren zachtjes op en neer.
   2. Monster buizen overbrengen in een thermische cycler. Incubeer bij 95 ° C gedurende 3 min en vervolgens bij 4 ° C gedurende 5 min.
   3. Voorbereiden van een cyanine 3 en een cyanine 5 Master Mix etikettering op ijs door het mengen van de volgende volumes: 10.0 µl 5 X reactie Buffer, 5.0 µl 10 x dNTPs, 3.0 µl Cyanine 3-dUTP of Cyanine 5-dUTP en 1,0 µl Exo (-) Klenow enzym, 2.0 µl Nuclease-gratis Water. Kies het volume van elk reagens volgens de notatie van de microarray in gebruik.
   4. De etikettering Master Mix toevoegen aan elke reactiebuis met de gDNA. Meng goed door pipetteren zachtjes op en neer.
   5. Monster buizen overbrengen in een thermische cycler en Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uur, 65 ° C gedurende 10 minuten en daarna onderhoudt de monsters bij 4 ° C.
3. Zuivering van gelabelde gDNA
   1. 430 µl voor 1 x TE (pH 8.0) aan elke reactiebuis toevoegen.
   2. Een kolom zuivering plaats in 2 mL collectie buizen en label de kolommen op de juiste manier. Laden elke gelabelde gDNA op een kolom zuivering.
   3. Centrifugeer gedurende 10 min bij 14.000 x g in een microcentrifuge bij kamertemperatuur. Negeren de doorstroming en de kolom plaats terug in de collectie tube van 2 ml.
   4. 480 µL voor 1 x TE (pH 8.0) aan elke kolom toevoegen. Centrifugeer gedurende 10 min bij 14.000 x g in een microcentrifuge bij kamertemperatuur. Gooi de doorstroming.
   5. Het omkeren van de kolom in een tube van vers 2 mL collectie en centrifuge voor 1 min op 1000 x g in een microcentrifuge bij kamertemperatuur te verzamelen van gezuiverde monster.
   6. Brengen het monstervolume die de microarray opmaken in gebruik met behulp van een concentrator of het toevoegen van 1 x TE (pH 8.0) aangevraagd. Bijvoorbeeld, voor 1-pack microarray zodat het volume 80,5 µL. Incubeer het monster op het ijs gedurende 5 minuten en daarna Pipetteer de oplossing op en neer 10 keer.
4. Voorbereiding van gelabelde gDNA voor hybridisatie
   1. Combineren van teststof en referentiestof monsters met behulp van de juiste cyanine 5-geëtiketteerden monster en cyanine 3-geëtiketteerden monster in de buis van een verse 1,5 mL RNase-vrij. Bijvoorbeeld, voor 1-pack microarray opdat het eindvolume is 158 µL. Kies het volume van elk monster volgens de notatie van de microarray in gebruik.
   2. Een spectrofotometer gebruiken voor het meten van de opbrengst, mate van etikettering of specifieke activiteit door het meten van de absorptie bij A260 nm (DNA), A550 nm (cyanine 3) en A650 nm (cyanine 5).
      1. Bereken rendement met behulp van de formule: [DNA concentration(ng/µl) x monstervolume (µl)] / 1.000 (ng/µg). Specifieke activiteit met de volgende formule berekenen: pmol per µl van kleurstof/µg per µl van gDNA.
         Opmerking: bijvoorbeeld voor 0,5 µg input DNA, de opbrengst moet 8 tot en met 11 µg en de specifieke activiteit (pmol/µg) moet 25 tot 40 voor de Cyanine-3 geëtiketteerd monster en 20 tot 35 voor de gelabelde steekproef van Cyanine-5.
   3. Ter voorbereiding van het bedrag van hybridisatie Master Mix die nodig zijn voor de indeling van de microarray in gebruik, meng de volgende reagentia: 50 µL Cot-1 DNA (1.0 mg/ml), 52 µL 10 x aCGH blokkeren Agent en 260 µl 2 x HI-RPM hybridisatie Buffer.
   4. Voeg het juiste volume van de kruising Master Mix aan de 1,5 ml RNase-gratis buis waarin de gelabelde gDNA voor het totale volume dat vereist is voor de indeling van de microarray in gebruik. Bijvoorbeeld, voor 1 pack microarray, ervoor zorgen dat het eindvolume voor elke reactie 362 µl.
   5. Meng het monster op en neer, waarbij dan snel Centrifugeer bij 14.000 x g en incubeer gedurende 3 min bij 95 ° C en bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
5. Chambers vergadering en kruising
   1. Laad een schone pakking dia in de kamer-base met de pakking label naar boven gericht en afgestemd op het rechthoekige gedeelte van de kamer-base. Zorgen dat de pakking dia spoelen met de kamer base is en niet kier.
   2. Afzien van hybridisatie monster mengsel op de pakking put, ervoor te zorgen dat het monster gelijkmatig is verdeeld.
   3. Een microarray dia neergezet op de pakking dia beoordeling dat het sandwich-paar op de juiste manier is uitgelijnd. Vervolgens monteer de reactie kamer waardoor de cover op de ingeklemd dia's en hand-aanscherping van de klem.
   4. Dia's door het draaien van de geassembleerde zaal verticaal bevochtiging zorgen. Zorg dat de bubbels niet in de vergaderzaal aanwezig zijn. Indien nodig, tik op de vergadering op een harde ondergrond om te verplaatsen van stationaire bubbels.
   5. Zet de geassembleerde dia kamers in een rek van de rotator instellen om te draaien bij 20 omwentelingen per minuut. Leg de hybridisatie kamer in een oven en het uitvoeren van de kruising bij 65 ° C gedurende 24 of 40 uur volgens de notatie van de microarray in gebruik.
6. Microarray wassen en scannen
   1. Hybridisatie kamer uit de oven halen en het onderdompelen in was buffer 1. Ga verder met de demontage.
   2. De microarray dia verwijderen en zet het snel in een rack van de dia in was buffer 1 bij kamertemperatuur.
   3. Wassen van de matrix dia voor 5 min met roeren (gebruik een vlo en een magneetroerder). Pas de snelheid van de roerder met een instelling van 4 (medium snelheid), om goede maar niet te krachtig mengen.
   4. De matrix dia in was buffer 2 voor 90 s roeren wassen. Zachtjes het herstellen van de dia uit de buffer (het moet ontstaan droge) en laadt u deze in een dia houder met behulp van een dia-beschermer.
   5. Laden van de dia in de matrix scanner en uit te voeren volgens de instructies van de fabrikant van de array te scannen.
   6. Analyseer de resultaten met behulp van de software van de extractie voorzien van de scanner in gebruik volgens de instructies van de fabrikant van (V.9.1.3.1).

3. WES Protocol

1. Doel verrijking
   1. Gebruik de dsDNA BR Assay om te bepalen van de concentratie van het monster gDNA volgens het protocol van het instrument.
   2. Verdun 5 µg van kwalitatief hoogwaardige dubbele streng DNA met 1 x laag TE buffer in een tube lage bind 1,5 mL in een totaal volume van 50 µL.
   3. Instellen van een ultrasoonapparaat en zet een microtube in het station van het laden en lossen volgens de instructie van de fabrikant. Houd de dop op de tube.
   4. Langzaam het DNA-monster van 50 µl via de vooraf split septa overdragen zonder bubbels.
   5. Het DNA volgens de instellingen voorgesteld van de het ultrasoonapparaat fabrikant schuintrekken en beoordelen van de kwaliteit met behulp van een Bioanalyzer volgens de instructie van de fabrikant. Het doel van DNA fragment grootte is 150 tot 200 bp.
2. Reparatie van DNA eindigt
   1. Bereid het einde Mix voor de reactie van de reparatie door het mengen van 40 µL van einde reparatie enzym Mix met 10 µL van einde reparatie Oligo Mix. Meng goed op een vortex-mixer.
   2. Incubeer de monsters bij 20 ° C gedurende 30 minuten in een thermische cycler en houdt hen bij 4 ° C. Gebruik geen een verwarmde deksel.
   3. Voeg toe 50 µL van het einde reparatie reactie Mix, bereid in stap 3.2.1 aan elke 50 µL DNA-monster goed geschoren. Meng goed door pipetteren op en neer of door de zachte vortexing.
   4. Zuiveren monster met een kralen gebaseerd zuivering kit volgens protocol van de fabrikant.
3. Polyadenylatie van 3' einden.
   1. 20 µl van dA-Tailing Master Mix toevoegen aan elk eind-gerepareerd, gezuiverde DNA-monster (ongeveer 20 µL).
   2. Meng goed door pipetteren op en neer of door de zachte vortexing.
   3. Incubeer bij 37 ° C in een thermische cycler monsters en houdt het bij 4 ° C. Gebruik geen een verwarmde deksel.
4. Afbinding van de pre-opname indexing adapter.
   1. 5 µL van afbinding Master Mix toevoegen aan elk A-tailed DNA-monster.
   2. Voeg toe 5 µL van de passende pre vangen Index oplossing aan elk monster.
   3. Zegel van de putten en meng door de vortexing voor 5 s. kort centrifuge de monsters.
   4. Incubeer de monsters bij 20 ° C gedurende 15 min. in een thermische cycler en houd vervolgens bij 4 ° C. Gebruik geen een verwarmde deksel.
   5. Zuiveren van de monsters met een kralen gebaseerd zuivering kit volgens protocol van de fabrikant.
5. Versterking van de geïndexeerde bibliotheek.
   1. Bereid het juiste volume voor pre vangen PCR reactie mix door het mengen van 1 µL van Primer Mix en 25 µL van het PCR Master Mix. Meng goed op een vortex-mixer.
   2. Combineer 26 µL van het mengsel van de versterking in aparte putjes van de plaat van een PCR en 24 µL van elk geïndexeerde gDNA bibliotheek monster.
   3. PCR programma's uitvoeren met de volgende stappen uit: 98 ° C gedurende 2 minuten, 5 cycli bij 98 ° C gedurende 30 s, 60 ° C gedurende 30 s en 72 ° C gedurende 1 minuut en een definitieve verlenging bij 72 ° C gedurende 10 min. Houd de monsters bij 4 ° C.
   4. Zuiveren monster met een kralen gebaseerd zuivering kit volgens protocol van de fabrikant.
   5. Beoordeling van kwaliteit met een Bioanalyzer volgens protocol van de fabrikant.
6. Bundeling van geïndexeerde DNA-monsters voor hybridisatie
   1. Voor elke opname reactie pool, combineren het juiste volume van elk monster bibliotheek geïndexeerde gDNA in een put van een PCR-plaat. Bijvoorbeeld, voor mens of muis All-Exon vangen Bibliotheken, combineren 8 bibliotheken per groep met behulp van 187,5 ng van elke geïndexeerde bibliotheek. Ervoor zorgen dat elke laatste opname reactie toepassingen 1500 bevat ng van geïndexeerde gDNA.
   2. Vermindering van het volume in elk goed tot < 7 µL met behulp van een vacuüm concentrator. Vermijd volledig drogen het monster.
   3. Voldoende nuclease-gratis water toevoegen aan elke groep van de geconcentreerde gDNA toe zodat de definitieve goed volume 7 µL en vervolgens vortex de plaat met gDNA krachtig gedurende 30 s. Centrifuge in een centrifuge of mini plaat spinner voor het verzamelen van de vloeistof op de bodem van de putten.
7. Kruising van de gDNA bibliotheek zwembaden aan de bibliotheek vastleggen
   1. Voeg aan elke 7 µL geïndexeerd gDNA zwembad, 9 µl van het blokkeren van de Mix. Pipetteer omhoog en omlaag als u wilt mengen.
   2. De putten van het GLB, overdracht van de verzegelde plaat met gDNA aan de thermische cycler en Incubeer bij 95 ° C gedurende 5 minuten, dan houd het bij 65 ° C. Zorg ervoor dat de plaat wordt gehouden bij 65 ° C gedurende ten minste 5 min.
   3. Maak de aangewezen verdunning van RNase blok, op basis van de grootte van de bibliotheek vangen (10% verdunning voor bibliotheken < 3.0 Mb en 25% verdunning voor bibliotheken > 3.0 Mb).
   4. Volgens de Capture bibliotheek grootte, combineren van de juiste hoeveelheid vangen bibliotheek en Verdun RNase blok oplossing in een plaat van de PCR gehouden op ijs. Meng goed door pipetteren. Voor opname bibliotheken < 3.0 Mb, gebruik 2 µl van bibliotheek en 5 µL van RNase blok bij 10% verdunning. Voor opname bibliotheken > 3.0 Mb, gebruik 5 µl van bibliotheek en 2 µl van RNase blok bij 25% verdunning.
   5. Voeg 37 µL van hybridisatie Buffer toe aan elk putje met 7 µL van Capture bibliotheek/RNase blok mix. Meng goed door pipetteren en kort centrifugeren van de plaat met de mix.
   6. Het handhaven van de gDNA zwembad plaat bij 65 ° C tijdens het gebruik van een meerkanaals-pipet voor het overzetten van de gehele 44 µL van Capture bibliotheek mengsel van stap 3.7.5 aan elk monster goed van de gDNA zwembad plaat. Meng goed door langzaam pipetteren op en neer 8 tot 10 keer.
   7. Verzegel de putjes met koepelvormige strip caps. Zorg ervoor dat alle putjes zijn volledig verzegeld. Plaatst u een compressie-mat op de PCR-plaat in de thermische cycler.
   8. Incubeer de kruising mengsel gedurende 24 uur bij 65 ° C. Opmerking: Monsters kunnen worden gekruist voor maximaal 72 uur, maar moeten controleren dat de uitgebreide hybridisatie geen uitgebreide verdamping in de steekproef putten veroorzaakt.
8. Voorbereiding van daar beklede magnetische kralen
   1. Prewarm was buffer 2 bij 65 ° C in een water-bad of warmte-blok.
   2. Krachtig resuspendeer de magnetische kralen van daar op een vortex-mixer. De magnetische kralen regelen tijdens de opslag.
   3. Voor elk monster hybridisatie, voeg toe 50 µL van de geresuspendeerde parels aan putjes van de plaat van een PCR.
   4. Wassen van de kralen en resuspendeer hen in 200 µL van bindende Buffer.
9. Inname van het gehybridiseerde DNA gebruiken daar kralen.
   1. Schatten en de omvang van de kruising oplossing die nadat de 24 uur incubatie achterblijft opnemen.
   2. De plaat van de kruising bij 65 ° C te handhaven en gebruik van een meerkanaalspipet overdracht van het gehele volume (ongeveer 60 µL) van elke kruising mengsel de putjes van de plaat met 200 µL van gewassen daar kralen. Meng goed door langzaam pipetteren op en neer 3 tot 5 keer.
   3. Cap de putten en de plaat van de vangst op een Nutator mixer of gelijkwaardige gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur incuberen. Zorg ervoor dat de monsters zijn goed mengen in de putjes.
   4. Kort centrifugeren de plaat vastleggen in een centrifuge of mini plaat spinner.
   5. Zet de plaat vastleggen in een magnetische scheidingsteken voor het verzamelen van de parels van de schorsing. Verwijderen en verwijder het supernatant.
   6. Resuspendeer de kralen in 200 µL van Wash buffer 1. Meng door pipetteren op en neer totdat de kralen zijn volledig geresuspendeerde.
   7. Kort centrifugeren in een centrifuge of mini plaat spinner.
   8. Zet de plaat in het magnetische scheidingsteken.
   9. Wacht totdat de oplossing om te wissen, dan verwijderen en verwijder het supernatant.
10. Na het vangen van monster verwerking voor Multiplexed Sequencing
    1. Bereid het juiste volume van PCR reactiemengsel door het mengen van het volgende: 9 µL Nuclease-gratis water, 25 µL Master Mix en 1 µL Primer mengen volgens het aantal amplifications. Meng goed met behulp van een vortex-mixer en houd op ijs.
    2. Voor elke reactie amplificatie 35 µL van het PCR reactiemengsel uit stap 3.10.1 in de putjes van de plaat van een PCR te plaatsen.
    3. Pipetteer elk van de gevangen bibliotheek kraal-gebonden zwembad monsters omhoog en omlaag om ervoor te zorgen dat de schorsing van de parel homogeen is.
    4. Voeg 15 µL van elke schorsing opgenomen bibliotheek zwembad parel aan de passende PCR reactiemengsel goed. Meng door pipetteren totdat de kraal schorsing homogeen is.
    5. Plaats de plaat bereid in punt 3.10.2 in een thermische cycler en voer het volgende PCR versterking programma: 98 ° C gedurende 2 minuten, 8 tot en met 11 cycli bij 98 ° C voor 30 s, 60 ° C voor 30 s en 72 ° C gedurende 1 min, gevolgd door een laatste extensie bij 72 ° C gedurende 10 minuten. Houd de monsters bij 4 ° C.
    6. Zuiveren monster met een zuivering van de kralen gebaseerd volgens protocol van de fabrikant.
    7. Beoordeling van kwaliteit met een Bioanalyzer volgens protocol van de fabrikant.
11. Voorbereiding van monsters voor multiplexed sequencing
    Opmerking: De uiteindelijke verrijkte monsters bevatten zwembaden van 8 of 16 geïndexeerde Bibliotheken, gebaseerd op de grootte van de bibliotheek vastleggen en de daaruit voortvloeiende pre vangen bundeling van strategie. Het totale aantal geïndexeerde bibliotheken die multiplexed kan worden in een enkele sequencing lane wordt bepaald door de specificaties van de output van het platform gebruikt, samen met de hoeveelheid sequencing gegevens die nodig zijn voor de bibliotheek vastleggen.
    1. Bereken het aantal indexen die kunnen worden gecombineerd per rijstrook, volgens de capaciteit van het platform. Het totale aantal geïndexeerde bibliotheken die multiplexed kan worden in een enkele sequencing lane wordt bepaald door de specificaties van de output van het platform gebruikt, samen met de hoeveelheid sequencing gegevens die nodig zijn voor de bibliotheek vastleggen. Bijvoorbeeld, voor de menselijke alle Exon v5 bibliotheek, de aanbevolen Sequencing gegevens per bibliotheek geïndexeerd is 4 Gb en de aanbevolen volgorde van gegevens per groep van de pre-opname is 32 Gb (8-index zwembaden).
12. Het volgnummer van de bibliotheken.
    1. Laden van de bibliotheken op de volgende generatie sequencing platform van keuze en het uitvoeren van de volgorde uitgevoerd volgens de specificaties van het instrument.
13. Exome het rangschikken gegevens te analyseren.
    1. Voer de pijpleiding en de software van keuze voor basis roeping. Bijvoorbeeld, gebruiken Stampy kaart leest²⁰, duplicaten verwijderen met Picard (http://broadinstitute.github.io/picard/) en single nucleotide polymorphisms en invoeging of schrapping van de honken schoon (microdeleties) met Platypus²¹identificeren. Filter synoniem varianten en die waargenomen bij een allel frequentie < 5% en Vergelijk gegevens met die uit de ouderlijke exomes te identificeren van DOVO varianten.

4. plasmide DNA voorbereiding In Utero Electroporation

1. Het ontwerp van verschillende korte haarspeld RNAs (shRNAs) gericht op de codering volgorde of de 3-' UTR van de kandidaat-genen zoals eerder beschreven²².
2. Om te voorkomen dat de af target test effecten shRNAs specificiteit door BLAST zoeken tegen databases die gebruikmaken van standaard methoden. Uitsluiten van shRNAs weer te geven van meer dan 50% van de complementariteit met andere rat-genen.
3. Kloon gegloeid oligonucleotides in een mU6-pro-vector als eerder beschreven²³.
4. Zuiveren van plasmide DNA met een Maxi-prep volgens de instructies van de fabrikant en maak een eindconcentratie van 3 µg/µL.
5. Aliquot 20 µl van DNA (0,5 mg/ml pCAGGS-GFP hetzij alleen of met 1,5 mg/ml shRNA bouwen) en voeg 2 µL van snelle groene kleurstof (2 mg/mL) toe visuele controle van de injectie.

5. in Utero Electroporation

1. Chirurgische ingreep
   1. Anesthetize E15.5 zwangere vrouwelijke ratten (E0 werd gedefinieerd als de dag van de bevestiging van sperma-positieve vaginale plug), met behulp van een combinatie met een mengsel van ketamine/xylazine (0.1 en 0, 01 milligram per lichaam gewicht, respectievelijk), die wordt gegeven via een intraperitoneaal injectie voor verdoving inductie.
   2. Zorg ervoor dat het dier is volledig verdoofd door het observeren van de verdwijning van Teen snuifje reflex.
   3. Scheren van de onderbuik van het dier met een clipper te verwijderen van de vacht. Desinfecteren van de huid met behulp van scrubs van Povidon-Jood en 70% alcohol. Dierenarts zalf toepassen op ogen om te voorkomen dat droogte terwijl onder verdoving.
   4. Plaats van het dier op een warmtebron en zet een steriele gordijn (met een open raam van 4-5 cm in het midden) over de plaats van de incisie. Het dragen van gezichtsmaskers, laboratoriumjas, caps en steriele chirurgische handschoenen. Handhaving van de steriliteit tot het einde van de operatie.
   5. Met behulp van scherpe schaar te maken een verticale insnijding (2-2,5 cm) in de huid langs de middellijn in de caudal buik dan een insnijding van de muur van de spier onder de huid — ook van 2,5 cm — langs de middellijn.
   6. Zorgvuldig bloot een baarmoeder hoorn uit de buikholte. Drop 37 ° C voorverwarmde normale zoutoplossing om te hydrateren van de embryo's. Houd de baarmoeder vochtig de hele tijd.
2. Injectie van DNA en electroporation
   1. Zachtjes Houd één van de baarmoeder horens met geringde pincet en duw voorzichtig één embryo naar de baarmoederwand. Houd het embryo in de ene hand en met de andere hand-insert zorgvuldig glas haarvaten 1 mm vanaf de middellijn in het laterale linkerventrikel (2-3 mm diep) en injecteren van ongeveer 1 µL van DNA met snel groen dat visuele controle van het gebruik van de injectie een microinjector.
   2. Normale zoutoplossing op het oppervlak van 3 x 7 mm² elektroden neerzet. Plaats de positieve steriele elektrode aan de ingespoten kant (laterale linkerventrikel) en de negatieve elektrode van de steriele op het rechterventrikel. Leveren 5 elektrische pulsen 950 ms intervallen met een voet-gecontroleerde pedaal (4000 mF condensator wordt opgeladen tot 40 V met een electroporator).
3. Post electroporation procedures
   1. Baarmoeder horens uitgesteld tot de buikholte, normale zoutoplossing druppels toevoegen aan de holte dat embryo's geplaatst natuurlijker en ter verantwoording voor intraoperatieve vochtverlies.
   2. Sluit de buikspier muur met absorbeerbare chirurgische hechtingen, vervolgens de huid met behulp van een eenvoudige-onderbroken steek.
   3. Zet de rat terug naar de kooi en volgen van het dier totdat uit de anesthesie blijkt.
   4. Voor de pijnbehandeling beheren buprenorfine (0,03 mg/kg) aan het dier door een subcutane injectie elke 8-12 h, voor maximaal 48 uur.

6. bereiding van de monsters van de hersenen

1. Fixatie methode
   1. Offeren de zwangere rat 5 dagen na de chirurgische ingreep met behulp van gas anesthesie (Isofluraan) gevolgd door een snelle cervicale dislocatie.
   2. Het maken van een verticale insnijding om de buikholte opnieuw te openen.
   3. De baarmoeder horens bloot, de embryo's uit de baarmoeder verwijderen en onthoofden hen met behulp van scherpe schaar.
   4. Verwijderen van de hersenen met minimale schade aan het weefsel: met behulp van scherpe schaar, maken een kleine snede langs de posterior (cerebellum) / anterior (olfactieve bollen) as van het hoofd te doorboren de huid en de schedel, vervolgens met behulp van een paar pincet schil weg de schedel om bloot te stellen de Brain en verwijderen met behulp van een kleine spatel.
   5. Onderdompelen van hersenen 's nachts bij 4 ° C in een 4% Paraformaldehyde in 1 x Phosphate Buffered Saline (PBS).
2. Hersenen segmenteren
   1. Wassen hersenen in 1 x PBS gedurende 10 minuten.
   2. Hersenen in 4% agar in plastic mallen insluiten insluiten.
      1. 50 mL 4% agar in 1 x PBS voor te bereiden voor het insluiten van 5 embryonale hersenen. Zorg ervoor dat opgeloste agarose op niet meer dan 50 ° C.
   3. Hersenen houden in agarose te polymeriseren gedurende ten minste 1 uur bij 4° C. Verwijder overtollige agarose rond de hersenen.
   4. Lijm de hersenen om de grondplaat vibratome, georiënteerde dus de anterior/posterior-as van de hersenen loodrecht op het blad is. Wacht een paar minuten voor de lijm drogen en plaats van de plaat met de gelijmde hersenen in de vibratome-zaal.
   5. Vul de vibratome met 1 x PBS. Snijd 100 µm dik secties.
   6. Overdracht van hersenen segmenten op dia's, overtollige vloeistof afzuigen, voeg een paar druppels van montage medium en plaats een dekglaasje aan op de top van hersenen

7. confocal beeldvorming en kwantitatieve analyse

1. Laat de montage middellange droog 's nachts voordat imaging. Afbeelding secties op 10 X op een laser-scanner confocal microscoop.
2. Software voor kwantitatieve beeldanalyse gebruikt, zet u de afbeelding in 8-bits, selecteert u één vertegenwoordiger GFP positieve fluorescerende cel en handmatig bepalen de vorm. Om dit te doen, klik op "Schatting" en de rand van de cel met het freehand gereedschap tekenen. In deze worden manier de diameter en de drempel van de intensiteit van de cel automatisch bewaard door de software.
3. Klik op "Find cellen" om de software te lokaliseren transfected cellen in de cortex. Vervolgens, indien nodig, handmatig verwijderen valse positieven.
4. De gehele dikte van de cortex in 8 gebieden van belang genormaliseerd in afzonderlijke secties verdelen. Om dit te bereiken, klik op "Regio Tool", Selecteer 8 "regio Stripes" waar de eerste (1) en de laatste (8) strepen komen overeen met de VZ en naar de top van CP respectievelijk. Klik op 'Toepassen' om de software te tellen van de relatieve positie van GFP transfected cellen in de hele cortex. Tenslotte tikken voort "Quantification opslaan" om gegevens in een Excel-bestand om de analyse te exporteren.

Representative Results

De experimentele strategie ontworpen om roman MCD oorzakelijke genen te identificeren is gerecapituleerd in Figuur 1.

Door het uitvoeren van matrix-CGH in een cohort van 155 patiënten met ontwikkelingsstoornissen hersenen afwijkingen variabel combineren PNH (figuur 2A), corpus callosum dysgenesie, colpocephaly, cerebellaire hypoplasie en Polymicrogyrie gekoppeld aan epilepsie, ataxie en cognitieve stoornissen, we geïdentificeerd een minimale kritische schrapping 1,2 Mb in 6q27 gedeeld door 12 patiënten (figuur 2B)²¹. De genomische regio bevat vier bekende genen (THBS2, PHF10, TCTE3 en DLL1) en twee genen (WDR27 en C6orf70) voorspeld (figuur 2B).

Parallel aan de matrix-CGH, WES analyse in 14 patiënten met geïsoleerde bilaterale PNH en geen kopie aantal variaties-analyse werd uitgevoerd, één patiënt te identificeren met een de novo Mutatie (c.752T > A: pIle250Asn) in de voorspelde C6orf70 gen ( GenBank toetreding nummer NM_018341.1) (Figuur 3).

Om te bevestigen dat de mutatie geïdentificeerd in C6orf70 had een oorzakelijke rol in PNH en te onderzoeken of de haploinsufficiency van de andere genen toewijzen in 6q27 het fenotype kan beïnvloeden, werd hun rol in vivo op neuronale migratie onderzocht met behulp van de in utero RNAi-gemedieerde vechtpartij aanpak^23,24 hun uitdrukking in rat corticale neurale progenitoren zwijgen op te leggen. Alleen de genen die zijn uitgedrukt in de ontwikkelingslanden rat cortex, PHF10, C6orf70 en DLL1, werden getest (figuur 4A). Verschillende korte haarspeld RNAs (shRNAs) werden gegenereerd gericht op de codering sequenties van deze drie genen. ShRNAs geïntroduceerd in neuroprogenitors in de neocortex rat door in utero electroporation ten embryonale dage 15 (E15), wanneer ertoe bovenlagen corticale neuronen worden gegenereerd. Groen fluorescent proteïne werd gebruikt als verslaggever van de transfectie. Relatieve verdeling van GFP-positieve cellen werd 5 dagen na electroporation onderzocht. Knockdown van Dll1 en Phf10 resulteerde in een lichte vertraging van radiale neuronale migratie (gegevens niet worden weergegeven), overwegende dat knockdown van C6orf70 neuronale migratie verminderde en gaf aanleiding tot de ontwikkeling van heterotopic knobbeltjes zeer denken aan die waargenomen in Flna vechtpartij model (figuur 4B)²⁴. Omgekeerd, transfections met de ondoeltreffende C6orf70 mismatch shRNA had geen duidelijke invloed op de neuronale migratie (figuur 4B).

Figuur 1: Workflow voor de identificatie van nieuwe MCD oorzakelijke genen identificatie. Schematische weergave van de verschillende benaderingen die kunnen worden gebruikt voor identificatie van nieuwe ziekte veroorzaakt genen. Vakken gekleurd in gele vertegenwoordigen de benaderingen die zijn beschreven in het huidige document. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: 6q27 verwijderingen veroorzaken abnormale hersenontwikkeling met PNH. (A) patiënt 2. T2-gewogen coronale (linkerdeel) en T1-gewogen axiale (rechtervenster) gedeelten met PNH voering van de muur van de linker temporale kwab (witte en zwarte pijlpunt) onder een ongevouwen insulaire cortex. (B) patiënt 11. T1-gewogen coronale deel, toont bilaterale heterotopic knobbeltjes langs de muren van de temporele hoorns (witte pijlpunten). (C) patiënt 12. T2-gewogen coronale sectie. Aan de linkerkant, PNH is nog steeds zichtbaar (zwarte pijlpunt) en de ventrikels worden uitgezet. (D) Schematische weergave van de verwijderingen in de regio van de 6q27 geïdentificeerd in PNH patiënten met behulp van de matrix-CGH (bovenste deel). De horizontale, onderbroken lijnen geven verwijderingen geïdentificeerd bij patiënten. De grootte van de minimale kritische verwijderd-regio is ook geïndiceerd en bevat vier bekende genen: THBS2, PHF10, TCTE3 en DLL1 en twee voorspelde genen: WDR27 en C6orf70 (bovenste deel). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: Sequencing resultaten. ( ) T2 - gewogen axiale sectie bilaterale PNH in de frontale hoorns (witte pijlpunten) in de uitvoering van de c.752T patiënt tonen > een mutatie in C6orf70. (B) Sanger sequencing waaruit blijkt dat de mutatie geïdentificeerd door WES opgetreden DOVO. De positie van de mutatie wordt aangegeven door zwarte pijlpunten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: Analyse van de uitdrukking van de genen gelokaliseerd in de minimale kritische regio van de 6q27 en de C6orf70-knockdown verandert radiale migratie van corticale neuronen. (A) kwantitatieve RT-PCR tonen de expressie van genen die in de regio 6q27 kritisch in de hersenschors rat. Cyclophilin A werd gebruikt voor normalisatie. (B) representatieve neocortical coronale secties E20 rat hersenen 5 dagen na electroporation met beide Green Fluorescent Protein bouwen alleen (control) of gecombineerd met shRNA gericht op de C6orf70 codering sequentie (C6orf70-shCDS) of met de relatieve ineffectief mismatch construeren (C6orf70-shCDSmm). Flna -knockdown (FLNA-shCDS) werd gebruikt als controle van verminderde neuronale migratie. In utero electroporation met de C6orf70-shCDS of FLNA-shCDS geïnduceerde de arrestatie van GFP-positieve cellen binnen de ventriculaire zone (VZ) (witte pijlen), dat de cellen uiten GFP alleen of in combinatie met de mismatch construeren niet gewijzigd neuronale migratie. Schaal bars = 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

MCDs zijn belangrijke oorzaken van verstandelijke beperking en 20-40% van resistente jeugd epilepsie^1,2. Belangstelling voor MCDs is dramatisch toegenomen in de afgelopen tien jaar als gevolg van twee belangrijke factoren. De eerste is de verbetering in de hersenen (met name MRI) imaging, waardoor artsen en wetenschappers te visualiseren van vele misvormingen van de hersenen die eerder niet werden herkend. Anderzijds is de evolutie van genetische hulpmiddelen die de identificatie van vele nieuwe MCD oorzakelijke genen hebben toegestaan. Onze kennis van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van de hersenen en functie, en waarbinnen nauwkeuriger genetische counseling is enorm verbeterd.

In het verleden, onderzoekers hun inspanningen was vooral gericht op identificatie van de oorzakelijke gen, waardoor het ontwerp van functionele tests hun rol in de ontwikkeling van de hersenen aan latere stadia te verduidelijken. Dit is moeilijker als gevolg van de progressie van de studie van zeldzame, terugkerende genetische aandoeningen aan gemeenschappelijkere sporadische aandoeningen voor welke traditionele gen vinden methoden zijn niet vatbaar geworden. Huidige benaderingen oorzakelijke om genen te identificeren vaak toestaan de identificatie van relatief grote regio's van het genoom met talrijke genen (matrix-CGH) of verschillende varianten in een aantal kandidaat-genen die moeilijk te valideren (WES of WGS).

Matrix-CGH en WES (of WGS) benaderingen hebben het spectrum van de mutatie voor vele genetische aandoeningen verruimd. Niettemin blijven enkele kritische beperkingen nog steeds. Bijvoorbeeld, matrix-CGH moet kwalitatief hoogwaardige DNA en er niet in slaagt om evenwichtige translocaties of kleine verwijderingen/duplicaties, inclusief de ingrepen voor één of enkele exons van een enkel gen te identificeren. Om dit probleem te verhelpen, kan matrix-CGH worden uitgevoerd met een hogere resolutie dan conventionele sonde afstand (bijvoorbeeld met behulp van 1 M matrix-CGH kit) of vervangen door analyse van de SNP-matrix. WES vaak heeft geen betrekking op grote genische gebieden en niet diep intronic mutaties identificeren. Daarnaast, soms de dekking mogelijk te laag voor het identificeren van de oorzakelijke mutaties (met name in geval van mutaties met lage percentage van mozaïcisme). Een andere belangrijke stap voor WES is dat data-analyse en filteren nog een aanzienlijke inspanning vereisen. Het vergroten van de dekking van WES, het aantal patiënten in een enkel experiment mag worden verminderd of verschillende vangen kits kunnen worden gebruikt op hetzelfde moment.

ÇÉ is de meest geschikte aanpak van de impact van genen knockdown op neuronale migratie. Onderzoek naar andere stappen van corticale ontwikkelingsstoornissen, zoals neurogenese en neuronale rijping, worden echter belemmerd door enkele technische beperkingen. Inderdaad, ÇÉ uitgevoerd voordat E13 vaak mislukte is overwegende dat onderzoek in latere stadia worden beperkt door het hoge tempo van postnatale letaliteit gekoppeld aan deze procedure. Gen-knockdown efficiëntie kan daarnaast verschilt de electroporated embryo's leidt tot aanzienlijke fenotypische heterogeniteit.

Globaal, is dit protocol heeft vier belangrijke kritische stappen. Hoewel er geen onderdeel van het protocol beschreven in het huidige document, moeten we erop wijzen dat de eerste fundamentele stap naar rekening worden gehouden met de selectie van patiënten om te worden ingeschreven in dergelijke studies. Inderdaad, het proces van identificatie van nieuwe genen van de MCD vereist klinische en beeldvormende onderzoeken in een cohort van patiënten voor wie het fenotype zo homogeen mogelijk moeten. Patiënten met zeer homogene fenotype verzamelen verhoogt de kans op identificatie van de oorzakelijke mutaties in een bepaald gen. Het minimum aantal patiënten om te worden ingeschreven in dergelijke studies om succes te bereiken is echter moeilijk te voorspellen, aangezien het sterk afhankelijk van de mutaties van de verschillende genen. Voor genen zoals FLNA, die is gemuteerd in 100% van de familiale gevallen van X-gebonden bilaterale PNH en 26% van de sporadische patiënten, zou het aantal patiënten die nodig zijn voor het identificeren van meerdere hits in het gen bijvoorbeeld relatief laag. Daarentegen is het aantal patiënten worden vertoond voor genen met lage mutaties, hoger. Bijvoorbeeld in het geval van C6orf70, konden we een enkele oorzakelijke mutatie alleen bij screening 64 patiënten identificeren (14 door WES en 50 via conventionele Sanger sequencing)¹⁶, schatten van een mutatie tarief voor dit gen van ongeveer 1,5%. De tweede cruciale stap is de uitsluiting van mutaties in de genen van alle bekende MCD teneinde nieuwe oorzakelijke genen. Dankzij de komst van nieuwe technologieën van de volgende generatie sequencing, kan mutatie screening van bekende en kandidaat-genen nu worden uitgevoerd in een enkel experiment. Passende varianten filtering moeten echter worden gebruikt om de aanwezigheid van een buitensporig aantal valse positieven te experimenteel worden bevestigd en uitfilteren van mogelijke oorzakelijke mutaties te voorkomen. Inderdaad, het aantal kandidaat-genen/varianten is bijzonder hoog in WES experimenten. Indien de betrokkenheid van een bepaald gen wordt vermoed, moet mutatie screening ook gepaard gaan met MLPA analyse, microdeleties of microduplications uitsluiten. Het derde punt van kritiek is het feit dat de chromosomale herschikkingen zijn sterk beïnvloed door de locatie van het onderbrekingspunt. In deze context loont het om uit te sluiten, om zoveel mogelijk, de verstoring of de verplaatsing van cis-regulerende elementen distale aan genen niet opgenomen in de verwijdering/duplicatie. Ten slotte, in vivo RNAi experimenten wordt ervan uitgegaan dat de oorzakelijke genen een directe rol in neuronale migratie tijdens de embryonale stadia spelen. Echter de etiologie van MCD, met inbegrip van PNH, is heterogeen en de aanpak in utero kon niet detecteren van de effecten van genen die betrokken zijn in ontwikkelingsstadia, met inbegrip van neuronale proliferatie of cel overleven. Bovendien, kan de lage complexiteit van de knaagdier hersenen maskeren de gevolgen van het knockdown of de overexpressie van een bepaalde kandidaat-gen, die duidelijker in het menselijk brein wellicht.

Wij zijn van mening dat de integratie van de genomica en in vivo functionele studies bijdragen zal aan de ontwikkeling van nieuwe diagnostische instrumenten voor de identificatie van nieuwe MCD oorzakelijke genen. Deze strategie zou ook nieuwe dierlijke modellen om te testen van therapeutische doelen en begrijpen van de pathofysiologie van MCD, die tot nu toe hebben is beperkt door het ontbreken van experimentele modellen en de beperkte toegang tot hersenweefsel van getroffen patiënten bieden. Ontcijferen van de moleculaire trajecten die gekoppeld aan MCD zijn aandoeningen zal ook waardevolle nieuwe informatie over de ontwikkeling van de fysiologische hersenen in het algemeen bieden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Picospritzer III	Parker Hannifin Corp	P/N 051-0500-900	Intracellular Microinjection Dispense Systems
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252	Fast green allow visual monitoring of the injection
BTX ECM 830 electroporator	BTX Harvard Apparatus	45-0002	The ECM 830 is a Square Wave Pulse generator designed for in vitro and in vivo applications
Microtome HM 650 V	Microm	10076838	Microtome HM 650 V vibratome 240V 50/60Hz with vibrating blade
FluoView 300	Olympus		The Olympus FluoViewTM 300 is a point-scanning, point-detection, confocal laser scanning microscope designed for biology research application
eCELLence software	Glance Vision Technologies		eCELLence is software designed for the quantitive analysis of cell migration
Agilent Microarray Scanner Bundle			Array slides
for 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K or 8 x 15K	Agilent	Agilent p/n G4900DA, G2565CA or G2565BA
for 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K or 8 x 60K	Agilent	Agilent p/n G4900DA or G2565CA
Hybridization Chamber, stainless	Agilent	Agilent p/n G2534A	Chamber for array CGH hybridization
Hybridization Chamber gasket slides, 5-pack			Gasket for array CGH hybridization
for 1-pack microarrays or	Agilent	Agilent p/n G2534-60003
for 2-pack microarrays or	Agilent	Agilent p/n G2534-60002
for 4-pack microarrays or	Agilent	Agilent p/n G2534-60011
for 8-pack microarrays	Agilent	Agilent p/n G2534-60014
Hybridization oven	Agilent	Agilent p/n G2545A
Hybridization oven rotator for Agilent Microarray Hybridization Chambers	Agilent	Agilent p/n G2530-60029
Thermal cycler with heated lid	Agilent	Agilent p/n G8800A or equivalent	Termal cycler for incubations
1.5 mL RNase-free Microfuge Tube	Ambion	p/n AM12400 or equivalent	Microcentrifuge
Magnetic stir bar	Corning	p/n 401435 or equivalent	Instrument for stirring
Qubit Fluorometer	Life Technologies	p/n Q32857	Instrument for DNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit, for use with the Qubit fluorometer	Invitrogen	p/n Q32850	Kit for Qubit fluorometer
UV-VIS spectrophotometer	Thermo Scientific	NanoDrop 8000 or 2000, or equivalent	Instrument for DNA quantification
P10, P20, P200 and P1000 pipettes	Pipetman or equivalent		DNA dispensation
Vacuum Concentrator	Thermo Scientific	p/n DNA120-115 or equivalent	Instrument to concentrate DNA
SureTag Complete DNA Labeling Kit	Agilent	p/n 5190-4240	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
Purification Columns (50 units)	Agilent	p/n 5190-3391	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
AutoScreen A, 96-well plates	GE Healthcare	p/n 25-9005-98	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
GenElute PCR Clean-Up Kit	Sigma-Aldrich	p/n NA1020	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
Human Genomic DNA		p/n G1521	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
For CGH microarrays:	Promega	(female) or p/n G1471 (male)	Array CGH control DNA
For CGH+SNP microarrays:	Coriell	p/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878, or NA18579	Array CGH control DNA
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer Kit or	Agilent	p/n 5188-5226	Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and	Agilent	p/n 5188-5221	Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2	Agilent	p/n 5188-5222	Array CGH hybridization and wash
Stabilization and Drying Solution	Agilent	p/n 5185-5979	Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit	Agilent	p/n 5188-5220 (25) or p/n 5188-5380 (100)	Array CGH hybridization and wash
Human Cot-1 DNA	Agilent	p/n 5190-3393	Array CGH hybridization and wash
Agilent C scanner	Agilent		Scanner for array CGH slides
SureSelect XT2 Reagent Kit			Kit for target enrichment
HiSeq platform (HSQ), 16 Samples	Agilent	p/n G9621A
HiSeq platform (HSQ), 96 Samples	Agilent	p/n G9621B
HiSeq platform (HSQ), 480 Samples	Agilent	p/n G9621C
MiSeq platform (MSQ), 16 Samples	Agilent	p/n G9622A
MiSeq platform (MSQ), 96 Samples	Agilent	p/n G9622B
MiSeq platform (MSQ), 480 Samples	Agilent	p/n G9622C
DNA 1000 Kit	Agilent	p/n 5067-1504	Kit for the separation, sizing and quantification of dsDNA fragments from 25 to 1000 bp.
High Sensitivity DNA Kit	Agilent	p/n 5067-4626	Kit for analysis of fragmented DNA or DNA libraries.
AMPure XP Kit			Kit for automated PCR purification.
5 mL	Agencourt	p/n A63880
60 mL	Agencourt	p/n A63881
450 mL	Agencourt	p/n A63882
Dynabeads MyOne Streptavidin T1			Isolation and handling of biotinylated nucleic acids
2 mL	Life Technologies	Cat #65601
10 mL	Life Technologies	Cat #65602
Quant-iT dsDNA BR Assay Kit, for the Qubit fluorometer			DNA quantification
100 assays, 2-1000 ng	Life Technologies	Cat #Q32850
500 assays, 2-1000 ng	Life Technologies	Cat #Q32853
Qubit assay tubes	Life Technologies	p/n Q32856	DNA quantification
SureSelec tXT2 Capture Libraries	Agilent	depending on the experiment	Kit for libraries capture
SureCycler 8800 Thermal Cycler	Agilent	p/n G8800A	DNA amplification
96 well plate module for SureCycler 8800 Thermal Cycler	Agilent	p/n G8810A	DNA amplification
SureCycler 8800-compatible 96-well plates	Agilent	p/n 410088	DNA amplification
Optical strip caps	Agilent	p/n 401425	DNA amplification
Tube cap strips, domed	Agilent	p/n 410096	DNA amplification
Compression mats	Agilent	p/n 410187	DNA amplification
2100 Bioanalyzer Laptop Bundle	Agilent	p/n G2943CA	DNA amplification
2100 Bioanalyzer Electrophoresis Set	Agilent	p/n G2947CA	DNA amplification
Covaris Sample Preparation System, E-series or S-series	Covaris		DNA shearing
Covaris sample holders		p/n 520078	DNA shearing
Nutator plate mixer	BD Diagnostics	p/n 421105 or equivalent	Plate Mixer
GaIIx	Illumina		next generation sequencing machine