Abstract
Genom-redigering af menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs) indeholder en genetisk kontrolleret og klinisk relevant platform, hvorfra at forstå menneskets udvikling og undersøge patofysiologi sygdommen. Ved at anvende stedspecifikke nukleaser (ssns) for genom redigering, den hurtige afledning af nye hPSC linjer huser specifikke genetiske ændringer i en ellers isogen indstilling bliver mulig. Zinkfinger nukleaser (ZFNs), transskriptionsaktivator--lignende effektor nukleaser (Talens) og grupperet regelmæssigt spatierede korte palindrome repeats (CRISPR) / Cas9 er de mest almindeligt anvendte ssns. Alle disse nukleaser ved at indføre en dobbeltstrenget DNA pause på et bestemt sted, og derved fremme præcise gen redigering på et genomisk locus. SSN-meditated genom redigering udnytter to af cellens endogene DNA reparationsmekanismer, ikke-homolog ende sammenføjning (NHEJ) og homologi rettet reparation (HDR), til enten at indføre indsættelses / deletionsmutationer eller altER genomet ved hjælp af en homolog reparation skabelon på stedet for den dobbeltstrengede brud. Elektroporering af hPSCs er et effektivt middel til transfektion ssns og reparation skabeloner, der inkorporerer transgener såsom fluorescerende journalister og antibiotikaresistens kassetter. Efter elektroporering, er det muligt at isolere kun de hPSCs der indarbejdet reparation konstruktionen ved at selektere for antibiotikaresistens. Mekanisk adskillelse hPSC kolonier og bekræfter ordentlig integration på målområdet gennem genotypebestemmelse muliggør isolering af målrettede korrekt og genetisk homogene cellelinjer. Gyldigheden af denne protokol demonstreres her ved hjælp af alle tre SSN platforme til at indarbejde EGFP og en puromycin modstand konstruere ind i AAVS1 sikker havn locus i humane pluripotente stamceller.
Introduction
Genom redigering teknologier er i rivende udvikling i standard værktøjer til molekylær og cellebiologi 1. Gensplejsning af humane pluripotente stamceller (hPSCs), er af særlig interesse som hPSCs udgør en selvfornyende kilde til genetisk intakte primære humane celler. hPSCs kan differentieres i forskellige celletyper for sygdom modellering eller som kilde til transplantation behandlingsformer 2,3. Demonstreret her er en protokol, der bruger tre forskellige typer af stedsspecifikke nukleaser (ssns), sammenholdt med endogene DNA reparation mekanismer til målrettet integration af en reporter konstruktion på AAVS1 locus. Efter transfektion af ssns i hPSCs, vi demonstrere, hvordan at isolere isogene cellepopulationer huser reporter.
Evnen til at manipulere genomer, specielt pluripotente stamceller genomer, hjælp ssns er ikke et nyt fænomen, da nytten af zink finger nukleaser (ZFNs) og transskription activateller-lignende effektor nukleaser (Talens) for genet redigering blev påvist for flere år siden 4-10. Men med fremkomsten af S. pyogenes CRISPR / Cas9 teknologi 11-13, er gen redigering blevet bredt tilgængelige 14. Alle ssns indføre et dobbeltstrenget DNA brud (DSB) på det angivne målsted 1,4,5,11 der er repareret af endogene cellulære mekanismer ved hjælp af enten ikke-homolog endesammenbinding (NHEJ) eller homologi rettet reparation (HDR) 15. NHEJ er fejlbehæftet og kan indføre rammeskift mutationer, der resulterer i tab af genfunktion, mens HDR muliggør nye elementer, der skal indføres gennem co-transfektion af en reparation skabelon med SSN. Mens de grundlæggende principper for DNA-reparation, der letter gen redigering menes at være stort set den samme for hver SSN, kan bemærkes, nogle forskelle mellem platformene. De novo design ZFNs giver mulighed for fleksibilitet og nuklease optimering 16, men brugen af offentligttilgængelige samling biblioteker og screening-værktøjer til at designe individuelle ZFNs kan være tidskrævende. Når den ønskede sted for ZFN-medieret målretning bestemmes, kan ZFN parvis udformes med online-værktøj ZiFit 17. Efter design, kan ZFNs være modulært samles gennem flere runder af plasmid kloning 18. Alternativt er der mange kommercielt tilgængelige, pre-valideret ZFNs 19. Fortælling nucleaser kan også være udformet ved hjælp af online værktøjer og offentligt tilgængelige komponenter 17,20. For eksempel kan Talens hurtigt samlet fra blokke af fem fortælling gentagelser gennem FLASH samlingen 21 eller ved hjælp af PCR-hierarkiske Golden Gate samling 22. Nem SSN design og hastighed konstruktion ved hjælp af CRISPR / Cas9 har gjort genom redigering en bredt tilgængelig værktøj. Den korte guide RNA-medieret målretning af CRISPR / Cas9 også mulighed for multipleksing af vejledning RNA'er til at målrette flere loci med en enkelt konstruktion 14. Udformningenaf Cas9 til gen-redigering kræver kun identifikation af en protospacer tilstødende motiv (PAM, en NGG trinukleotid for S. pyrogenes Cas9) proximalt i forhold til mållocuset. Ved at indsætte et oligonukleotid svarende til de 20 basepar 5 'for PAM i px330 plasmid 14, kan konstruktionen samles i et kloningstrin. Ud over S. pyogenes Cas9, Cas9 fra N. meningitidis (NmCas9), som genkender en 5'-NNNNGATT-3 '(PAM) har vist sig at muliggøre effektiv gen-redigering i hPSCs 23.
Ud over forskellene i let design SSN, hver platform har specifikke egenskaber. For eksempel ZFNs og Talens udnytte Fokl nukleasedomænet, som genererer en fire nukleotid 5 'overhæng 24, mens Cas9 menes at generere det meste stumpendede DSBs. ZFNs, Talens og Cas9 adskiller sig i deres protein stabiliteter, on-off-rate på mål-DNA, og tilstanden af DNA scanning, som alle Could teoretisk resultere i små forskelle i redigeringen udfald 1. Mens yderligere undersøgelser vil være forpligtet til fuldt ud at forstå konsekvenserne af disse forskelle, vi beskriver her en protokol, der er meget robust på tværs af alle tre platforme og kan bruges til let at generere genmodificerede hPSCs.
Uanset SSN valg, elektroporering er en solid procedure til transfektion ssns og homologi reparation skabeloner i hPSCs 25. Antallet af overlevende kolonier efter udvælgelse for antibiotikaresistens afhænger locusspecifikke parametre og redigeringen strategien (f.eks størrelse transgen insert og udvælgelsesmåde). Protokollen beskrevet her normalt resulterer i omkring 150-400 encellede afledte kolonier.
Gene-redigering på AAVS1 locus ved hjælp af denne protokol er tidligere blevet brugt til at demonstrere effektiviteten af ssns 4,5. AAV-CAGGS-EGFP reparation Skabelonen anvender et gen fælde strategy at give puromycin resistens i en locus-specifik måde. Kort fortalt, reparation skabelon indeholder en splejsningsacceptorsite opstrøms for promotor-puromycin-resistente kassette. Ved korrekt integration ind i den første intron af PPP1R12C genet ved AAVS1 locus, er modstanden kassetten udtrykt fra den redigerede genets promotor. Robustheden af denne specifikke AAVS1 analyse giver os mulighed for at sammenligne effektiviteten af hver SSN platform.
Gene redigering ved hjælp ssns er kraftfuld får mulighed for at afbryde og / eller ændre teoretisk helst gen. Anvende denne strategi til hPSCs giver alsidighed hPSCs efterfølgende kan differentieres i en lang række humane celletyper såsom neuroner 26, hepatocytter 27 og 28 cardiomyocytter. Derudover er anvendelsen af patient-afledt inducerede pluripotente stamceller tillader reparation eller indførelse af kendte sygdomsfremkaldende mutationer hos en patient-specifikke genetiske baggrund 29 30. Sammenfattende gen redigering i hPSCs er en effektiv og alsidig tilgang til undersøgelse den grundlæggende biologi menneskelig udvikling og sygdom 31.
Protocol
Beskrevet i dette manuskript procedurer blev gennemgået og godkendt af UC Berkeley Stamcelleforskning Oversight udvalget.
1. Forbered Stamceller til redigering
- Vokse og kultur humane pluripotente stamceller (hPSCs) på en 6-brønds plade indeholdende 2,4 x 10 6 celler / plade af mitomycin C-inaktiveret muse embryonale fibroblast (MEF) fødere dyrket på gelatine 32. Oprethold hPSCs i 3 ml humane embryonale stamceller medier per brønd (hESC medier) og vokse i en 37 ° C inkubator med 3% O 2/5% CO2.
Bemærk: succes i denne protokol, er det ikke nødvendigt at opretholde hPSCs i en lav-ilt rugemaskine men det er vigtigt at bemærke, at hPSCs formere hurtigere i en høj O 2 miljø, så tider og celletal bør justeres i overensstemmelse hermed. Det skal også bemærkes, at hPSCs holdes lavt iltindhold har lavere forekomst af spontan differentiering 33.- To at 500 ml hESC medier kombinere 380 ml DMEM / F12, 75 ml føtalt bovint serum (FBS), 25 ml KnockOut Serum udskiftning (KSR). Tilføj Glutamin (1 mM slutkoncentration), 5 ml 100x Ikke-essentielle aminosyrer, 100 enheder / ml penicillin-streptomycin (P / S), basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF) (4 ng / ml slutkoncentration) og 2- mercaptoethanol (5,5 uM slutkoncentration).
- Skift medier ved at fjerne hele mængden af medier (3 ml) ved hjælp af et glas pipette og vakuum. Udskift med 3 ml varm hESC medier ved hjælp af en serologisk pipette. Gentag medier skifter hver dag, indtil hPSCs er ca. 50% sammenflydende (dag -1).
- En dag før målretning (dag -1), ændre hESC medier, fjerne de gamle medier og tilføje varme hESC medier suppleret med 10 pM Y-27632.
- Ligeledes på dag -1, udarbejde én til to 6-brønds eller 10 cm plader af lægemiddelresistente MEF fødeceller fra DR4 mus (2,4 x 10 6 celler / plade) 34.
Bemærk: Generelt plader med 6 brønde er advantageous over 10 cm plader, da de rumme flere medier. 6 brøndsplader også sikre, at forskellige kloner fra forskellige brønde er uafhængige. Dog vil en 10 cm plade gøre det lettere plukning, afhængigt af mikroskopet til rådighed for denne proces.
2. Redigering pluripotente stamceller
- Forbered transfektion løsninger ved pipettering 5 ug hver af ZFN 1 og 2, talen 1 og 2 eller 15 ug af CRISPR / Cas9 px330 kodende plasmid (figur 1) i et 1,5 ml rør. Pipette 30 ug reparation plasmidet i dette rør samt. Endelig pipette 1x phosphatpufret saltopløsning (PBS) ind i røret bringe lydstyrken op til 300 pi.
Bemærk: fremstilling af plasmider som midiprep (ethvert kit er egnet) med en minimumskoncentration på 300 ng / pl for at holde den samlede mængde af transfektion opløsning under 300 pi. Det er ikke nødvendigt at udføre phenol / chloroformekstraktion, at linearisere plasmidet, eller at bruge en endotoxin frit plasmid prep kit. - Fjern medier fra hPSCs ved hjælp af en glaspipette og vakuum. Pipetter 2 ml varmt 1x PBS i hver brønd for at vaske cellerne.
- Fjern PBS straks med et glas pipette og vakuum. Tilsæt 0,5 ml 0,25% trypsin-EDTA-opløsning direkte på celler i hver brønd. Placer i inkubatoren (37 ° C / 5% CO 2/3% O 2) i cirka 10 minutter. eller indtil fødelag begynder at løfte pladen.
- Tilsæt 2 ml varmt esWash medier (470 ml DMEM / F12, 25 ml FBS, 100 enheder / ml P / S) til hver brønd for at standse reaktionen trypsin.
- Sikre, at feeder-celler kommer ud som et ark. Pipettere indholdet af hver brønd i en enkelt 50 ml konisk rør, der kombinerer alle brønde. Mal celler ved hjælp af en 10 ml serologisk pipette. Det er ikke nødvendigt at bryde fødelaget op; hPSCs vil komme ud af feeder lag ved forsigtig findeling. Der bør være omkring 15 ml af cellesuspensionen.
- Tilsæt 25 ml esWash medier til røret for at bringe volumig op til 40 ml i alt. Tillad store feeder bidder at bosætte i bunden af rør til 1-2 min. Fjern supernatanten (~ 38 ml) fra røret ved hjælp af en serologisk pipette og deponering til en ny 50 ml konisk rør.
- Spin ned i 5 minutter ved 190 x g. Fjern supernatanten fra røret ved hjælp af en glaspipette og vakuum. Vær sikker på at ikke forstyrre cellepelleten. Resuspender cellerne i 500 pi 1x PBS. Kombiner med plasmid transfektion opløsning fremstillet tidligere. Tæl cellerne på dette trin. Brug 5-10 millioner celler pr elektroporering.
- Pipetteres hele 800 pi suspension i en 4 mm elektroporation cuvette, anbring på is i 3-5 minutter. Elektroporere celler ved anvendelse af eksponentiel program på elektroporation systemet med de følgende parametre: 250 V, 500 uF, ∞ modstand og 4 mm kuvette størrelse. Efter elektroporation placere kuvetten tilbage på is i 3 min.
Bemærk: Vær opmærksom på tidskonstant for elektroporation på elektroporation system. Tidskonstantenvarierer med celletal og DNA renhed. Succesfulde transfektioner har normalt en tidskonstant mellem 10-14 ms ved anvendelse af de nævnte tilstande og en Gene Pulser II. Lavere elektroporation effektivitetsgevinster kan opstå, når tidskonstanter varierer fra disse værdier. - Resuspender elektroporerede celler i 18 ml varm embryonale medium suppleret med 10 pM Y-27632. Pladen 3 ml dette enkelt cellesuspension i hver brønd i en 6-brønds plade med DR4 fødeceller af. Retur til inkubatoren (37 ° C / 5% CO 2/3% O 2).
3. Udvælgelse af positive kolonier
- Dag 2, fjerne alle medier, der bruger et glas pipette og vakuum. Udskift med 3 ml varm hESC medier suppleret med 10 pM Y-27632. Dag 3, fjerne alle medier, der bruger et glas pipette og vakuum. Udskift med 3 ml varmt hESC medier uden herunder Y-27632. Dag 4, fjern alle medier ved hjælp af et glas pipette og vakuum. Udskift med 3 ml varm hESC medier suppleret med antibiotika til selectipå. Retur til inkubatoren (37 ° C / 5% CO 2/3% O 2).
Bemærk: Den type antibiotika, der anvendes, vil afhænge af resistent kassette inkluderet i reparation skabelon. Når man arbejder med WIBR # 3 hPSCs (NIH indskrive 0079), 0,5 ug / ml puromycin, 70 ug / ml G418 (Geneticin), og 35 ug / ml hygromycin er blevet anvendt med succes. Koncentrationer til udvælgelse bør bestemmes empirisk ved at etablere den minimale koncentration af antibiotika er nødvendig for at dræbe vildtypeceller inden for ca. en uge. - Dage 5-12, ændre medierne dagligt, udskiftning af gamle medier hver gang med varme hESC medier suppleret med antibiotika.
Bemærk: Forvent en stor mængde af celledød. Individuelle kolonier vil fremgå omkring dag 8-10. Regelmæssig hESC medier uden antibiotika kan anvendes efter 12-14 dages kontinuerlig markering. Hvis celledensitet er høj eller celledød er langsom, bør forsuring af medierne undgås, og det kan være nødvendigt at øge medierne volumig (op til 4-5 ml) i løbet af de første par dage af markering.
4. Picking selekterede kolonier (dag 12-14)
- Overhold kolonier på dag 12-14. Overhold kolonier, der er klar til at samle på en dissektion mikroskop og sikre, at de ikke indeholder celler, der er begyndt at differentiere. Den omtrentlige størrelse bør være 800-1.200 uM. Hvis kolonier nå denne størrelse før dag 12, anbefales det, at de skal plukkes derefter.
Bemærk: For hver målretning eksperiment, plukke så mange kolonier, som er nødvendigt for at sikre den ønskede genotype isoleres. Som et eksempel har AAVS1 redigering med AAV-CAGGS-EGFP reparation skabelonen konsekvent robust integration, og kræver kun 12-24 kolonier skal plukkes til opnåelse ca. 5-10 heterozygously målrettede kloner. Andre målretning eksperimenter kan kræve flere kolonier skal plukkes (tabel 1). Hyppigheden af nøje målretning begivenheder afhænger af faktorer såsom effektiviteten af SSN at indføre et DSB, størrelsen af insertet, og valget strategi. I tilfælde af genet fælde tilgang til AAVS1 locus præsenteres her, er selektionsmarkøren kun udtrykkes, når korrekt integreret på målstedet, hvilket reducerer antallet af kolonier, der er nødvendige for at opnå en målrettet klon. - En dag før plukke, forberede 12-brønds plader af MEF'er (2,4 × 10 6 celler / plade, vil man godt blive brugt til hver koloni plukket).
- På dagen for plukning, fjern alle medier fra 12 godt MEF plader ved hjælp af et glas pipette og vakuum og erstatte med 1 ml hESC medier. Også på dag plukning, ændre hESC medier på de 6 brønde, der vil blive hentet.
- Træk glaspipetter til mekanisk dissociering af individuelle kolonier fra fødelag. Sænk pipetter over en i-hood bunsenbrænder og blødgøres ved udvidelsen punkt, indtil glasset er formbart. Fjern hurtigt fra ild og træk pipetten hinanden skabe en kantet punkt. Brydpunkt ca. 2 cm fra den bøjede akse, hvilket efterlader en smal kanal. Polere enden af kanalen ved at udsætte flammepåvirkning i 1-2 sek.
Bemærk: Eventuelt gå kolonier en p20 pipettespids, dog kan dette reducere klonaliteten af kulturen, som den kedelige spids kan løsne større mængder af celler fra hver koloni i mediet, potentielt forurenende efterfølgende rosinerne. - Saml plukke enhed ved at tage en P1000 filter pipettespids og fastgøre en suge pære til den smalle ende. Sæt trak glaspipette i den brede ende.
- Placer en 6-brønds plade af hPSCs skal plukkes på scenen af et dissektionsmikroskop monteret i en vævskultur hætte. Komprimer pæren af vælgeanordningen og forsigtigt punktafgifter og skære en individuel koloni i 10-20 lige store stykker, pas på ikke at frigive brikker i medierne. Tag udskårne hPSC stykker af kolonien i pipetten ved at frigive pæren. Prøv at tage så lidt medier som muligt, mens overførsel.
- Transfis de enkelte koloni til en enkelt brønd i en 12-brønds plade MEF, komprimere pæren igen direkte ned i brønden, at frigive nu brudt koloni. Mærk hver brønd for at muliggøre en entydig identifikation af encellede afledte kloner. Gentag for så mange kolonier som nødvendigt, ændrer glaspipette hver gang.
Bemærk: Picking kolonier kan tage lidt tid at lære. Det anbefales, at forsøgslederen praksis på nogle kontrol celler, før du prøver at isolere målrettede kolonier. - Retur 12 brøndsplader i inkubatoren (37 ° C / 3% O 2/5% CO2), ryst forsigtigt pladen først for at undgå akkumulering af celler i midten af hver brønd.
- Den næste dag og hver efterfølgende dag fjernes fuld volumen medier ved anvendelse af et glas pipette og vakuum og erstatte med 1,5 ml varmt hESC medier, indtil cellerne er omkring 50% sammenflydende (dette tager normalt 10-12 dage).
- Efter 10-12 dage, plukke en til to kolonier fra hver brønd og overførsel til nye 12-brønds MEF plader repeating trin 4,1-4,8 at generere en replika plade.
- Uddrag DNA (se nedenfor) fra de resterende kolonier i hver brønd af de oprindelige MEF plader.
- Fjern mediet fra alle brønde med en glaspipette og vakuum. Pipetter 1 ml 1x PBS onto hver brønd for at vaske cellerne. Fjern PBS ved hjælp glaspipette og vakuum. Pipette 250 pi cellelysebuffer (slutkoncentrationer i H2O: 10 mM Tris-HCI, 5 mM EDTA, 0,2% SDS, 200 mM NaCl, 0,08 mg / ml proteinase-K) på hver brønd. Sted i inkubator (37 ° C / 3% O 2/5% CO2) O / N.
- Den næste dag, pipette indholdet af hver brønd i individuelle 1,5 ml rør. Pipette 250 pi isopropylalkohol i hvert rør for at udfælde DNA'et. Ryst rør kraftigt. Et hvidt bundfald skal være synlig.
- Spin hvert rør ned i 3 minutter ved 13.000 rpm i en bordcentrifuge. Efter spin-ned, kassere supernatanten ved dekantering i flydende affald. En lille DNA pellet bør forblive fast til bunden afrøret. Pipettere 250 pi 70% ethanol i hvert rør at vaske DNA-pelleten. Rystes kraftigt. Spin hvert rør ned i 3 minutter ved 13.000 rpm i en bordcentrifuge.
- Efter nedspinning kasseres supernatanten ved dekantering i flydende affald. En lille DNA pellet bør forblive fast til bunden af røret. Pipetteres ud resten af supernatanten, så der er ingen væske tilbage i røret. Efterlad røret åben til tørre på bordplade i 5-10 minutter. Efter tørring, resuspender DNA'et i 250 pi TE-buffer. Sted ved 37 ° C i 6 timer for at tillade DNA for at opløse.
- Genotype hver prøve ved anvendelse af en præoptimerede PCR eller Southern blot-strategi.
Bemærk:.. For AAVS1 målrettet brug af AAV-CAGGS-EGFP reparation skabelon findes den sydlige skamplet strategi i Hockemeyer et al, kan 2009 4 En omfattende Southern blotting protokol findes i det sydlige 2006 35 Til multiplex-PCR genotypebestemmelse af. det samme eksperiment, kan primere og betingelser værefindes i tabel 2 36. - Kassér brønde, der ikke er ordentligt målrettede og fortsætte skiftende hESC medier på korrekt målrettede celler hver dag. Nedfrysning af cellerne, når de er omkring 50% sammenflydende, se nedenfor for nedfrysning.
- En dag før frysning, ændre hESC medier, fjerne de gamle medier og tilføje varme hESC medier suppleret med 10 pM Y-27632.
- På dagen for frysning forberede 0,5 ml af hver af opløsning A og opløsning B pr brønd af en 12-brønds plade, der bliver frosset ned i to 15 ml koniske rør. Placer løsninger på is. Opløsning A: 50% hESC medier og 50% FBS; Opløsning B: 80% FBS og 20% dimethylsulfoxid (DMSO).
- Adskille hPSC kolonier i enkelte celler før frysning. Følg trin 2,2-2,8 at gøre dette, skalering mængder i overensstemmelse hermed. Fuldt resuspender cellepelleten i 0,5 ml opløsning A.
- Tilsæt 0,5 ml opløsning B til cellesuspensionen, pipette op og ned for at gøre cellesuspensionen homogen. Take det samlede volumen af cellesuspensionen (~ 1 ml) og deponering i en 2 ml cryotube. Skru hætten på stramt.
- Sted cryotube i en -80 ° C fryser O / N. Dagen efter frysning, fjerne frosne celler fra -80 ° C fryser og straks anbringes i flydende nitrogen tank til langtidsopbevaring.
Representative Results
Her demonstrerer vi en protokol kompatibel med tre forskellige SSN platforme til at skabe gensplejsede hPSC linjer. Vi målrettet WIBR # 3 humane embryonale stamceller ved AAVS1 locus hjælp tidligere offentliggjorte ZFNs 4, Talens 5 og CRISPR / Cas9s 37 ved hjælp af en reparation skabelon, der indfører en EGFP reporter og en puromycin modstand kassette 4.
Vi dyrket vores hPSCs på MEF'er for en cellekultur workflow tillader vedligeholdelse og udbygning af udifferentierede hPSCs (figur 2), der også er omkostningseffektive og skalerbare. Hvis celler dyrkes længere end nødvendigt, er der risiko for øget differentiering, hvilket reducerer antallet af pluripotente celler, som transficeres og dermed antallet af korrekt målrettede hPSC opnåede kolonier.
Vi electroporated 5,0 x 10 6 celler pr SSN platform og udpladet cellerne fra hver målretning på et enkelt 6-brønds plade af DR4 MEF. Efter udvælgelsen hver platform resulterede i EGFP-positive kolonier (figur 3) og en kombination af målrettede, homozygot målrettede og heterozygously målrettede kloner (figur 4A, B; tabel 3). Under de betingelser, der præsenteres her, finder vi, at AAVS1 Talens resulteret i de mest EGFP-positive kloner. Reparationen skabelon, der anvendes til dette eksperiment består af en splejsningsacceptorsite opstrøms for EGFP reporter og puromycin-resistente kassette. Ved anvendelse af denne "gen-trap" strategien (figur 1), skal konstruktionen indsættes i den første intron af AAVS1 locus, ved hjælp af den endogene promotor for at drive ekspression af puromycin-resistens-kassetten. Manglen på en promotor, der driver ekspressionen af puromycin resistensgenet inden reparationen skabelonen skal forhindre ekspression i tilfælde af vilkårlig integration.
Forventer derfor, vi, at alle puromycin-resistente kloner ville være rettet mod den AAVS1 webstedet. Det skal bemærkes, at en delmængde af kloner bære afvigende integrationer i AAVS1 locus, der kan detekteres ved Southern blot ved anvendelse af en intern probe, men ikke af de fleste PCR-strategier (figur 1; figur 4C) 4. Er disse integration arrangementer sandsynligvis resultatet af heterologe målretning begivenheder, der førte til flere integrationer af donorplasmidet 4. Vi plukket 24 kolonier fra hver SSN eksperiment og fandt, at alle platforme havde meget høje målretning virkningsgrader og viste kun minimale forskelle. Som forhørt af PCR, CRISPR / Cas9 gav de korrekt målrettede kloner, mens talen platformen havde de mest homozygot målrettede kloner (tabel 3).
/files/ftp_upload/53583/53583fig1highres.jpg "width =" 700 "/>
Figur 1. Skematisk af gen redigeret AAVS1 locus ved hjælp af AAV-CAGGS-EGFP reparation skabelon. Modificeret fra Hockemeyer et al., 2009. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Kolonier af WIBR # 3 celler. Repræsentative lyse felt billeder af kolonier af WIBR # 3 humane embryonale stamceller før målretning. Bemærk den manglende differentiering og den klare adskillelse fra fødelag i en ideel koloni (til venstre) i modsætning til en ikke-ideel én (til højre). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. EGFP-positive WIBR # 3-celler. Repræsentative billeder af WIBR # 3-celler målrettet med en EGFP-udtrykkende reparation skabelon på AAVS1 locus. Billeder af repræsentative kolonier redigeret med ZFNs, Talens og CRISPR / Cas9 er vist. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Genotypebestemmelse strategier til at bekræfte korrekt målretning. (A) Repræsentant PCR genotype resultater, der viser ikke-målrettede, heterozygote og homozygote målrettede kloner på tværs af de tre SSN platforme. WT CTL = vildtype kontrol. (B) Representative Southern blot, der viser en heterozygot målrettet klon og en homozygot målrettet klon påvist med et 3'ekstern probe. Fragmentstørrelser: WT-6,5 kb, edited-6,9 kb. (C) Repræsentative Southern blot, der viser en korrekt redigeret klon og en heterozygot klon med et ikke-tilfældige dobbelt-integration. Fragmentstørrelser:. Korrekt redigeret-6,9 kb, afvigende yderligere integration-5 kb Klik her for at se en større version af dette tal.
| Studere | Gene Målrettet | Platform | Reparation skabelon typen | # Af kloner plukket | Målretning effektivitet |
| Sexton et al., 2014 | TPP1 | ZFN | GFP-Puro urapporteret | urapporteret | |
| Sexton et al., 2014 | TERT | ZFN | Hygromycin | urapporteret | urapporteret |
| Hockemeyer et al., 2009 | POU5F1 | ZFN | GFP-Puro | 31 | 39,0% |
| Hockemeyer et al., 2009 | PITX3 | ZFN | GFP-Puro | 74 | 14,9% |
| Hockemeyer et al. 2011 | POU5F1 | Talen | GFP-Puro | 68 | 91,0% |
| Hockemeyer et al. 2011 | PITX3 | Talen | GFP-Puro | 96 | 13,0% |
| Merkle et al. 2015 | VASA | Cas9 | Reporter-Geneticin | 139 | 94,0% |
| Merkle et al. </ em>, 2015 | CRH | Cas9 | Reporter-Geneticin | 30 | 93.0% |
| Merkle et al. 2015 | HCRT | Cas9 | Reporter-Geneticin | 154 | 92.0% |
| Merkle et al. 2015 | HMX2 | Cas9 | Reporter-Geneticin | 11 | 45,0% |
| Forster et al., 2014 | LRG5-Nterm | ZFN | GFP-Puro | urapporteret | 30,0% |
| Forster et al., 2014 | LRG5-Cterm | ZFN | GFP-Puro | urapporteret | 14,0% |
| Soldner et al. 2011 | SNCA | ZFN | Puro | 96 | 1,0% |
Tabel 1. Beskrivelse af andre gener målrettet anvendelse af denne metode, med tilsvarende målrettet effektivitet taget fra tidligere publicerede studier. 4,5,38-41
| Locus | Sekvens | Noter |
| AAVS1-F primer | CTCTAACGCTGCCGTCTCTC | PCR-betingelser: Tm = 57 ° C, 35 cykler |
| AAVS1-WT-R primer | GCTTCTCCTCTTGGGAAGTG | WT band: 1273 bp |
| AAVS1-Målrettet-R primer | CGTCACCGCATGTTAGAAGA | Målrettet bånd: 992 bp |
| T2-Cas9-guide | GGGCCACTAGGGACAGGAT | Fra Mali et al., 2013 |
| AAVS1-ZFN-Right | TAGGGACAGGAT | Fra Hockemeyer et al., 2009 |
| AAVS1-ZFN-Venstre | TGGGGTGTCACC | Fra Hockemeyer et al., 2009 |
| AAVS1-Talen-Right | TCCTAACCACTGTCTTT | Fra Hockemeyer et al. 2011 |
| AAVS1-Talen-Venstre | CCCCTCCACCCCACAGT | Fra Hockemeyer et al. 2011 |
Tabel 2. Liste over primere og SSN målretning sekvenser.
| Targeting-konstrukt | Antal EGFP + Kolonier | Målrettede plukket kloner (PCR efterprøvet) | Forrige Rapporteret Korrekt målretning Effektivitet (ved Southern blot) |
| ZFN | 150 | 86,9% (73,9% het / 13,0% homo) | 56% (50% het / 6% homo) |
| Talen | 412 | 91,3% (47,8% het / 39,1% homo) | 47% (37,5% het / 9,3% homo) |
| CRISPR-Cas9 | 235 | 95,7% (69,5% het / 26,3% homo) | urapporteret |
Tabel 3. Sammenlignende antal EGFP-positive og målrettede Talen, ZFN og CRISPR / Cas9 menneskelige stamceller kolonier. PCR verificerede integrationer på AAVS1 locus for dette eksperiment er sammenlignet med Southern blot verificeret ordentlig enkelt integrationer i tidligere eksperimenter 4,5.
Discussion
Den præsenteres her til isolering homogene populationer af gen-redigerede humane pluripotente stamceller metode er en kraftfuld metode til at generere isogene hPSC linjer, der kun adskiller sig ved den målrettede locus. Disse celler er et ideelt system til sondering mekanismerne i human cellulær differentiering og udvikling samt for at forstå patofysiologien af monogene sygdomme i et kontrolleret genetiske omgivelser. Som vist her, er det muligt at anvende tre uafhængige design SSN strategier (ZFNs, Talens og CRISPR / Cas9) for at opnå målrettet integration på AAVS1 locus. Hver af disse metoder har sine egne fordele og ulemper. En potentiel fordel ved ZFNs og til en vis grad, Talens er deres design fleksibilitet, som gør det muligt iterativ teknik med henblik på at forbedre DNA-bindende domæner af individuelle nukleaser 42. Denne nuklease optimering kunne øge specificiteten af ZFNs og Talens end hvad der er opnåeligt med CRISPR / Cas9 system. En sådan selektivitet kan være vigtig til kliniske anvendelser, der kræver en høj grad af målspecificitet. Den primære fordel ved CRISPR / Cas9 systemet er dets brugervenlighed. Selvom talen og ZFN byggesæt er blevet gjort tilgængelige for offentligheden (dvs. via Addgene 21), CRISPR / Cas9-baserede ssns er betydeligt lettere at konstruere, som den eneste nødvendige tilpasning er et par oligonukleotid 20 base (ved brug af px330 plasmidet design 14). Denne enkelthed viser sig at være en fordel for forskningslaboratorier søger at inkludere genom redigering i deres studier.
Der er alternative transfektionsteknikker, herunder nucleofection 43, for at skabe gen-redigerede hPSC linjer; dog elektroporation har vist sig at være konsekvent og omkostningseffektiv 4,5,25. Nucleofection kan anvendes til direkte transfektion Cas9-Guide RNA ribonucleoprotein komplekser ind i kernen, hvilket øger effektiviteten SSN end troskab 44. Voksende hPSCs på MEF'er er en robust og billig metode til at opretholde hPSCs i en pluripotent tilstand uden overdreven differentiering. Desuden giver mulighed for nem isolation af genetisk identiske kolonier. Alternativt er det muligt at dyrke hPSCs uden MEF'er, men disse dyrkningsbetingelser kan være dyrere end feeder baseret kulturer. Desuden er hele processen skalerbar, der giver mulighed for isolering af meget sjældne begivenheder redigering eller produktion af mange forskellige cellelinjer i parallelle eksperimenter redigering.
Den her beskrevne protokol er robust; men der er flere vigtige skridt, der påvirker den effektivitet, hvormed der kan opnås korrekt redigeres kloner. Det mest kritiske komponent til denne metode er at have høj kvalitet MEF'er og lægemiddelresistente DR4 MEF'er. Overlevelsen af enkelte hPSCs er spinkel, og lav kvalitet MEF'er vil hindre isolering af udifferentierede hPSC linjer. For det andet, anvendelse af Y-27632 er ogsåkommando til enkelt celle overlevelse uden at generere en selektionspres for celler med en unormal karyotype 45. For det tredje, picking godt fordelte kolonier sikrer genetiske homogenitet de afledte cellelinier. Endelig er det vigtigt at forberede glaspipetter således at åbningen er lille nok til at bryde kolonien i mange mindre stykker, der sikrer, at flere kolonier vil vokse i den nye brønd. Dette tillader plukning af godt fordelte subkloner for en replika plade til at have i kultur, efterlader den oprindelige plade af isolerede kolonier til genotypebestemmelse. En udfordrende del i denne protokol er den manuelle trækker af glas pipetter; dette bør praktiseres på forhånd. Det skal bemærkes, at der er flere teknikker til plukning klon, der ikke kræver et glas pipette. Eksperimentatorer opfordres til at finde en, der virker bedst for dem.
Der er begrænsninger forbundet med denne protokol, kan overvindes ved simple modifikationer. Et forsøg har til formål at oun forstyrre locus af interesse uden reparation eller én, hvis reparation skabelon indeholder ikke en selektionskassette, skal anvende en anden metode til at berige for celler, der blev redigeret. Bemærk, at antallet af kolonier, der skal plukkes til at finde en positiv klon øger i høj grad i fravær af markering. En strategi til forbedring af effektivitet er at co-transficere en ikke-integrerende plasmid, der udtrykker et fluorescerende protein. Efter at cellerne til at komme sig to dage, kan målrettede celler sorteres på positivt fluorescens under anvendelse af fluorescens-aktiveret cellesortering og genudpladet 29. Denne proces beriger for celler, der er blevet transficeret med plasmiderne ved elektroporering og derved øger sandsynligheden for en samtidig redigering begivenhed i cellen.
De her beskrevne teknikker kan udvides til at bruge flere RNA'er guide til samtidig målrette flere loci 14,46,47. Mange protokoller er blevet etableret for at differentiere hPSCsi distinkte celletyper, så forskellige genetiske manipulationer i celletyper af interesse 30. Samlet set har vi demonstreret potentialet for effektiv genom redigering i hPSCs uanset SSN valg. Vi foreslår, at denne teknik kan tilpasses til at skabe isogene hPSC linjer, der er blevet gen-redigeret på ethvert genomiske locus.
Disclosures
Forfatterne erklærer nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev understøttet af en Brain Research Foundation Seed Grant (BRFSG-2014-02) til Helen Bateup. Dirk Hockemeyer er en New Scholar i Aging af Ellison Medical Foundation og er støttet af Glenn Fonden samt Den Shurl og Kay Curci Foundation. DH er også støttet af NIH tilskud 1R01CA196884-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320082 | |
| Fetal Bovine Serum (HI) | Life Technologies | 10082-147 | |
| Knockout Serum | Life Technologies | 10828-028 | |
| Fibroblast Growth Factor - basic | Life Technologies | PHG0261 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Y-27632 | Calbiochem | 688000 | |
| 6-well plates | Corning | 3506 | |
| 12-well plates | Corning | 3512 | |
| 4 mm Electroporation cuvettes | Bio-rad | 165-2081 | |
| X-cel gene pulser II | Bio-rad | 165-2661 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| 10× Phosphate buffered saline (PBS) pH7.4 | Life Technologies | 70011-044 | |
| Puromycin | Life Technologies | A11138-02 | |
| Pasteur pipettes, plugged | VWR | 14672-412 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | S5941 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Proteinase-K | Life Technologies | AM2544 | |
| Ethanol | VWR | TX89125-172SFU | |
| Isopropyl Alcohol | VWR | MK303216 | |
| TE Buffer | Life Technologies | 12090-015 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 1.8 ml Cryotubes | ThermoScientific | 377267 |
References
- Carroll, D. Genome engineering with targetable nucleases. Annu Rev Biochem. 83, 409-439 (2014).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery. Sci Transl Med. 6 (239), 239ps6 (2014).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol. 27 (9), 851-857 (2009).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29 (8), 731-734 (2011).
- Bozas, A., Beumer, K. J., Trautman, J. K., Carroll, D. Genetic analysis of zinc-finger nuclease-induced gene targeting in drosophila. Genetics. 182 (3), 641-651 (2009).
- Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
- DeKelver, R. C., et al. Functional genomics, proteomics, and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome. Genome Res. 20 (8), 1133-1142 (2010).
- Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435 (7042), 646-651 (2005).
- Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jinek, M., East, A., Cheng, A., Lin, S., Ma, E., Doudna, J. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, e00471 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. the new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Jasin, M. Genetic manipulation of genomes with rare-cutting endonucleases. Trends Genet. 12 (6), 224-228 (1996).
- Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).
- Sander, J. D., Maeder, M. L., Reyon, D., Voytas, D. F., Joung, J. K., Dobbs, D. ZiFiT (zinc finger targeter): An updated zinc finger engineering tool. Nucleic Acids Res. 38, W462-W468 (2010).
- Carroll, D., Morton, J. J., Beumer, K. J., Segal, D. J. Design, construction and in vitro testing of zinc finger nucleases. Nat Protoc. 1 (3), 1329-1341 (2006).
- Chen, F., et al. High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases. Nat Methods. 8 (9), 753-755 (2011).
- Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (12), e82 (2011).
- Reyon, D., Tsai, S. Q., Khayter, C., Foden, J. A., Sander, J. D., Joung, J. K. FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing. Nat Biotechnol. 30 (5), 460-465 (2012).
- Sanjana, N. E., Cong, L., Zhou, Y., Cunniff, M. M., Feng, G., Zhang, F. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nat Protoc. 7 (1), 171-192 (2012).
- Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from neisseria meningitidis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (39), 15644-15649 (2013).
- Podhajska, A. J., Szybalski, W. Conversion of the FokI endonuclease to a universal restriction enzyme: Cleavage of phage M13mp7 DNA at predetermined sites. Gene. 40 (2-3), 175-182 (1985).
- Costa, M., et al. A method for genetic modification of human embryonic stem cells using electroporation. Nat Protoc. 2 (4), 792-796 (2007).
- Chambers, S. M., Fasano, C. A., Papapetrou, E. P., Tomishima, M., Sadelain, M., Studer, L. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
- Cai, J., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).
- Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 108 (3), 407-414 (2001).
- Soldner, F., et al. Parkinson's disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors. Cell. 136 (5), 964-977 (2009).
- Wen, Z., et al. Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders. Nature. 515 (7527), 414-418 (2014).
- Chiba, K., Hockemeyer, D. Genome editing in human pluripotent stem cells using site-specific nucleases. Methods Mol Biol. 1239, 267-280 (2015).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
- Ezashi, T., Das, P., Roberts, R. M. Low O2 tensions and the prevention of differentiation of hES cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (13), 4783-4788 (2005).
- Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes. Nucleic Acids Res. 25 (18), 3745-3746 (1997).
- Southern, E.
- Henegariu, O., Heerema, N. A., Dlouhy, S. R., Vance, G. H., Vogt, P. H. Multiplex PCR: Critical parameters and step-by-step protocol. BioTechniques. 23 (3), 504-511 (1997).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Sexton, A. N., et al. Genetic and molecular identification of three human TPP1 functions in telomerase action: Recruitment, activation, and homeostasis set point regulation. Genes Dev. 28 (17), 1885-1899 (2014).
- Merkle, F. T., et al. Efficient CRISPR-Cas9-mediated generation of knockin human pluripotent stem cells lacking undesired mutations at the targeted locus. Cell Rep. 11 (6), 875-883 (2015).
- Soldner, F., et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset parkinson point mutations. Cell. 146 (2), 318-331 (2011).
- Forster, R., et al. Human intestinal tissue with adult stem cell properties derived from pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2 (6), 838-852 (2014).
- Miller, J. C., et al. Improved specificity of TALE-based genome editing using an expanded RVD repertoire. Nat Methods. , (2015).
- Hohenstein, K. A., Pyle, A. D., Chern, J. Y., Lock, L. F., Donovan, P. J. Nucleofection mediates high-efficiency stable gene knockdown and transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 26 (6), 1436-1443 (2008).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system. Sci Rep. 4, 5400 (2014).
- Ousterout, D. G., Kabadi, A. M., Thakore, P. I., Majoros, W. H., Reddy, T. E., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 6, 6244 (2015).
