Abstract
Геном-редактирование человека плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) обеспечивает управляемый и генетически клинически значимых платформу, с которой, чтобы понять человеческое развитие и расследовать патофизиологии заболевания. Используя нуклеаз сайт-специфические (ПЛА) для редактирования генома, быстрый вывод новых линий HPSC укрывательство специфических генетических изменений в противном случае изогенной обстановке становится возможным. Цинковый палец нуклеаз (ZFNs), активатора транскрипции, как эффекторные нуклеазы (Таленс) и кластерные регулярно interspaced короткие палиндромные повторы (CRISPR) / Cas9 являются наиболее часто используемые ПЛА. Все эти нуклеаз функционировать путем введения двухцепочечной ДНК перерыв в указанном сайте, тем самым способствуя точное редактирование генов на геномного локуса. SSN-медитировал редактирования генома эксплуатирует два эндогенных механизмов клеточных ДНК, ремонт негомологичными конец, соединяющих (NHEJ) и гомологии направленного ремонта (HDR), либо ввести вставки / удаления мутации или Altэр геном с использованием гомологичной шаблон ремонта на месте двухцепочечной перерыва. Электропорация hPSCs является эффективным средством трансфекции ПЛА и шаблоны, которые включают ремонт трансгенов, например, люминесцентных журналистами и антибиотиков кассет сопротивления. После электропорации, можно выделить только те, что включены hPSCs ремонта конструкции путем выбора для устойчивости к антибиотикам. Механического отделения HPSC колонии и подтверждения правильного интеграции в сайте-мишени путем генотипирования позволяет для выделения целевых правильно и генетически однородных клеточных линий. Срок действия данного протокола свидетельствует здесь, используя все три платформы SSN включать EGFP и сопротивление пуромицину построить в AAVS1 безопасной гавани локуса в человека плюрипотентных стволовых клеток.
Introduction
Редактирования Геном технологии стремительно развиваются в стандартные инструменты для молекулярной и клеточной биологии 1. Генной инженерии из человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) представляет особый интерес, так как hPSCs представляют самообновлению источник генетически интактных клеток первичных человеческих. hPSCs могут быть дифференцированы в различные типы клеток для моделирования заболевания или в качестве источника для трансплантации лечения 2,3. Доказанная здесь является протокол, который использует три различных типа сайт-специфических нуклеаз (ПЛА) в сочетании с эндогенными механизмами для целевого интеграции репортерной конструкции в локусе AAVS1 репарации ДНК. После трансфекции ПЛА в hPSCs, мы демонстрируем, как изолировать изогенные клеточных популяций укрывательство репортер.
Возможность манипулировать геномы, в частности, плюрипотентных стволовых клеток геномы, используя ПЛА не новое явление как полезность пальцев цинка нуклеаз (ZFNs) и транскрипции activatили как-нуклеазы эффекторные (Таленс) для редактирования генов была продемонстрирована несколько лет назад 4-10. Тем не менее, с появлением С. Пирролидонилпептидаза CRISPR / технологии Cas9 11-13, редактирование ген стал широко доступен 14. Все ПЛА ввести двухцепочечной ДНК брейк (DSB) в указанном целевом сайте 1,4,5,11, что отремонтированной эндогенными клеточными механизмами, используя либо негомологичную конец-присоединения (NHEJ) или гомологии направлены ремонт (HDR) 15. NHEJ подвержен ошибкам и может ввести сдвиг мутации кадров приводит к потере функции гена, в то время как HDR позволяет новые элементы вводится через котрансфекции шаблона с SSN ремонта. В то время как основные принципы ремонта ДНК, которые облегчают редактирование гена, как полагают, в значительной степени то же самое для каждого SSN, можно отметить некоторые различия между платформами. De Novo дизайн ZFNs позволяет гибкость и нуклеазы оптимизации 16, однако использование публичнодоступные библиотеки монтажные и скрининга инструменты для разработки индивидуальных ZFNs может занять много времени. После того, как нужный локус ZFN-опосредованной адресности определяется, ZFn пары могут быть разработаны с онлайн-инструмент ZiFit 17. После проектирования, ZFNs можно модульно собраны через несколько раундов плазмиды клонирования 18. Кроме того, существует много коммерчески доступных, предварительно проверены ZFNs 19. СКАЗКА нуклеазы также могут быть разработаны с помощью онлайн-инструментов и публично доступных компонентов 17,20. Например, Talens можно быстро собрать из блоков пяти сказка повторяется через FLASH сборки 21 или с помощью ПЦР на основе иерархической сборку Golden Gate 22. Простота конструкции и SSN скорости строительства с использованием CRISPR / Cas9 сделали геном редактирования широко доступной инструмент. Короткий руководство РНК-опосредованного нападения на CRISPR / Cas9 также позволяет мультиплексирование направляющих РНК целевых несколько локусов с одной конструкции 14. Дизайниз Cas9 для редактирования гена требует только идентификацию protospacer прилегающей мотива (PAM; A тринуклеотид NGG для S. pyrogenes Cas9) проксимально по отношению к локусу-мишени. Вставив олигонуклеотид, соответствующий 20 пар оснований 5'-PAM в px330 плазмиды 14, конструкция может быть собрана в одном шаге клонирования. В дополнение к S. Пирролидонилпептидаза Cas9, Cas9 от N. менингита (NmCas9), который распознает 5'-NNNNGATT-3 '(PAM), как было показано, чтобы обеспечить эффективное гена-редактирования в hPSCs 23.
В дополнение к различиям в простоте конструкции ПКР, каждая платформа имеет конкретные свойства. Например, ZFNs и Talens использовать нуклеазы домен Фоки, который генерирует четыре нуклеотида 5 'выступ 24, а Cas9, как полагают, генерировать основном тупыми DSBs. ZFNs, Talens и Cas9 отличаются стабильностью их белковых, включения-выключения ставка по ДНК-мишени, и режим сканирования ДНК, все из которых сульд теоретически привести к небольшим различиям в результатах редактирования 1. В то время как дальнейшие исследования будут необходимы, чтобы полностью понять последствия этих различий, мы опишем здесь протокол, который высоко надежной во всех трех платформ и могут быть использованы для генерации легко генетически модифицированных hPSCs.
Независимо от выбора SSN, электропорации является надежным процедура трансфекции ПЛА и шаблоны гомологии ремонт в hPSCs 25. Число выживших колоний после отбора устойчивости к антибиотикам зависит локус-специфических параметров и стратегии редактирования (например, размер трансгенной вставки и режим выбора). Протокол, описанный здесь, как правило, приводит к примерно 150-400 одноклеточного полученных колоний.
Джин-редактирование в AAVS1 локуса, используя этот протокол был ранее использован для демонстрации эффективности ПЛА 4,5. Шаблон ремонт AAV-EGFP-CAGGS использует ген ловушки улategy для придания устойчивости пуромицину в локусе определенным образом. Вкратце, шаблон ремонта содержит сплайс акцепторный сайт в обратном направлении от промотора кассеты устойчивости к пуромицин. После правильного интеграции в первом интроне гена PPP1R12C в локусе AAVS1, кассета сопротивление экспрессируется из промотора отредактированный гена. Надежность этой конкретной AAVS1 анализа позволяет сравнивать эффективность каждой платформы SSN.
Редактирование с помощью генной ПЛА является мощным учитывая способность, чтобы сорвать и / или изменять теоретически любой ген. Применяя эту стратегию, чтобы hPSCs обеспечивает универсальность в hPSCs может быть впоследствии дифференцируются на множество типов клеток человека, таких как нейроны 26, гепатоциты 27 и 28 кардиомиоцитов. Кроме того, применение пациентом происходит индуцированных плюрипотентных стволовых клеток позволяет ремонта или введение известных мутаций болезнетворных у пациента конкретных генетического фона 29 30 пациента. В итоге, редактирование ген hPSCs является эффективным и универсальным подходом к исследованию фундаментальной биологии человеческого развития и болезней 31.
Protocol
Процедуры, описанные в этой рукописи были рассмотрены и одобрены Комитетом по надзору в научно-исследовательский Калифорнийского университета в Беркли Stem Cell.
1. Подготовьте стволовых клеток для редактирования
- Выращивают и культуры человека плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs) на 6-луночный планшет, содержащий 2,4 × 10 6 клеток / пластину митомицин С инактивированной мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) питатели, выращенных на желатине 32. Поддержание hPSCs в 3 мл эмбриональных стволовых клеток человека СМИ на лунку (чЭСК СМИ) и расти в 37 ° С инкубатор с 3% O 2/5% CO 2.
Примечание: Для успеха этого протокола, не надо поддерживать hPSCs в инкубаторе с низким содержанием кислорода; Однако важно отметить, что hPSCs пролиферируют быстрее в высокой O 2 окружающей среды, так и раз число клеток должно быть соответствующим образом скорректированы. Следует также отметить, что hPSCs поддерживаемые в низкой кислорода имеют более низкие показатели спонтанной дифференцировки 33.- ТО делают по 500 мл чЭСК СМИ объединить 380 мл DMEM / F12, 75 мл эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 25 мл Сыворотка KnockOut Замена (КСР). Добавить глутамин (1 мМ конечной концентрации), 5 мл 100x Номера незаменимых аминокислот, 100 ед / мл пенициллина-стрептомицина (P / S), основной фактор роста фибробластов (оФРФ) (4 нг / мл конечная концентрация) и 2- меркаптоэтанол (5,5 мкМ конечная концентрация).
- Изменение носитель путем удаления всего объема средств (3 мл) с помощью стеклянной пипетки и вакуум. Замените 3 мл теплой чЭСК СМИ с помощью серологических пипетки. Повторите СМИ меняются каждый день, пока не hPSCs примерно 50% сливной (День -1).
- За день до таргетинга (день -1), изменить чЭСК СМИ, удаляя старые средства массовой информации и добавления теплые чЭСК среде с добавлением 10 мкМ Y-27632.
- Кроме того, на День -1, подготовить один к двум 6-а или 10 см пластин лекарственно-устойчивых MEF фидерных клеток DR4 мышей (2,4 × 10 6 клеток / планшет) 34.
Примечание: В общем, 6-луночные планшеты в объявленияvantageous более 10 см пластины, как они вместить больше информации. 6-луночные планшеты также гарантировать, что различные клоны из разных скважин являются независимыми. Тем не менее, в 10 см пластины облегчит комплектование, в зависимости от микроскопа, доступной для этого процесса.
2. Редактирование плюрипотентных стволовых клеток
- Подготовка трансфекции решения с помощью пипетки 5 мкг каждого из ZFN 1 и 2, Тален 1 и 2, или 15 мкг / CRISPR Cas9 кодирования px330 плазмиды (рис 1) в 1,5 мл пробирку. Внесите 30 мкг плазмиды ремонт в этой трубке также. Наконец, пипетки 1x забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), в трубку, чтобы довести объем до 300 мкл.
Примечание: Подготовка плазмиды в качестве midiprep (любой набор подходит) с минимальной концентрацией 300 нг / мкл, чтобы сохранить общий объем трансфекции раствору при 300 мкл. Это не нужно выполнять извлечение фенола / хлороформа, чтобы линеаризации плазмиды, или использовать endotoСинь бесплатно плазмиды Prep Kit. - Удалить из средств массовой информации, использующих hPSCs стеклянную пипетку и вакуум. Пипеток 2 мл теплой 1x PBS в каждую лунку, чтобы промыть клетки.
- Снимите PBS немедленно, используя стеклянную пипетку и вакуум. Добавить 0,5 мл 0,25% раствора трипсина-ЭДТА непосредственно на клетки в каждой лунке. Поместите в инкубаторе (37 ° С / 5% СО 2/3% O 2) в течение приблизительно 10 мин. или до тех пор, пока слой подачи начинает отрываться от пластины.
- Добавить 2 мл теплой esWash информации (470 мл DMEM / F12, 25 мл FBS, 100 единиц / мл P / S) в каждую лунку, чтобы остановить реакцию трипсина.
- Убедитесь, что фидерные клетки отрываются, как лист. Пипетировать содержимое каждой лунки в одном 50 мл коническую пробирку, комбинируя все лунки. Растирают клетки, используя 10 мл серологические пипетки. Это не является необходимым, чтобы разбить подачи слой; hPSCs выйдет из фидерного слоя, осторожно растирания. Там должно быть около 15 мл клеточной суспензии.
- Добавить 25 мл esWash СМИ в трубу, чтобы принести VOLUмне до 40 мл Общее. Разрешить крупные куски, чтобы фидерные оседают на дне трубы в течение 1-2 мин. Удалить супернатант (~ 38 мл) с использованием трубки серологическое пипетки и депозит в новый 50 мл коническую пробирку.
- Спин вниз в течение 5 мин при 190 х г в. Удалить супернатант из трубки с помощью стеклянной пипетки и вакуум. Будьте уверены, чтобы не мешать осадок клеток. Ресуспендируют клеток в 500 мкл PBS 1x. Совместим с плазмиды трансфекции раствора, приготовленного ранее. Граф клеток на этом этапе. Используйте 5-10 млн клеток на электропорации.
- Внесите всю 800 мкл суспензии в 4 мм кювету для электропорации, место на льду в течение 3-5 мин. Электропорации клетки, используя экспоненциальное программу на электропорации системы со следующими параметрами: 250 В, 500 мкФ, ∞ сопротивления, и 4 мм размером кювет. После электропорации, поместите кювету обратно на льду в течение 3 мин.
Примечание: Соблюдайте постоянная времени электропорации в системе электропорации. Постоянная времениизменяется с числом клеток и чистоты ДНК. Успешные трансфекции, как правило, имеют постоянную времени между 10-14 мс при использовании перечисленных условий и ген генератор импульсов II. Низкую эффективность электропорации может произойти, когда постоянные времени варьируется от этих значений. - Ресуспендируют клетки электропорации в 18 мл теплой чЭСК среде с добавлением 10 мкМ Y-27632. Пластина 3 мл этого суспензии отдельных клеток в каждую лунку 6-луночного планшета с DR4 фидерных клеток. Возврат к инкубаторе (37 ° С / 5% СО 2/3% O 2).
3. Выбор положительных колоний
- День 2, удалить все средства массовой информации, используя стеклянную пипетку и вакуум. Замените 3 мл теплой чЭСК среде с 10 мкМ Y-27632. День 3, удалить все средства массовой информации, используя стеклянную пипетку и вакуум. Замените 3 мл теплой чЭСК СМИ, не включая Y-27632. День 4, удалить все средства массовой информации, используя стеклянную пипетку и вакуум. Замените 3 мл теплой чЭСК среде с добавлением антибиотиков для selectiна. Возврат к инкубаторе (37 ° С / 5% СО 2/3% O 2).
Примечание: тип используемого антибиотика будет зависеть от кассеты сопротивления включены в шаблон ремонта. При работе с WIBR # 3 hPSCs (НИЗ реестра 0079), 0,5 мкг / мл пуромицин, 70 мкг / мл G418 (генетицину), и 35 мкг / мл гигромицину были успешно использованы. Концентрации отбора должны быть определены опытным путем установления минимальной концентрации антибиотика, необходимого, чтобы убить клетки дикого типа в течение примерно одной недели. - Дни 5-12, изменить СМИ ежедневно, замена старых СМИ каждый раз с теплыми чЭСК среде с антибиотиками.
Примечание: Ожидать большое количество клеточной смерти. Отдельные колонии станут очевидными вокруг день 8-10. Регулярное чЭСК средах без антибиотиков могут быть использованы после 12-14 дней непрерывного отбора. Если плотность клеток высока или гибель клеток происходит медленно, подкисление массовой информации следует избегать, и это может быть необходимо увеличить медиа VOLUя (до 4-5 мл) в течение первых нескольких дней отбора.
4. Сбор отобранных колоний (День 12-14)
- Соблюдайте колонии на день 12-14. Соблюдайте колонии, которые готовы подобрать на вскрытии микроскопом и убедиться, что они не содержат клетки, которые начинают дифференцироваться. Примерный размер должен быть 800-1200 мкм. Если колонии достигают этого размера до 12 дня, рекомендуется, что они должны быть собраны тогда.
Примечание: Для каждого эксперимента таргетирования, взять столько колоний, сколько необходимо для обеспечения желаемого генотипа выделяют. В качестве примера, AAVS1 редактирование с шаблоном ремонта AAV-EGFP-CAGGS показал последовательно надежную интеграцию, и требует только 12-24 колонии должны быть выбраны, чтобы получить примерно 5-10 heterozygously целевых клонов. Другие эксперименты, направленные могут потребовать больше колоний быть собраны (Таблица 1). Частота правильных событий нацеливания зависит от таких факторов, как эффективность ССN ввести DSB, размер вставки и стратегии отбора. В случае подхода ловушки ген AAVS1 локуса, представленной здесь, селективный маркер экспрессируется только при правильном интегрированы в сайте-мишени, сокращение числа колоний, необходимых для получения правильной целевой клон. - Однажды, прежде чем выбрать, подготовить 12-луночных планшетах MEFs (2.4 × 10 6 клеток / плита, будет использоваться одна скважина для каждого колонии взял).
- В день сбора, удаления из него все носители 12 и MEF пластин с использованием стеклянной пипетки и вакуум и заменить 1 мл чЭСК СМИ. Кроме того, на день сбора, изменить чЭСК СМИ на 6-луночных планшетах, которые собираются быть определена.
- Потяните стеклянных пипеток для механической диссоциации отдельных колоний от фидерного слоя. Опустите пипетки над капотом в-Бунзена горелки и смягчил в точке расширения до стекла не податлива. Быстро удалить из пламени и потяните пипетки помимо создания угловой точки. Перерывуказывают приблизительно 2 см от изогнутой оси, оставляя узкий канал. Польский конец канала, подвергая воздействию огня в течение 1-2 сек.
Примечание: При желании выбрать колониям пипетки наконечник P20, однако, это может снизить клональности культуры, как скучно наконечник может выбить большее количество клеток из каждой колонии в средствах массовой информации, потенциально загрязняя последующие поживу. - Соберите выбирая устройство, принимая пипетки P1000 фильтра и присоединение всасывания лампы в узком конце. Вставьте вытащил стеклянную пипетку в широком конце.
- Поместите 6-а пластина hPSCs быть определена на этапе вскрытия микроскопом, установленного в капот культуры ткани. Сжатие лампу захватывающего устройства и аккуратно вырезать и вырезать отдельные колонии в 10-20 одинаковых по размеру куски, стараясь не выпустить штук в средствах массовой информации. Возьмите вырезанные куски HPSC колонии в пипетку, выпуская лампу. Попробуйте взять в качестве мало СМИ, как это возможно при передаче.
- Transfэ индивидуальный колонии в отдельную лунку 12-луночного MEF плиты, сжимающей лампу снова непосредственно в скважину, выпуская в настоящее время нарушена колонию. Добавьте в каждую лунку, чтобы однозначно идентифицировать одного клеток, полученных клонов. Повторите столько колоний, сколько необходимо, меняя стеклянной пипетки каждый раз.
Примечание: Сбор колонии может занять некоторое время, чтобы учиться. Рекомендуется практике экспериментатора на некоторых контрольных клеток, прежде чем пытаться изолировать целевые колонии. - Вернуться 12-луночных в инкубатор (37 ° C / 3% O 2/5% CO 2), мягко покачивая тарелку первым избежать накопления клеток в середине каждой лунки.
- На следующий день и каждый последующий день, удалить полный объем средств массовой информации, используя стеклянную пипетку и вакуум и заменить 1,5 мл теплой чЭСК СМИ, пока клетки около 50% сливной (это, как правило, занимает 10-12 дней).
- Через 10-12 дней, выбрать один к двум колоний из каждой лунки и передачи новых 12-а MEF пластин повторноpeating шаги 4.1-4.8 для создания реплики пластины.
- Экстракт ДНК (смотри ниже) от остальных колоний в каждую лунку исходных MEF пластин.
- Удалить СМИ из всех скважин с использованием стеклянной пипетки и вакуум. Пипеток 1 мл PBS 1x в каждую лунку, чтобы промыть клетки. Удалить PBS, используя стеклянную пипетку и вакуум. Пипетка 250 мкл буфера для лизиса клеток (конечные концентрации в H 2 O: 10 мМ Трис HCl, 5 мМ ЭДТА, 0,2% SDS, 200 мМ NaCl, 0,08 мг / мл протеиназы-K) в каждую лунку. Место в инкубаторе (37 ° С / 3% O 2/5% CO 2) O / N.
- На следующий день, пипетки содержимое каждой лунки в отдельные 1,5 мл пробирки. Пипетка 250 мкл изопропилового спирта в каждую пробирку, чтобы осадить ДНК. Встряхнуть пробирку энергично. Белый осадок должен быть виден.
- Спин каждую пробирку в течение 3 мин при 13000 оборотах в минуту в таблице центрифуге. После спином вниз, отбросить супернатант отстаивают в жидких отходов. Небольшой осадок ДНК должна оставаться прилипла к нижней частитрубка. Пипетировать 250 мкл 70% этанола в каждую пробирку, чтобы вымыть осадка ДНК. Энергично встряхивать. Спин каждую пробирку в течение 3 мин при 13000 оборотах в минуту в таблице центрифуге.
- После летел вниз, отбросить супернатант отстаивают в жидких отходов. Небольшой осадок ДНК должна оставаться прилипла к нижней части трубы. Пипетировать остаток от супернатанта таким образом, нет никакой жидкости в барабане. Оставьте трубку, открытую для просушки на настольных течение 5-10 мин. После сушки ресуспендируют ДНК в 250 мкл ТЕ-буфера. Поместите при 37 ° С в течение 6 ч, чтобы позволить ДНК, чтобы растворить.
- Генотип каждого образца с использованием заранее оптимизирована ПЦР или южную стратегию блот.
Примечание:.. Для AAVS1 ориентации с помощью шаблона ремонта AAV-CAGGS-EGFP, южная блот стратегия может быть найден в Hockemeyer др 2009 4 Комплексный Саузернблоттинг протокол может быть найден в Южной 2006 35 Для мультиплексной ПЦР для генотипирования. Тот же самый эксперимент, праймеры и условия могут бытьприведены в таблице 2 36. - Откажитесь скважин, которые не должным образом целевых и продолжить изменение чЭСК СМИ на правильно клеток-мишеней каждый день. Замораживание вниз клетки, когда они находятся примерно 50% сливной см ниже замораживания протокол.
- Однажды перед замораживанием, изменить чЭСК СМИ, удаляя старые средства массовой информации и добавления теплые чЭСК среде с добавлением 10 мкМ Y-27632.
- В день замораживания подготовить 0,5 мл каждого из растворов А и Раствор В каждую лунку 12-луночного планшета, что в настоящее время замораживают в двух 15 мл конические пробирки. Место решения на льду. Решение A: 50% чЭСК СМИ и 50% FBS; Раствор В: 80% FBS и 20% диметилсульфоксида (ДМСО).
- Разбить HPSC колонии в одиночных камерах перед замораживанием. Выполните шаги 2.2-2.8, чтобы сделать это, масштабирование объемов соответственно. Полностью ресуспендируют осадок клеток в 0,5 мл раствора А.
- Добавить 0,5 мл раствора В в клеточной суспензии, пипетки вверх и вниз, чтобы сделать клеточную суспензию однородной. Таке общий объем клеточной суспензии (~ 1 мл) и депозит в 2 мл криоскопической пробирки. Колпачок плотно.
- Место криоскопической в -80 ° С морозильной O / N. На следующий день после замораживания, удалить из замороженных клеток -80 ° C морозильника и сразу поместить в емкости с жидким азотом для долгосрочного хранения.
Representative Results
Здесь мы показываем, протокол, совместимый с трех разных платформах SSN для создания генетически линии HPSC. Мы планировали WIBR # 3 человеческих эмбриональных стволовых клеток в очаге AAVS1 использованием ранее опубликованные ZFNs 4, 5 и Talens CRISPR / Cas9s 37 с помощью шаблона ремонта, что вносит EGFP репортер и сопротивления пуромицину кассету 4.
Мы культивировали наши hPSCs на MEFs для процесса культивирования клеток, позволяющего поддержание и расширение недифференцированных hPSCs (рисунок 2), что также экономически эффективным и масштабируемым. Если клетки выращивали дольше, чем необходимо существует риск повышенной дифференциации, уменьшения количества плюрипотентных клеток, трансфицированных которые и, следовательно, количество правильно целевых колоний, полученных HPSC.
Мы electropораторствовал 5.0 х 10 6 клеток на платформе ПКР и высевали клетки друг от ориентации на одном 6-луночный планшет с DR4 MEFs. После выбора каждая платформа в результате EGFP-положительных колоний (рисунок 3) и комбинации нецелевых, гомозиготно целевых и адресных heterozygously клонов (рис 4А, Б, таблица 3). В условиях, представленных здесь, мы находим, что AAVS1 Talens привело в большинстве EGFP-положительных клонов. Шаблон ремонта используются для этого эксперимента состоит из стыковочной акцепторным сайтом вверх по течению от репортера, и сопротивление пуромицин кассету EGFP. Используя эту стратегию (рисунок 1) "ген-ловушки", конструкция должна вставить в первый интрон локуса AAVS1, используя эндогенный промотор для управления экспрессией кассеты пуромицин сопротивления. Отсутствие промотора запуска экспрессии гена устойчивости к пуромицин в шаблоне ремонта должно предотвратить выражение в событие случайной интеграции.
Таким образом, мы ожидаем, что все пуромицину устойчивых клонов будет ориентирована на AAVS1 сайта. Следует отметить, что подмножество клонов осуществлять интеграцию аберрантных в локусе AAVS1, которые обнаруживаются с помощью саузерн-блоттинга с использованием внутреннего датчика, но не в большинстве стратегий ПЦР (фиг.1; на фиг.4С) 4. Эти интеграционные мероприятия, скорее всего, результат гетерологичных нацеленных событий, ведущих к нескольким интеграции донорского плазмиды 4. Мы выбрали 24 колоний из каждого эксперимента SSN и обнаружили, что все платформы были очень высокие эффективность таргетинга и показал только минимальные различия. В опрошен ПЦР, CRISPR / Cas9 дали наиболее правильно ориентированы, а клоны платформа Тален были самые гомозиготно целевых клонов (таблица 3).
/files/ftp_upload/53583/53583fig1highres.jpg "ширина =" 700 "/>
Рисунок 1. Схема гена отредактировал AAVS1 локус с помощью шаблона ремонта AAV-EGFP-CAGGS. Редактировался Hockemeyer др., 2009 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Колонии WIBR # 3 клеток. Типичные яркие полевые образы колонии WIBR # 3 человека эмбриональные стволовые клетки до к ориентации. Обратите внимание на отсутствие дифференциации и четкое разделение от фидерного слоя в идеальном колонии (слева), в отличие от не-идеального (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. EGFP-положительных WIBR # 3 клетки. Типичные изображения WIBR # 3 клеток целевые с шаблоном ремонта EGFP-выражения в локусе AAVS1. Изображения представительных колоний, отредактированные с ZFNs, Talens и CRISPR / Cas9 показаны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Стратегии генотипирования, чтобы подтвердить правильность таргетинг. (А) представитель ПЦР результаты генотипирования, показывающие нецелевые, гетерозиготных и гомозиготных целенаправленных клонов во всех трех платформ SSN. WT CTL = контроль дикого типа. (Б) предстатель Южные Результаты блот, показывающие гетерозиготную целевой клон и гомозиготный целевой клон обнаружен с внешним зондом 3 '. Фрагмент размеры: WT-6,5 кб, ред-6,9 кб. (С) Типичные Южные результаты, показывающие блот правильно отредактированный клон и клон гетерозиготную с неслучайной двойной интеграции. Фрагмент размеры: Правильно. Редактировалось-6,9 кб, аберрантная Дополнительная интеграция-5 кб Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Изучение | Джин Целевые | Платформа | Ремонт тип шаблона | # Клонов взял | Ориентация эффективность |
| Секстон и др., 2014 | TPP1 | ZFN | GFP-Пуро незарегистрированный | незарегистрированный | |
| Секстон и др., 2014 | ТРЕТ | ZFN | Гигромицин | незарегистрированный | незарегистрированный |
| Hockemeyer и др., 2009 | POU5F1 | ZFN | GFP-Пуро | 31 | 39,0% |
| Hockemeyer и др., 2009 | Pitx3 | ZFN | GFP-Пуро | 74 | 14.9% |
| Hockemeyer и др., 2011 | POU5F1 | Тален | GFP-Пуро | 68 | 91,0% |
| Hockemeyer и др., 2011 | Pitx3 | Тален | GFP-Пуро | 96 | 13.0% |
| Меркле др., 2015 | VASA | Cas9 | Репортер-Генетицин | 139 | 94,0% |
| Меркле др. </ EM>, 2015 | ЦРБ | Cas9 | Репортер-Генетицин | 30 | 93,0% |
| Меркле др., 2015 | HCRT | Cas9 | Репортер-Генетицин | 154 | 92,0% |
| Меркле др., 2015 | HMX2 | Cas9 | Репортер-Генетицин | 11 | 45,0% |
| Форстер и др., 2014 | LRG5-Nterm | ZFN | GFP-Пуро | незарегистрированный | 30,0% |
| Форстер и др., 2014 | LRG5-Cterm | ZFN | GFP-Пуро | незарегистрированный | 14,0% |
| Зольднера др., 2011 | SNCA | ZFN | Пуро | 96 | 1,0% |
Таблица 1. Описание других генов целевых использовании этого метода, с соответствуюветствующие ориентации эффективности, взятые из ранее опубликованных исследований. 4,5,38-41
| Местоположение | Последовательность | Заметки |
| AAVS1-F грунт | CTCTAACGCTGCCGTCTCTC | ПЦР условия: T = 57 м ° C, 35 циклов |
| AAVS1-WT-R грунт | GCTTCTCCTCTTGGGAAGTG | WT группа: 1273 б.п. |
| AAVS1-целевой праймер-R | CGTCACCGCATGTTAGAAGA | Целевые группы: 992 б.п. |
| Т2-Cas9-гид | GGGCCACTAGGGACAGGAT | От Мали и др. 2013 |
| AAVS1-ZFN-правой | TAGGGACAGGAT | От Hockemeyer др., 2009 |
| AAVS1-ZFN-влево | TGGGGTGTCACC | От Hockemeyer др., 2009 |
| AAVS1-Тален-правой | TCCTAACCACTGTCTTT | От Hockemeyer др., 2011 |
| AAVS1-Тален-влево | CCCCTCCACCCCACAGT | От Hockemeyer др., 2011 |
Таблица 2. Список праймеров и SSN направляющих последовательностей.
| Ориентация Построить | Количество EGFP + колоний | Целевые определена клонов (ПЦР проверено) | Предыдущая Сообщается Правильный таргетинг Эффективность (по Саузерну) |
| ZFN | 150 | 86,9% (73,9% гет / 13.0% гомо) | 56% (50% Het / 6% гомо) |
| Тален | 412 | 91,3% (47,8% гет / 39,1% гомо) | 47% (37,5% гет / 9.3% гомо) |
| CRISPR-Cas9 | 235 | 95,7% (69,5% Het / 26,3% гомо) | незарегистрированный |
Таблица 3. Сравнительные номера EGFP-положительных и направлены Тален, ZFn и ПЦР CRISPR / Cas9 колонии стволовых клеток человека. Проверяется интеграции в локус AAVS1 для этого эксперимента по сравнению с Саузерну проверено надлежащие односпальные интеграции в предыдущих экспериментах 4,5.
Discussion
Метод, представленный здесь, для выделения однородных популяций генетически отредактировал человека плюрипотентных стволовых клеток является мощным подход для создания изогенные HPSC линии, которые отличаются только в целевой локуса. Эти клетки идеальной системой для исследования механизмов клеточной дифференцировки и развития человека, а также для понимания патофизиологии моногенных заболеваний в контролируемой генной обстановке. Как показано здесь, можно использовать три независимых АПЛ разработки стратегий (ZFNs, Talens и CRISPR / Cas9), чтобы достичь целевой интеграции в локусе AAVS1. Каждый из этих методик имеет свои преимущества и недостатки. Потенциальное преимущество ZFNs и, в некоторой степени, Talens их гибкость конструкции, которая позволяет итеративный инженерии с целью улучшения ДНК-связывающие домены отдельных нуклеаз 42. Эта оптимизация нуклеазы может увеличить специфичность ZFNs и Talens сверх того, что достижимо с ЧРИСистема ППР / Cas9. Такая избирательность может быть важным для клинических применений, требующих высокой степени специфичности мишени. Основное преимущество в CRISPR системы / Cas9 является его простота в использовании. Хотя Тален и ZFn строительные наборы были доступны для общественности (т.е., через Addgene 21), CRISPR / ПЛА Cas9 основе значительно легче построить, как только нужно изготовление на заказ 20 пар оснований олигонуклеотидов (при использовании px330 плазмиды дизайн 14). Эта простота оказывается выгодным для научно-исследовательских лабораторий, стремящихся включают редактирование генома в учебе.
Есть альтернативные способы трансфекции, в том числе nucleofection 43, чтобы создать генные отредактированы HPSC линии; Однако электропорации было показано, быть последовательным и экономически эффективным 4,5,25. Nucleofection может быть использован непосредственно трансфекции Cas9-Гид РНК рибонуклеопротеидные комплексы в ядро, увеличивая эффективность ап SSNд верность 44. Растущая hPSCs на MEFs это надежный и недорогой способ поддержания hPSCs в плюрипотентных государства без чрезмерного дифференциации. Кроме того, это позволяет для легкой изоляции генетически идентичных колоний. В качестве альтернативы, можно культуры hPSCs без MEFs, однако эти условия культивирования может быть более дорогим, чем культур, основанных подачи. Кроме того, весь процесс является масштабируемым, что позволяет для выделения очень редких событий редактирования или генерации многих различных клеточных линий в параллельных экспериментах редактирования.
Протокол, описанный здесь, является надежной; Однако есть несколько ключевых шагов, которые влияют на эффективность, с которой правильно редактировалось клонов могут быть получены. Наиболее важным компонентом этого метода является имеющих высокие MEFs качества и резистентных MEFs DR4. Выживание отдельных hPSCs является неопределенным, и низкого качества МЭФ будет препятствовать изоляции недифференцированных линий HPSC. Во-вторых, использование Y-27632 такжеКлюч к выживанию позволяют одной клетки без генерации селективное давление, клетки с аномальным кариотипом в 45. В-третьих, выбирая хорошо расположенные колонии обеспечивает генетическую однородность полученных клеточных линий. Наконец, важно, чтобы подготовить стеклянные пипетки так, чтобы отверстие достаточно мал, чтобы разорвать колонии на множество мелких частей, гарантируя, что несколько колоний будет расти в новой скважины. Это позволяет комплектование хорошо расположенных субклонами для реплики пластины, чтобы в культуре, оставляя исходный тарелку изолированных колоний для генотипирования. Сложная часть в этом протоколе является руководство вытягивания стеклянных пипеток; это должно быть осуществлено заранее. Следует отметить, что существует несколько методик клона сбора, которые не требуют стеклянной пипетки. Экспериментаторы рекомендуется, чтобы найти тот, который лучше всего подходит для них.
Есть ограничения к этому протоколу, который можно преодолеть с помощью простых изменений. Эксперимент предназначен для выводаолько нарушить локус интерес, без ремонта или один, чья ремонт шаблон не содержит кассету выбора, необходимо использовать другой метод обогащения для клеток, которые были отредактированы. Следует отметить, что число колоний, которые должны быть выбраны, чтобы найти позитивный клон значительно увеличивает в отсутствие селекции. Одна из стратегий для повышения эффективности заключается в совместном трансфекции неинтегрирующих плазмиду, которая экспрессирует флуоресцентный белок. После позволяя клеткам восстановиться в течение двух дней, клетки-мишени могут быть отсортированы по положительной флуоресценции с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток и пересевали 29. Этот процесс обогащает клеток, которые были трансфицированы были плазмидами посредством электропорации, и тем самым увеличивает вероятность одновременной случае редактирования в клетке.
Методы, описанные здесь, могут быть распространены на несколько направляющих использовать РНК, чтобы одновременно нацелены нескольких локусов 14,46,47. Многие протоколы были созданы, чтобы дифференцировать hPSCsв различных типах клеток, позволяя различные генетические манипуляции в типах клеток, представляющих интерес 30. В целом, мы продемонстрировали потенциал для эффективного редактирования генома в hPSCs независимо от SSN выбора. Мы полагаем, что эта методика может быть адаптирована для создания изогенных линий HPSC, которые были гена-отредактированные в любое геномного локуса.
Disclosures
Авторы заявляют никакого конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Brain Research Foundation семян Грант (BRFSG-2014-02) к Хелен Bateup. Дирк Hockemeyer является Нью ученый в старения Эллисона Медицинский фонд и поддерживается Гленн Фонда, а также в The Shurl и Кей Курчи фонда. DH также поддерживается NIH грант 1R01CA196884-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320082 | |
| Fetal Bovine Serum (HI) | Life Technologies | 10082-147 | |
| Knockout Serum | Life Technologies | 10828-028 | |
| Fibroblast Growth Factor - basic | Life Technologies | PHG0261 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Y-27632 | Calbiochem | 688000 | |
| 6-well plates | Corning | 3506 | |
| 12-well plates | Corning | 3512 | |
| 4 mm Electroporation cuvettes | Bio-rad | 165-2081 | |
| X-cel gene pulser II | Bio-rad | 165-2661 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| 10× Phosphate buffered saline (PBS) pH7.4 | Life Technologies | 70011-044 | |
| Puromycin | Life Technologies | A11138-02 | |
| Pasteur pipettes, plugged | VWR | 14672-412 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | S5941 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Proteinase-K | Life Technologies | AM2544 | |
| Ethanol | VWR | TX89125-172SFU | |
| Isopropyl Alcohol | VWR | MK303216 | |
| TE Buffer | Life Technologies | 12090-015 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 1.8 ml Cryotubes | ThermoScientific | 377267 |
References
- Carroll, D. Genome engineering with targetable nucleases. Annu Rev Biochem. 83, 409-439 (2014).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery. Sci Transl Med. 6 (239), 239ps6 (2014).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol. 27 (9), 851-857 (2009).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29 (8), 731-734 (2011).
- Bozas, A., Beumer, K. J., Trautman, J. K., Carroll, D. Genetic analysis of zinc-finger nuclease-induced gene targeting in drosophila. Genetics. 182 (3), 641-651 (2009).
- Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
- DeKelver, R. C., et al. Functional genomics, proteomics, and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome. Genome Res. 20 (8), 1133-1142 (2010).
- Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435 (7042), 646-651 (2005).
- Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jinek, M., East, A., Cheng, A., Lin, S., Ma, E., Doudna, J. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, e00471 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. the new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Jasin, M. Genetic manipulation of genomes with rare-cutting endonucleases. Trends Genet. 12 (6), 224-228 (1996).
- Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).
- Sander, J. D., Maeder, M. L., Reyon, D., Voytas, D. F., Joung, J. K., Dobbs, D. ZiFiT (zinc finger targeter): An updated zinc finger engineering tool. Nucleic Acids Res. 38, W462-W468 (2010).
- Carroll, D., Morton, J. J., Beumer, K. J., Segal, D. J. Design, construction and in vitro testing of zinc finger nucleases. Nat Protoc. 1 (3), 1329-1341 (2006).
- Chen, F., et al. High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases. Nat Methods. 8 (9), 753-755 (2011).
- Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (12), e82 (2011).
- Reyon, D., Tsai, S. Q., Khayter, C., Foden, J. A., Sander, J. D., Joung, J. K. FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing. Nat Biotechnol. 30 (5), 460-465 (2012).
- Sanjana, N. E., Cong, L., Zhou, Y., Cunniff, M. M., Feng, G., Zhang, F. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nat Protoc. 7 (1), 171-192 (2012).
- Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from neisseria meningitidis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (39), 15644-15649 (2013).
- Podhajska, A. J., Szybalski, W. Conversion of the FokI endonuclease to a universal restriction enzyme: Cleavage of phage M13mp7 DNA at predetermined sites. Gene. 40 (2-3), 175-182 (1985).
- Costa, M., et al. A method for genetic modification of human embryonic stem cells using electroporation. Nat Protoc. 2 (4), 792-796 (2007).
- Chambers, S. M., Fasano, C. A., Papapetrou, E. P., Tomishima, M., Sadelain, M., Studer, L. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
- Cai, J., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).
- Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 108 (3), 407-414 (2001).
- Soldner, F., et al. Parkinson's disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors. Cell. 136 (5), 964-977 (2009).
- Wen, Z., et al. Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders. Nature. 515 (7527), 414-418 (2014).
- Chiba, K., Hockemeyer, D. Genome editing in human pluripotent stem cells using site-specific nucleases. Methods Mol Biol. 1239, 267-280 (2015).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
- Ezashi, T., Das, P., Roberts, R. M. Low O2 tensions and the prevention of differentiation of hES cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (13), 4783-4788 (2005).
- Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes. Nucleic Acids Res. 25 (18), 3745-3746 (1997).
- Southern, E.
- Henegariu, O., Heerema, N. A., Dlouhy, S. R., Vance, G. H., Vogt, P. H. Multiplex PCR: Critical parameters and step-by-step protocol. BioTechniques. 23 (3), 504-511 (1997).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Sexton, A. N., et al. Genetic and molecular identification of three human TPP1 functions in telomerase action: Recruitment, activation, and homeostasis set point regulation. Genes Dev. 28 (17), 1885-1899 (2014).
- Merkle, F. T., et al. Efficient CRISPR-Cas9-mediated generation of knockin human pluripotent stem cells lacking undesired mutations at the targeted locus. Cell Rep. 11 (6), 875-883 (2015).
- Soldner, F., et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset parkinson point mutations. Cell. 146 (2), 318-331 (2011).
- Forster, R., et al. Human intestinal tissue with adult stem cell properties derived from pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2 (6), 838-852 (2014).
- Miller, J. C., et al. Improved specificity of TALE-based genome editing using an expanded RVD repertoire. Nat Methods. , (2015).
- Hohenstein, K. A., Pyle, A. D., Chern, J. Y., Lock, L. F., Donovan, P. J. Nucleofection mediates high-efficiency stable gene knockdown and transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 26 (6), 1436-1443 (2008).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system. Sci Rep. 4, 5400 (2014).
- Ousterout, D. G., Kabadi, A. M., Thakore, P. I., Majoros, W. H., Reddy, T. E., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 6, 6244 (2015).
