Abstract
Genome-redigering av humana pluripotenta stamceller (hPSCs) ger en genetiskt styrd och kliniskt relevant plattform för att förstå människans utveckling och undersöka patofysiologin av sjukdomar. Genom att använda platsspecifika nukleaser (SSNs) för genom redigering, blir snabbt härledning av nya hPSC linjer hyser specifika genetiska förändringar i en annars isogen inställning möjlig. Zinkfinger nukleaser (ZFNs), transkriptionsaktivator liknande effektor nukleaser (Talens) och klustrade regelbundet mellanrum korta palindromiska upprepningar (crispr) / Cas9 är de vanligaste SSNs. Alla dessa nukleaser fungera genom att införa en dubbelsträngad DNA paus vid en specificerad plats och därigenom främja exakta gen redigering vid en genomisk lokus. SSN-mediterade genomet redigering utnyttjar två av cellens endogena DNA-reparationsmekanismer, icke-homolog ände ansluter (NHEJ) och homologi riktad reparation (HDR), att antingen införa insättnings / deletionsmutationer eller alter genomet med hjälp av en homolog reparations mall på platsen av den dubbelsträngade paus. Elektroporering av hPSCs är ett effektivt sätt att transfektera SSNs och reparations mallar som innehåller transgener såsom fluorescerande reportrar och antibiotikaresistens kassetter. Efter elektroporering, är det möjligt att isolera enbart de hPSCs som inkorporerade reparationen konstruktionen genom att selektera för antibiotikaresistens. Mekanisk separation hPSC kolonier och bekräftar korrekt integration på målplatsen genom genotypning medger isolering av korrekt målinriktade och genetiskt homogena cellinjer. Giltighetstiden för detta protokoll visas här genom alla tre SSN plattformar för att införliva EGFP och puromycinresistens bygga i AAVS1 safe harbor locus i humana pluripotenta stamceller.
Introduction
Genome redigering teknik snabbt utvecklas till standardverktyg för molekylär och cellbiologi 1. Genteknik av humana pluripotenta stamceller (hPSCs) är av särskilt intresse som hPSCs representerar en självförnyande källa av genetiskt intakta primära humana celler. hPSCs kan differentieras till olika celltyper för sjukdomsmodellering eller som en källa för transplantationsterapier 2,3. Dokumenterad här är ett protokoll som använder tre olika typer av platsspecifika nukleaser (SSNS) i samband med endogena DNA-reparationsmekanismer för målinriktad integrering av en reporterkonstruktion på AAVS1 locus. Efter transfektion av SSNs i hPSCs visar vi hur man isolerar isogena cellpopulationer hyser reportern.
Förmågan att manipulera genomen, särskilt pluripotenta stamceller genom, är att inte använda SSNs ett nytt fenomen som nyttan av zinkfinger nukleaser (ZFNs) och transkriptions AKTIVERAeller liknande effektor nukleaser (Talens) för gen redigering visades för flera år sedan 4-10. Men med tillkomsten av S. pyogenes crispr / Cas9 teknik 11-13, har genen redigering blivit allmänt tillgängliga 14. Alla SSNs införa en dubbelsträngad DNA-break (DSB) vid den angivna målplatsen 1,4,5,11 som repareras av endogena cellulära mekanismer med antingen icke-homolog-ändförening (NHEJ) eller homologi riktad reparation (HDR) 15. NHEJ är felbenägen och kan införa ram skift mutationer som resulterar i förlust av geners funktion, medan HDR möjliggör nya element att införas genom samtransfektion av en reparations mall med SSN. Även om de grundläggande principerna för DNA-reparation som underlättar gen redigering tros vara i stort sett densamma för varje SSN, kan noteras vissa skillnader mellan plattformarna. De novo utformning av ZFNs ger flexibilitet och nukleas optimering 16, men användningen av offentligttillgängliga bibliotek montering och screeningverktyg för att utforma individuella ZFNs kan vara tidskrävande. När den önskade locus för ZFN-medierad inriktning bestäms, kan ZFN par utformas med onlineverktyget ZiFit 17. Efter design kan ZFNs vara modulärt monteras genom flera omgångar av plasmid kloning 18. Alternativt finns det många kommersiellt tillgängliga, pre-validerade ZFNs 19. Tale nukleaser kan också utformas med hjälp av online-verktyg och offentligt tillgängliga komponenter 17,20. Till exempel kan Talens snabbt monteras från block om fem tale upprepningar, genom FLASH aggregatet 21 eller med användning av PCR-baserad hierarkisk Golden Gate aggregatet 22. Enkel SSN design och hastighet konstruktion med hjälp crispr / Cas9 har gjort genom att redigera ett allmänt tillgängligt verktyg. Den korta Guide RNA-medierad inriktning av crispr / Cas9 gör det också möjligt för multiplexering av styr RNA att rikta flera loci med en enda konstruktion 14. Designenav Cas9 för gen redigering kräver endast identifiering av en protospacer intilliggande motiv (PAM, en NGG trinukleotiden för S. pyrogenes Cas9) proximal till målstället. Genom att föra in en oligonukleotid som motsvarar de 20 baspar 5 'av PAM i px330 plasmiden 14, kan konstruktionen vara sammansatta i ett kloningssteg. Förutom till S. pyogenes Cas9, Cas9 från N. meningitidis (NmCas9) som känner igen en 5'-NNNNGATT-3 '(PAM) har visat sig möjliggöra effektiv gen-redigering i hPSCs 23.
Förutom skillnaderna i enkel SSN utformning, har varje plattform specifika egenskaper. Till exempel, ZFNs och Talens utnyttja Fokl nukleas domän, vilket genererar en fyra nukleotid 5 'överhäng 24 medan Cas9 tros generera mest trubbiga DSB. ZFNs, Talens och Cas9 skiljer sig åt i sina protein stabiliteter, på-av räntan på mål-DNA, och sättet för DNA-skanning, vilka alla cOuld teoretiskt leda till små skillnader i redigerings resultatet 1. Medan ytterligare studier kommer att krävas för att till fullo förstå konsekvenserna av dessa skillnader, beskriver vi här ett protokoll som är mycket robust i alla tre plattformar och kan användas för att enkelt skapa genetiskt modifierade hPSCs.
Oavsett SSN val, elektroporering ett stabilt förfarande för att transfektera SSNs och homologireparations mallar i hPSCs 25. Antalet överlevande kolonier efter selektion för antibiotikaresistens beror på ställesspecifika parametrar och redigeringsstrategin (t.ex., storleken av transgen insatsen och urvalssätt). Protokollet som beskrivs här resulterar vanligtvis i ca 150-400 encelliga härledda kolonier.
Gene-redigering på AAVS1 locus användning av detta protokoll har tidigare använts för att demonstrera effektiviteten av SSNs 4,5. AAV-CAGGS-EGFP reparation mall använder en gen fälla strategy att förläna puromycinresistens i ett lokus specifikt sätt. I korthet innehåller den mall reparera ett splitsningsacceptorställe uppströms den promotor puromycinresistens kassett. Vid korrekt integrering i den första intronen av PPP1R12C genen vid AAVS1 lokuset motståndet kassetten uttrycks från den redigerade genens promotor. Robustheten i denna specifika AAVS1 analys tillåter oss att jämföra effektiviteten hos varje SSN-plattformen.
Gene redigering med hjälp SSNs är kraftfull ges möjlighet att störa och / eller ändra teoretiskt vilken gen som helst. Att tillämpa denna strategi till hPSCs ger mångsidighet som hPSCs kan därefter differentieras till ett stort antal humana celltyper såsom neuroner 26, hepatocyter 27 och kardiomyocyter 28. Dessutom kan användningen av patienthärledda inducerade pluripotenta stamceller medger reparation eller införande av kända sjukdomsalstrande mutationer i en patientspecifik genetisk bakgrund 29 30. Sammanfattningsvis är gen redigering i hPSCs en effektiv och mångsidig strategi för att undersöka grundläggande biologi mänsklig utveckling och sjukdom 31.
Protocol
De procedurer som beskrivs i detta manuskript har granskats och godkänts av UC Berkeley stamcellsforskning tillsynskommitté.
1. Förbered stamceller för redigering
- Odla och kultur humana pluripotenta stamceller (hPSCs) på en 6-brunnars platta innehållande 2,4 x 10 6 celler / platta av mitomycin C-inaktiverade mus embryonala fibroblaster (MEF) matare odlas på gelatin 32. Behåll hPSCs i 3 ml mänskliga embryonala stamcellsmedier per brunn (hESC media) och växa i en 37 ° C inkubator med 3% O 2/5% CO2.
Obs: För att lyckas med detta protokoll, är det inte nödvändigt att upprätthålla hPSCs i en låg syrehalt inkubator; men det är viktigt att notera att hPSCs förökar snabbare i en hög O 2 miljö, så gånger och cellantal bör justeras därefter. Det bör också noteras att hPSCs hållna i låg syrehalt har lägre hastigheter av spontan differentiering 33.- To göra 500 ml hESC medium kombinera 380 ml DMEM / F12, 75 ml fetalt bovint serum (FBS), 25 ml Knockout Serum Byte (KSR). Lägg glutamin (1 mM slutkoncentration), 5 ml 100x Icke-essentiella aminosyror, 100 enheter / ml penicillin-streptomycin (P / S), basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) (4 ng / ml slutkoncentration), och 2- merkaptoetanol (5,5 ^ M slutlig koncentration).
- Ändra medium genom att ta bort hela volymen av media (3 ml) med användning av en glaspipett och vakuum. Ersätt med 3 ml varm hESC media med en serologisk pipett. Upprepa medier förändras varje dag tills hPSCs är ungefär 50% konfluenta (dag -1).
- En dag innan inriktning (dag -1), ändra hESC media, ta bort de gamla medierna och lägga varma hESC medium kompletterat med 10 | iM Y-27632.
- Också på dag -1, förbereda en till två 6-well eller 10 cm plattor av läkemedelsresistenta MEF matarceller från DR4 möss (2,4 x 10 6 celler / platta) 34.
Obs: I allmänhet 6 brunnars plattor är adaktigt över 10 cm plattor, eftersom de rymma fler medier. 6 brunnsplattor också se till att olika kloner från olika brunnar är oberoende. Dock kommer en 10 cm platta tillåta lättare plockning, beroende på mikroskopet för den här processen.
2. Redigera pluripotenta stamceller
- Bered transfektion lösningar genom att pipettera 5 | ag vardera av ZFN 1 och 2, Talen 1 och 2, eller 15 ug av crispr / Cas9 px330 kodande plasmiden (figur 1) i ett 1,5 ml rör. Pipett 30 mikrogram av reparations plasmid i detta rör liksom. Slutligen, pipett 1x Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i röret för att bringa volymen upp till 300 pl.
Obs: Förbered plasmider som Midiprep (alla kit är lämpligt) med en minsta koncentration av 300 ng / l för att hålla den totala volymen av transfektion lösningen under 300 ^. Det är inte nödvändigt att utföra fenol / kloroformextraktion, att linearisera plasmiden, eller att använda en endotoxin fri plasmid prep-kit. - Ta ut mediet från hPSCs med hjälp av en glaspipett och vakuum. Pipettera 2 ml varm 1x PBS i varje brunn för att tvätta cellerna.
- Ta bort PBS omedelbart med en glaspipett och vakuum. Lägg 0,5 ml 0,25% trypsin-EDTA-lösning direkt på celler i varje brunn. Placera i inkubator (37 ° C / 5% CO2 / tre% O 2) under ca 10 minuter. eller tills matarskikt börjar lyfta av plattan.
- Tillsätt 2 ml varm esWash medium (470 ml DMEM / F12, 25 ml FBS, 100 enheter / ml P / S) till varje brunn för att stoppa trypsin reaktionen.
- Se till att matarceller komma ut som ett ark. Pipet innehållet i varje brunn i en enda 50 ml koniskt rör, som kombinerar alla brunnar. Mal sönder celler med användning av en 10 ml serologisk pipett. Det är inte nödvändigt att bryta upp matarskikt; hPSCs kommer bort från matarskikt genom försiktig finfördelning. Det bör vara omkring 15 ml av cellsuspensionen.
- Tillsätt 25 ml esWash medium till röret för att bringa VOLUmig upp till 40 ml totalt. Tillåt stora matar bitar att lösa på botten av röret i 1-2 min. Avlägsna supernatanten (~ 38 ml) från röret med hjälp av en serologisk pipett och insättning i en ny 50 ml koniska rör.
- Centrifugera ner under 5 minuter vid 190 x g. Avlägsna supernatanten från röret med hjälp av en glaspipett och vakuum. Var noga med att inte störa cellpelleten. Resuspendera cellerna i 500 ^ il 1 x PBS. Kombinera med plasmidtransfektion lösning framställd tidigare. Räkna cellerna vid det här steget. Använd 5-10 miljoner celler per elektroporering.
- Pipett hela 800 pl suspension i en 4 mm elektroporeringskyvett, placera på is i 3-5 minuter. Elektroporera celler genom att använda den exponentiella program på elektrosystem med följande parametrar: 250 V, 500 iF, ∞ motstånd, och 4 mm kyvett storlek. Efter elektroporering, placera kyvetten tillbaka på is under 3 min.
Notera: Observera tidskonstant elektroporering på elektroporering systemet. Tidskonstantenvarierar med antalet celler och DNA-renhet. Framgångsrika transfektioner har oftast en tidskonstant mellan 10-14 ms vid användning av de angivna förhållanden och en gen puls II. Lägre elektroporering effektivitetsvinster kan uppstå när tidskonstanter varierar från dessa värden. - Resuspendera elektroporerade cellerna i 18 ml varm hESC medium kompletterat med 10 | iM Y-27.632. Plansch 3 ml av denna enkelcellsuspension i varje brunn i en 6-brunnsplatta med DR4 matarceller. Återgå till inkubator (37 ° C / 5% CO2 / tre% O 2).
3. Val av positiva kolonier
- Dag 2, ta bort alla media som använder en glaspipett och vakuum. Ersätt med 3 ml varmt hESC media kompletterade med 10 | iM Y-27.632. Dag 3, ta bort alla media som använder en glaspipett och vakuum. Ersätt med 3 ml varm hESC medier utan inklusive Y-27632. Dag 4, ta bort alla media som använder en glaspipett och vakuum. Ersätt med 3 ml varm hESC medium kompletterat med antibiotika för selectipå. Återgå till inkubator (37 ° C / 5% CO2 / tre% O 2).
Obs: Den typ av antibiotikum som används kommer att bero på motståndet kassetten som ingår i mall reparation. Vid arbete med WIBR # 3 hPSCs (NIH register 0079), 0,5 ^ g / ml puromycin, 70 | ig / ml G418 (geneticin), och 35 | ig / ml hygromycin har använts med framgång. Koncentrationer för urval bör bestämmas empiriskt genom att fastställa den minimala koncentration av antibiotikum som krävs för att döda celler av vild typ inom cirka en vecka. - Dagar 5-12, ändra media varje dag, som ersätter gamla medier varje gång med varma hESC medium kompletterat med antibiotika.
Obs: Räkna med en stor mängd av celldöd. Individuella kolonier kommer att framgå omkring dag 8-10. Regelbunden hESC medier utan antibiotika kan användas efter 12-14 dagars kontinuerlig val. Om celltätheten är hög eller celldöd är långsam, bör surgöring av medierna undvikas och det kan vara nödvändigt att öka media VOLUmig (upp till 4-5 ml) under de första dagarna av markeringen.
4. Plocka Valda kolonier (dag 12-14)
- Följ kolonier på dag 12-14. Observera kolonierna som är redo att plocka på en dissektion mikroskop och se till att de inte innehåller celler som börjar differentiera. Den ungefärliga storlek bör vara 800-1200 uM. Om kolonier når denna storlek innan dag 12, rekommenderas att de ska plockas sedan.
Obs: För varje inriktning experiment, plocka så många kolonier som behövs för att säkerställa den önskade genotypen isoleras. Som ett exempel, har AAVS1 redigering med reparations mall AAV-CAGGS-EGFP visas genomgående robust integration, och kräver endast 12-24 kolonier att plockas att erhålla cirka 5-10 heterozygously riktade kloner. Andra inriktnings experiment kan kräva fler kolonier som ska plockas (tabell 1). Frekvensen av korrekta inriktnings händelser beror på sådana faktorer som effektivitet av SSN för att införa en DSB, storleken på insättningen, och urvalet strategin. I fallet med geninfångningstillvägagångssättet för AAVS1 lokuset som presenteras här, är selektionsmarkören uttrycks endast när den är korrekt integrerad vid målstället, vilket minskar antalet kolonier som krävs för att erhålla en korrekt riktad klon. - En dag innan plocka, förbereda 12-brunnars plattor av MEF (2,4 x 10 6 celler / platta, kommer en väl användas för varje koloni plockas).
- På dagen för plockning, ta bort alla media från de 12 väl MEF plattor med hjälp av en glaspipett och vakuum och ersätta med 1 ml hESC media. Även på dagen för plockning, ändra hESC media på 6 brunnsplattor som kommer att plockas.
- Dra glaspipetter för mekanisk dissociation av individuella kolonier från matarskikt. Sänk pipetterna under en in-hood bunsenbrännare och mjukas vid expansions punkt tills glaset är formbar. Snabbt bort från eld och dra pipetten isär skapa en vinkelpunkt. Brytpunkt ungefär 2 cm från den böjda axeln, lämnar en smal kanal. Polera änden av kanalen genom exponering för eld för 1-2 sek.
Obs: Valfritt plocka kolonier en p20 pipettspets, kan den däremot minska klonalitet av kulturen, som den tråkiga spetsen kan rubba större mängder av celler från varje koloni i mediet, potentiellt förorenande efterföljande smulor. - Montera plocka enhet genom att ta en P1000 filter pipettspets och fästa en sugbälgen till den smala änden. Sätt drog glaspipett i den breda änden.
- Placera en 6-brunnsplatta av hPSCs som skall plockas på scenen av ett dissektionsmikroskop monterad i en vävnadsodling huva. Komprimera lampan av plockanordningen och försiktigt skära och klippa en enskild koloni i 10-20 lika stora bitar, noga med att inte släppa bitar i media. Ta utskurna hPSC delar av kolonin i pipetten genom att släppa lampan. Försök att ta så lite medier som möjligt vid överföring.
- ÖverfER de enskilda kolonin till en enda brunn i en 12-väl MEF plattan, komprimera lampan igen direkt i brunnen, släpper nu brutit kolonin. Märk varje brunn för att möjliggöra unik identifiering av encelliga härledda kloner. Upprepa så många kolonier som nödvändiga, ändra glaspipett varje gång.
Obs: Plocka kolonier kan ta lite tid att lära sig. Det rekommenderas att försöks praxis på vissa kontrollceller innan du försöker isolera riktade kolonier. - Avkastning 12 brunnsplattor till inkubatorn (37 ° C / 3% O 2/5% CO2), försiktigt vaggande plattan först för att undvika ackumulering av celler i mitten av varje brunn.
- Nästa dag och varje efterföljande dag, ta bort hela volymen av media med en glaspipett och vakuum och ersätta med 1,5 ml varm hESC media tills cellerna är omkring 50% sammanflytande (detta brukar ta 10-12 dagar).
- Efter 10-12 dagar, plocka en till två kolonier från varje brunn och överföra till nya 12-såväl MEF plattor repeating steg 4,1-4,8 för att generera en replik platta.
- Extrahera DNA (se nedan) från de återstående kolonierna i varje brunn av de ursprungliga MEF plattorna.
- Ta ut mediet från alla brunnar med hjälp av en glaspipett och vakuum. Pipettera 1 ml 1 x PBS på varje brunn för att tvätta cellerna. Ta bort PBS med hjälp av glaspipett och vakuum. Pipettera 250 | il av cellysbuffert (slutkoncentrationer i H2O: 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 0,2% SDS, 200 mM NaCl, 0,08 mg / ml proteinas-K) på varje brunn. Placera i inkubator (37 ° C / 3% O 2/5% CO2) O / N.
- Nästa dag, pipett innehållet i varje brunn i individuella 1,5 ml rör. Pipettera 250 | il av isopropylalkohol till varje rör för att fälla ut DNA: t. Skaka röret kraftigt. En vit fällning ska synas.
- Spin varje rör ner för 3 minuter vid 13000 rpm i en bordscentrifug. Efter dragning nedåt, kassera supernatanten genom dekantering i flytande avfall. En liten DNA-tabletten bör förbli fastnat i botten avröret. Pipettera 250 | il av 70% etanol i varje rör för att tvätta DNA-pelleten. Skaka kraftigt. Spin varje rör ner för 3 minuter vid 13000 rpm i en bordscentrifug.
- Efter spinning ner, kassera supernatanten genom dekantering i flytande avfall. En liten DNA-tabletten bör förbli fastnat på botten av röret. Pipettera ut resten av supematanten så det finns ingen vätska kvar i röret. Lämna rör öppet torka på bänk under 5-10 min. Efter torkning, återsuspendera DNA i 250 | il TE-buffert. Placera vid 37 ° C under 6 h för att tillåta DNA att upplösas.
- Genotyp varje prov med hjälp av en pre-optimerat PCR eller Southern blot strategi.
Anm:.. För AAVS1 inriktning använder reparationsmallen AAV-CAGGS-EGFP, kan den sydliga blot strategi hittas i Hockemeyer et al, kan 2009 4 En omfattande Southern blotting protokoll finns i södra, 2006 35 För multiplex PCR genotypning av. samma experiment, kan primers och villkor varaåterfinns i Tabell 2 36. - Kasta brunnar som inte är ordentligt målinriktade och fortsätta ändra hESC media på rätt målceller varje dag. Frys ner cellerna när de är ungefär 50% sammanflytande, se nedan för frysning protokollet.
- En dag före frysning, ändra hESC media, ta bort de gamla medierna och lägga varma hESC medium kompletterat med 10 | iM Y-27632.
- På dagen för frysning förbereda 0,5 ml vardera av lösning A och lösning B per brunn i en 12-brunnsplatta som håller på att frysas ned i två 15 ml koniska rör. Placera lösningar på is. Lösning A: 50% hESC media och 50% FBS; Lösning B: 80% FBS och 20% dimetylsulfoxid (DMSO).
- Dissociera hPSC kolonier till enskilda celler före frysning. Följ steg 2,2-2,8 för att göra detta, skalning volymer därefter. Fullt återsuspendera cellpelleten i 0,5 ml av lösning A.
- Lägg 0,5 ml lösning B till cellsuspensionen, pipettera upp och ner för att göra cellsuspension homogen. Take den totala volymen av cellsuspensionen (~ 1 ml) och insättning in i en 2 ml cryotube. Skruvkork på tätt.
- Placera cryotube i en -80 ° C frysan O / N. Dagen efter frysning, avlägsna frusna celler från -80 ° C frys och placera omedelbart i flytande kväve tank för långtidslagring.
Representative Results
Här visar vi ett protokoll kompatibel med tre olika SSN plattformar för att skapa genetiskt modifierade hPSC linjer. Vi riktade WIBR # 3 mänskliga embryonala stamceller på AAVS1 locus med hjälp av tidigare publicerade ZFNs 4, Talens 5 och crispr / Cas9s 37 hjälp av en mall reparation som introducerar en EGFP reporter och en puromycinresistens kassett 4.
Vi odlade våra hPSCs på MEF för en cellodlings arbetsflöde medger underhåll och utbyggnad av odifferentierade hPSCs (Figur 2), som också är kostnadseffektiv och skalbar. Om celler odlas längre än nödvändigt finns det en risk för ökad differentiering, minska antalet av pluripotenta celler som transfekteras och följaktligen antalet korrekt riktade hPSC kolonier erhållna.
Vi electroporated 5,0 x 10 6 celler per SSN-plattformen och ströks cellerna från varje inriktning på en enda 6 brunnar av DR4 MEF. Efter valet, varje plattform resulterade i EGFP-positiva kolonier (Figur 3) och en kombination av oriktade, homozygot målinriktade och heterozygously riktade kloner (Figur 4A, B, tabell 3). Under de villkor som presenteras här, finner vi att AAVS1 Talens resulterade i de mest EGFP-positiva kloner. Mallen reparation användes för detta försök består av en splitsningsacceptorställe uppströms EGFP reporter och puromycinresistens kassett. Med användning av detta "gen-fälla" strategi (Figur 1), bör konstruktionen infogas i den första intronen av AAVS1 lokus, med hjälp av endogena promotorn för att driva expression av den puromycin-resistens kassett. Avsaknaden av en promotor som driver expressionen av puromycinresistensgenen i mallen reparation bör förhindra uttryck i händelse av slumpmässig integration.
Därför förväntar vi oss att alla puromycin-resistenta kloner skulle riktas på AAVS1 platsen. Det bör noteras att en undergrupp av klonerna bära avvikande integrationer i AAVS1 lokus som är detekterbara genom Southern blöt med användning en intern prob, men inte av de flesta PCR-strategier (Figur 1; Figur 4C) 4. Dessa händelser integrations troligen resultatet av heterologa inriktnings händelser som ledde till flera integrationer av donatorplasmiden 4. Vi plockade 24 kolonier från varje SSN experiment och fann att alla plattformar hade mycket höga inriktning effektiviteten och visade endast minimala skillnader. Såsom förhörs genom PCR, crispr / Cas9 gav de mest rätta riktade kloner medan talen plattformen hade de mest homozygot riktade kloner (tabell 3).
/files/ftp_upload/53583/53583fig1highres.jpg "width =" 700 "/>
Figur 1. Schematisk av gen redigerat AAVS1 locus använder reparationsmallen AAV-CAGGS-EGFP. Modifierad från Hockemeyer et al., 2009. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Kolonier av WIBR # 3-celler. Representativa ljusa fält bilder av kolonier av WIBR # 3 humana embryonala stamceller före inriktning. Notera avsaknaden av differentiering och tydlig separation från matarskikt i ett idealiskt koloni (vänster) i motsats till en icke-ideal en (till höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. EGFP-positiva WIBR # 3-celler. Representativa bilder av WIBR # 3-celler riktade med en EGFP-uttryckande reparations mall på AAVS1 locus. Bilder från representativa kolonier redigerats med ZFNs, Talens och crispr / Cas9 visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Genotypningstekniker strategier för att bekräfta rätt inriktning. (A) representant PCR genotypning resultat visar oriktade, heterozygota och homozygota riktade kloner över de tre SSN plattformarna. WT CTL = vildtyp kontroll. (B) Representativa Southern blot resultat som visar en heterozygot riktad klon och en homozygot riktad klon detekterades med en 3 "extern sond. Fragmentstorlekar: WT-6,5 kb, edited-6,9 kb. (C) Representativa Southern blot resultat som visar en korrekt redigerade klonen och en heterozygot klon med ett icke slumpmässigt dubbel-integrering. Fragmentstorlekar:. Korrekt redigerade-6,9 kb, avvikande ytterligare integrations 5 kb Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Läsa på | Gene Riktade | Plattform | Reparation malltyp | # Av kloner plockas | Inriktnings effektivitet |
| Sexton et al., 2014 | TPP1 | ZFN | GFP-Puro orapporterat | orapporterat | |
| Sexton et al., 2014 | TERT- | ZFN | Hygromycin | orapporterat | orapporterat |
| Hockemeyer et al., 2009 | POU5F1 | ZFN | GFP-Puro | 31 | 39,0% |
| Hockemeyer et al., 2009 | PITX3 | ZFN | GFP-Puro | 74 | 14,9% |
| Hockemeyer et al., 2011 | POU5F1 | Talen | GFP-Puro | 68 | 91,0% |
| Hockemeyer et al., 2011 | PITX3 | Talen | GFP-Puro | 96 | 13,0% |
| Merkle et al., 2015 | VASA | Cas9 | Reporter-Geneticin | 139 | 94,0% |
| Merkle et al., </ em>, 2015 | CRH | Cas9 | Reporter-Geneticin | 30 | 93,0% |
| Merkle et al., 2015 | HCRT | Cas9 | Reporter-Geneticin | 154 | 92,0% |
| Merkle et al., 2015 | HMX2 | Cas9 | Reporter-Geneticin | 11 | 45,0% |
| Forster et al., 2014 | LRG5-Nterm | ZFN | GFP-Puro | orapporterat | 30,0% |
| Forster et al., 2014 | LRG5-Cterm | ZFN | GFP-Puro | orapporterat | 14,0% |
| Soldner et al., 2011 | Verket | ZFN | Puro | 96 | 1,0% |
Tabell 1. Beskrivning av andra gener målinriktat med hjälp av denna metod, med motsvarande inriktning effektivitetsvinster som tagits från tidigare publicerade studier. 4,5,38-41
| Ställe | Sekvens | Anmärkningar |
| AAVS1-F-primer | CTCTAACGCTGCCGTCTCTC | PCR-betingelser: T m = 57 ° C, 35 cykler |
| AAVS1-WT-R-primer | GCTTCTCCTCTTGGGAAGTG | WT band: 1273 bp |
| AAVS1-Targeted-R primer | CGTCACCGCATGTTAGAAGA | Riktad band: 992 bp |
| T2-Cas9-guide | GGGCCACTAGGGACAGGAT | Från Mali et al., 2013 |
| AAVS1-ZFN-höger | TAGGGACAGGAT | Från Hockemeyer et al., 2009 |
| AAVS1-ZFN-vänster | TGGGGTGTCACC | Från Hockemeyer et al., 2009 |
| AAVS1-talen-höger | TCCTAACCACTGTCTTT | Från Hockemeyer et al., 2011 |
| AAVS1-talen-vänster | CCCCTCCACCCCACAGT | Från Hockemeyer et al., 2011 |
Tabell 2. Förteckning över primers och SSN målsökningssekvenser.
| Targeting Konstrukt | Antal EGFP + Kolonier | Riktade plockade kloner (PCR verifierad) | Föregående Rapporterade Korrekt inriktning Effektivitet (genom Southern blot) |
| ZFN | 150 | 86,9% (73,9% het / 13,0% homo) | 56% (50% het / 6% homo) |
| Talen | 412 | 91,3% (47,8% het / 39,1% homo) | 47% (37,5% het / 9,3% homo) |
| Crispr-Cas9 | 235 | 95,7% (69,5% het / 26,3% homo) | orapporterat |
Tabell 3. Jämförande antal EGFP-positiva och riktade talen, ZFN och crispr / Cas9 mänskliga stamceller kolonier. PCR verifierade integrationer på AAVS1 locus för detta experiment jämförs med Southern blot verifieras korrekt enkel integrationer i tidigare experiment 4,5.
Discussion
Den metod som presenteras här för att isolera homogena populationer av gen-redigerade humana pluripotenta stamceller är en kraftfull metod för att generera isogena hPSC linjer som skiljer sig endast på den riktade locus. Dessa celler är ett idealiskt system för undersökning av de mekanismer av human celldifferentiering och utveckling samt för att förstå patofysiologin för monogena sjukdomar i en kontrollerad genetisk miljö. Som framgår här, är det möjligt att använda tre oberoende SSN designstrategier (ZFNs, Talens, och crispr / Cas9) för att uppnå riktad integration på AAVS1 locus. Var och en av dessa metoder har sina fördelar och nackdelar. En potentiell fördel med ZFNs och, i viss utsträckning, är Talens deras konstruktionsflexibilitet, som medger iterativ teknik i syfte att förbättra den DNA-bindande domänerna hos enskilda nukleaser 42. Denna nukleas optimering kan öka specificiteten av ZFNs och Talens utöver vad som kan uppnås med CRISPR / Cas9-systemet. En sådan selektivitet kan vara viktigt för kliniska tillämpningar som kräver en hög grad av målspecificitet. Den primära fördelen med crispr / Cas9 system är dess användarvänlighet. Även talen och ZFN byggsatser har gjorts tillgängliga för allmänheten (dvs genom Addgene 21), crispr / Cas9-baserade SSNs är betydligt lättare att konstruera, som den enda nödvändiga anpassning är en 20 baspar oligonukleotid (när du använder px330 plasmiden utformning 14). Denna enkelhet visar sig vara fördelaktigt för forskningslaboratorier som vill inkludera genom redigering i sina studier.
Det finns alternativa transfektionstekniker, inklusive nucleofection 43, för att skapa gen-redigerade hPSC linjer; men elektroporering har visat sig vara konsekvent och kostnadseffektivt 4,5,25. Nucleofection kan användas för att direkt transfektera Cas9-guide-RNA ribonukleoprotein komplex in i kärnan, vilket ökar SSN effektiviteten end trohet 44. Växande hPSCs på MEF är en robust och billig metod för att upprätthålla hPSCs i ett pluripotent tillstånd utan alltför differentiering. Dessutom möjliggör det för lätt isolering av genetiskt identiska kolonier. Alternativt är det möjligt att odlings hPSCs utan MEF, men dessa odlingsbetingelser kan vara dyrare än matar baserade kulturer. Dessutom är hela processen skalbara, vilket möjliggör isolering av mycket sällsynta redigeringshändelser eller generering av många olika cellinjer i parallella redigering experiment.
Protokollet som beskrivs här är robust, men det finns flera viktiga steg som påverkar effektiviteten med vilken kan erhållas korrekt redigerade kloner. Den mest kritiska komponenten för denna metod är att ha hög kvalitet MEF och läkemedelsresistenta DR4 MEF. Överlevnaden av enstaka hPSCs är svagt och låg kvalitet MEF kommer att hindra isolering av odifferentierade hPSC linjer. För det andra, är också användningen av Y-27.632nyckel för att möjliggöra enkel cellöverlevnad utan att generera ett selektivt tryck för celler med en onormal karyotyp 45. För det tredje, plocka väl fördelade kolonier garanterar genetisk homogenitet de härledda cellinjer. Slutligen är det viktigt att framställa glaspipetter så att öppningen är tillräckligt liten för att bryta kolonin i många mindre bitar, vilket garanterar att multipla kolonier kommer att växa i den nya brunnen. Detta möjliggör plockning av väl fördelade subkloner för en replik platta att ha i kultur, lämnar ursprungliga tallrik isolerade kolonier för genotypning. En utmanande del i detta protokoll är handboken dra av glaspipetter; detta bör praktiseras i förväg. Det bör noteras att det finns flera metoder för klon plocka som inte kräver en glaspipett. Praktiker uppmuntras att hitta en som fungerar bäst för dem.
Det finns begränsningar för detta protokoll som kan övervinnas genom enkla ändringar. Ett experiment avsett att ondast störa platsen för intresse utan reparation eller vars reparations mallen inte innehåller ett urval kassett, måste använda en annan metod för anrikning för celler som har redigerats. Observera att antalet kolonier som måste plockas att finna en positiv klon ökar avsevärt i avsaknad av selektion. En strategi för att förbättra effektiviteten är att co-transfektera en icke-integrerande plasmid som uttrycker ett fluorescerande protein. Efter att ha låtit cellerna att återhämta sig i två dagar, kan målinriktade celler sorteras på positiv fluorescens med användning av fluorescensaktiverad cellsortering och återutströks 29. Denna process berikar för celler som har transfekterats med plasmiderna genom elektroporering och därigenom ökar sannolikheten för en samtidig redigering händelse i cellen.
De metoder som beskrivs här kan utsträckas att använda flera styr RNA för att samtidigt rikta flera loci 14,46,47. Många protokoll har upprättats för att differentiera hPSCsi distinkta celltyper, vilket gör att olika genetiska manipulationer i celltyper av intresse 30. Sammantaget har vi visat potential för effektiv genomet redigering i hPSCs oavsett SSN val. Vi föreslår att denna teknik kan anpassas för att skapa isogena hPSC linjer som har genen-redigerade vid någon genomisk lokus.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av en Brain Research Foundation Seed Grant (BRFSG-2014-02) till Helen Bateup. Dirk Hockemeyer är en ny Scholar i åldrande Ellison Medical Foundation och stöds av Glenn Foundation samt The Shurl och Kay Curci Foundation. DH stöds också av NIH bidrag 1R01CA196884-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320082 | |
| Fetal Bovine Serum (HI) | Life Technologies | 10082-147 | |
| Knockout Serum | Life Technologies | 10828-028 | |
| Fibroblast Growth Factor - basic | Life Technologies | PHG0261 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Y-27632 | Calbiochem | 688000 | |
| 6-well plates | Corning | 3506 | |
| 12-well plates | Corning | 3512 | |
| 4 mm Electroporation cuvettes | Bio-rad | 165-2081 | |
| X-cel gene pulser II | Bio-rad | 165-2661 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| 10× Phosphate buffered saline (PBS) pH7.4 | Life Technologies | 70011-044 | |
| Puromycin | Life Technologies | A11138-02 | |
| Pasteur pipettes, plugged | VWR | 14672-412 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | S5941 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Proteinase-K | Life Technologies | AM2544 | |
| Ethanol | VWR | TX89125-172SFU | |
| Isopropyl Alcohol | VWR | MK303216 | |
| TE Buffer | Life Technologies | 12090-015 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 1.8 ml Cryotubes | ThermoScientific | 377267 |
References
- Carroll, D. Genome engineering with targetable nucleases. Annu Rev Biochem. 83, 409-439 (2014).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery. Sci Transl Med. 6 (239), 239ps6 (2014).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol. 27 (9), 851-857 (2009).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29 (8), 731-734 (2011).
- Bozas, A., Beumer, K. J., Trautman, J. K., Carroll, D. Genetic analysis of zinc-finger nuclease-induced gene targeting in drosophila. Genetics. 182 (3), 641-651 (2009).
- Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
- DeKelver, R. C., et al. Functional genomics, proteomics, and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome. Genome Res. 20 (8), 1133-1142 (2010).
- Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435 (7042), 646-651 (2005).
- Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jinek, M., East, A., Cheng, A., Lin, S., Ma, E., Doudna, J. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, e00471 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. the new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Jasin, M. Genetic manipulation of genomes with rare-cutting endonucleases. Trends Genet. 12 (6), 224-228 (1996).
- Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).
- Sander, J. D., Maeder, M. L., Reyon, D., Voytas, D. F., Joung, J. K., Dobbs, D. ZiFiT (zinc finger targeter): An updated zinc finger engineering tool. Nucleic Acids Res. 38, W462-W468 (2010).
- Carroll, D., Morton, J. J., Beumer, K. J., Segal, D. J. Design, construction and in vitro testing of zinc finger nucleases. Nat Protoc. 1 (3), 1329-1341 (2006).
- Chen, F., et al. High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases. Nat Methods. 8 (9), 753-755 (2011).
- Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (12), e82 (2011).
- Reyon, D., Tsai, S. Q., Khayter, C., Foden, J. A., Sander, J. D., Joung, J. K. FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing. Nat Biotechnol. 30 (5), 460-465 (2012).
- Sanjana, N. E., Cong, L., Zhou, Y., Cunniff, M. M., Feng, G., Zhang, F. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nat Protoc. 7 (1), 171-192 (2012).
- Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from neisseria meningitidis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (39), 15644-15649 (2013).
- Podhajska, A. J., Szybalski, W. Conversion of the FokI endonuclease to a universal restriction enzyme: Cleavage of phage M13mp7 DNA at predetermined sites. Gene. 40 (2-3), 175-182 (1985).
- Costa, M., et al. A method for genetic modification of human embryonic stem cells using electroporation. Nat Protoc. 2 (4), 792-796 (2007).
- Chambers, S. M., Fasano, C. A., Papapetrou, E. P., Tomishima, M., Sadelain, M., Studer, L. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
- Cai, J., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).
- Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 108 (3), 407-414 (2001).
- Soldner, F., et al. Parkinson's disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors. Cell. 136 (5), 964-977 (2009).
- Wen, Z., et al. Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders. Nature. 515 (7527), 414-418 (2014).
- Chiba, K., Hockemeyer, D. Genome editing in human pluripotent stem cells using site-specific nucleases. Methods Mol Biol. 1239, 267-280 (2015).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
- Ezashi, T., Das, P., Roberts, R. M. Low O2 tensions and the prevention of differentiation of hES cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (13), 4783-4788 (2005).
- Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes. Nucleic Acids Res. 25 (18), 3745-3746 (1997).
- Southern, E. Southern blotting. Nat Protoc. 1 (2), 518-525 (2006).
- Henegariu, O., Heerema, N. A., Dlouhy, S. R., Vance, G. H., Vogt, P. H. Multiplex PCR: Critical parameters and step-by-step protocol. BioTechniques. 23 (3), 504-511 (1997).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Sexton, A. N., et al. Genetic and molecular identification of three human TPP1 functions in telomerase action: Recruitment, activation, and homeostasis set point regulation. Genes Dev. 28 (17), 1885-1899 (2014).
- Merkle, F. T., et al. Efficient CRISPR-Cas9-mediated generation of knockin human pluripotent stem cells lacking undesired mutations at the targeted locus. Cell Rep. 11 (6), 875-883 (2015).
- Soldner, F., et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset parkinson point mutations. Cell. 146 (2), 318-331 (2011).
- Forster, R., et al. Human intestinal tissue with adult stem cell properties derived from pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2 (6), 838-852 (2014).
- Miller, J. C., et al. Improved specificity of TALE-based genome editing using an expanded RVD repertoire. Nat Methods. , (2015).
- Hohenstein, K. A., Pyle, A. D., Chern, J. Y., Lock, L. F., Donovan, P. J. Nucleofection mediates high-efficiency stable gene knockdown and transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 26 (6), 1436-1443 (2008).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system. Sci Rep. 4, 5400 (2014).
- Ousterout, D. G., Kabadi, A. M., Thakore, P. I., Majoros, W. H., Reddy, T. E., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 6, 6244 (2015).
