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Developmental Biology

जीनोम संपादित मानव स्टेम सेल लाइनों की स्थापना: अलगाव को लक्षित से

Published: February 2, 2016 doi: 10.3791/53583
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley

Abstract

मानव स्टेम कोशिकाओं (hPSCs) के जीनोम संपादन मानव विकास को समझते हैं और बीमारी के pathophysiology की जांच के लिए एक आनुवंशिक रूप से नियंत्रित और चिकित्सकीय प्रासंगिक मंच प्रदान करता है। जीनोम संपादन के लिए साइट विशेष न्युक्लिअसिज़ (SSNs) का काम करके, एक अन्यथा isogenic सेटिंग में विशिष्ट आनुवंशिक परिवर्तन को शरण देने के लिए नए hPSC लाइनों के तेजी से व्युत्पत्ति संभव हो जाता है। जिंक उंगली न्युक्लिअसिज़ (ZFNs), प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह प्रेरक न्युक्लिअसिज़ (TALENS) और क्लस्टर नियमित रूप से interspaced कम मुरजबंध संबंधी दोहराता (CRISPR) / Cas9 सबसे अधिक इस्तेमाल किया SSNs हैं। इन न्युक्लिअसिज़ के सभी जिससे एक जीनोमिक ठिकाना पर सटीक जीन संपादन को बढ़ावा देने, एक निर्दिष्ट स्थल पर एक डबल असहाय डीएनए को तोड़ने को शुरू करने से कार्य करते हैं। एसएसएन-तप जीनोम संपादन प्रविष्टि / विलोपन म्यूटेशन या Alt लागू करने के लिए या तो सेल की अंतर्जात डीएनए की मरम्मत तंत्र, गैर मुताबिक़ अंत (NHEJ) में शामिल होने और अनुरूपता निर्देशित मरम्मत के दो (एचडीआर), कारनामेडबल असहाय तोड़ने के स्थल पर एक मुताबिक़ मरम्मत टेम्पलेट का उपयोग कर जीनोम इंजी। HPSCs के electroporation जैसे फ्लोरोसेंट पत्रकारों और एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट के रूप में ट्रांसजीन शामिल है कि SSNs और मरम्मत टेम्पलेट्स transfecting का एक कारगर साधन है। इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद, यह एंटीबायोटिक प्रतिरोध के लिए चयन करके मरम्मत का निर्माण शामिल है कि केवल उन hPSCs अलग करना संभव है। यंत्रवत् hPSC कालोनियों को अलग करने और जीनोटाइपिंग के माध्यम से लक्ष्य साइट पर उचित एकीकरण की पुष्टि के लिए सही ढंग से निशाना बनाया और आनुवंशिक रूप से सजातीय सेल लाइनों के अलगाव के लिए अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल की वैधता EGFP और एक puromycin प्रतिरोध मानव स्टेम कोशिकाओं में AAVS1 सुरक्षित बंदरगाह लोकस में निर्माण शामिल करने के लिए सभी तीन एसएसएन प्लेटफार्मों का उपयोग करके यहाँ प्रदर्शन किया है।

Introduction

जीनोम संपादन प्रौद्योगिकियों तेजी से आणविक और कोशिका जीव विज्ञान 1 के लिए मानक उपकरण में विकसित हो रहे हैं। HPSCs आनुवंशिक रूप से बरकरार प्राथमिक मानव कोशिकाओं की एक स्वयं renewing स्रोत का प्रतिनिधित्व के रूप में मानव स्टेम कोशिकाओं (hPSCs) की जेनेटिक इंजीनियरिंग विशेष रुचि का है। hPSCs रोग मॉडलिंग के लिए या प्रत्यारोपण उपचारों 2,3 के लिए एक स्रोत के रूप में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में भेदभाव किया जा सकता है। AAVS1 ठिकाना पर एक संवाददाता का निर्माण के लक्षित एकीकरण के लिए अंतर्जात डीएनए की मरम्मत तंत्र के साथ संयोजन के रूप में साइट विशेष न्युक्लिअसिज़ (SSNs) के तीन विभिन्न प्रकार इस्तेमाल करता है कि एक प्रोटोकॉल यहाँ है का प्रदर्शन किया। HPSCs में SSNs की अभिकर्मक के बाद, हम रिपोर्टर को शरण देने isogenic सेल आबादी को अलग करने के लिए कैसे प्रदर्शित करता है।

विशेष रूप से pluripotent सेल जीनोम स्टेम, जीनोम हेरफेर करने की क्षमता का उपयोग, SSNs जस्ता उंगली न्युक्लिअसिज़ (ZFNs) और प्रतिलेखन activat की उपयोगिता के रूप में एक नई घटना नहीं हैजीन संपादन के लिए या की तरह प्रेरक न्युक्लिअसिज़ (TALENS) कई साल पहले 4-10 प्रदर्शन किया गया। हालांकि, एस pyogenes CRISPR के आगमन / Cas9 प्रौद्योगिकी 11-13 से, जीन संपादन 14 व्यापक रूप से सुलभ हो गया है। सभी SSNs गैर मुताबिक़ अंत में शामिल होने (NHEJ) या अनुरूपता निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) 15 या तो उपयोग कर अंतर्जात सेलुलर तंत्र द्वारा मरम्मत की है कि निर्दिष्ट लक्ष्य साइट 1,4,5,11 में एक डबल असहाय डीएनए तोड़ (डीएसबी) परिचय। NHEJ त्रुटि प्रवण है और उपन्यास तत्वों एसएसएन के साथ एक मरम्मत टेम्पलेट के सह अभिकर्मक के माध्यम से पेश किए जाने के लिए एचडीआर की अनुमति देता है, जबकि जीन समारोह के नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप फ्रेम पारी म्यूटेशन लागू कर सकते हैं। जीन संपादन की सुविधा है कि डीएनए की मरम्मत के सिद्धांतों प्रत्येक एसएसएन के लिए काफी हद तक ही माना जाता है, वहीं प्लेटफार्मों के बीच कुछ मतभेद का उल्लेख किया जा सकता है। डी ZFNs की नोवो डिजाइन लचीलापन और nuclease अनुकूलन 16, सार्वजनिक रूप से हालांकि उपयोग की अनुमति देता हैव्यक्तिगत ZFNs डिजाइन करने के लिए उपलब्ध विधानसभा पुस्तकालयों और स्क्रीनिंग उपकरण समय लगता हो सकता है। ZFN की मध्यस्थता लक्ष्य-निर्धारण के लिए वांछित ठिकाना चुना गया है, एक बार ZFN जोड़े ऑनलाइन उपकरण ZiFit 17 के साथ बनाया जा सकता है। डिजाइन के बाद, ZFNs modularly प्लाज्मिड क्लोनिंग 18 के कई दौर के माध्यम से इकट्ठा किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, पूर्व मान्य ZFNs 19 देखते हैं। कहानी न्युक्लिअसिज़ भी ऑनलाइन उपकरण और सार्वजनिक रूप से उपलब्ध घटकों 17,20 का उपयोग कर बनाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, TALENS तेजी से फ्लैश विधानसभा 21 या पीसीआर आधारित श्रेणीबद्ध गोल्डन गेट विधानसभा में 22 का उपयोग कर के माध्यम से, पांच कहानी दोहराता के ब्लॉक से इकट्ठा किया जा सकता है। एसएसएन डिजाइन और CRISPR / Cas9 का उपयोग करते हुए निर्माण की गति की आसानी के लिए एक व्यापक रूप से सुलभ उपकरण संपादन जीनोम बना दिया है। गाइड RNAs के बहुसंकेतन एक भी निर्माण 14 के साथ कई स्थलों को निशाना बनाने की लिए CRISPR के छोटे से मार्गदर्शन आरएनए की मध्यस्थता लक्ष्य-निर्धारण / Cas9 भी अनुमति देता है। परिरूपलक्ष्य ठिकाना को समीपस्थ; जीन संपादन के लिए Cas9 की एक protospacer आसन्न मूल भाव (एस के लिए एक NGG trinucleotide Cas9 pyrogenes पीएएम) की ही पहचान की आवश्यकता है। Px330 प्लाज्मिड 14 में पाम के 20 आधार जोड़े 5 'के लिए इसी oligonucleotide डालने से, निर्माण एक क्लोनिंग कदम में इकट्ठा किया जा सकता है। एस के अलावा pyogenes Cas9, एन से Cas9 एक 5'-NNNNGATT-3 '(पीएएम) को पहचानता है कि meningitidis (NmCas9) hPSCs 23 में कुशल जीन-संपादन के लिए अनुमति देने के लिए दिखाया गया है।

एसएसएन डिजाइन के आराम में अंतर करने के लिए इसके अलावा, प्रत्येक मंच विशिष्ट गुण है। उदाहरण के लिए, ZFNs और TALENS Cas9 ज्यादातर उत्पन्न एंडेड DSBs कुंद करने के लिए सोचा है, जबकि एक चार न्यूक्लियोटाइड 5 'की अधिकता 24 उत्पन्न करता है जो FokI nuclease डोमेन, का उपयोग। ZFNs, TALENS, और Cas9, पर बंद दर लक्ष्य डीएनए पर, उनके प्रोटीन stabilities में मतभेद है, और डीएनए स्कैनिंग की विधा है, जो सभी ग कीसैद्धांतिक रूप से संपादन परिणाम 1 में छोटे मतभेदों में परिणाम ould। आगे की पढ़ाई पूरी तरह से इन मतभेदों के परिणामों को समझने के लिए आवश्यक हो जाएगा, वहीं हम यहाँ सभी तीन प्लेटफार्मों भर में बेहद मजबूत है और आसानी से आनुवंशिक रूप से संशोधित hPSCs उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक प्रोटोकॉल का वर्णन है।

भले ही एसएसएन पसंद का, इलेक्ट्रोपोरेशन hPSCs 25 में SSNs और अनुरूपता मरम्मत टेम्पलेट्स transfect करने के लिए एक मजबूत प्रक्रिया है। एंटीबायोटिक प्रतिरोध के लिए चयन के बाद कालोनियों जीवित रहने की संख्या ठिकाना विशिष्ट मानकों और संपादन रणनीति (ट्रांसजेनिक डालने और चयन के मोड के जैसे, आकार) पर निर्भर करता है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल बारे में आमतौर पर 150-400 एकल कोशिका ली गई कालोनियों में यह परिणाम है।

जीन-संपादन इस प्रोटोकॉल का उपयोग AAVS1 ठिकाना पर पहले से SSNs 4,5 के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। एएवी-CAGGS-EGFP मरम्मत टेम्पलेट एक जीन जाल एसटीआर का उपयोग करता हैategy एक ठिकाना विशिष्ट ढंग से puromycin प्रतिरोध प्रदान करने के लिए। संक्षेप में, मरम्मत टेम्पलेट promoterless puromycin प्रतिरोध कैसेट के अपस्ट्रीम एक ब्याह स्वीकर्ता साइट में शामिल है। AAVS1 ठिकाना पर PPP1R12C जीन की पहली Intron में सही एकीकरण पर, प्रतिरोध कैसेट संपादित जीन के प्रमोटर से व्यक्त किया जाता है। इस विशिष्ट AAVS1 परख की मजबूती हमें प्रत्येक एसएसएन मंच की क्षमता की तुलना करने के लिए अनुमति देता है।

SSNs का उपयोग जीन संपादन बाधित और / या सैद्धांतिक रूप से किसी भी जीन में परिवर्तन करने की क्षमता को देखते हुए शक्तिशाली है। HPSCs के लिए इस रणनीति को लागू करने hPSCs बाद में इस तरह के न्यूरॉन्स 26 के रूप में मानव कोशिका प्रकार की एक भीड़ में भेदभाव किया जा सकता है, बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करता है 27 Hepatocytes, और 28 cardiomyocytes। इसके अतिरिक्त, रोगी व्युत्पन्न प्रेरित स्टेम कोशिकाओं के उपयोग के एक रोगी विशेष आनुवंशिक पृष्ठभूमि 29 में मरम्मत या ज्ञात रोग के कारण म्यूटेशन की शुरूआत की अनुमति देता है 30 का उपयोग परीक्षण चिकित्सा जांच के लिए एक मंच प्रदान करते हैं। सारांश में, hPSCs में जीन संपादन मानव विकास और बीमारी 31 के मूल जीव विज्ञान की जांच के लिए एक कुशल और बहुमुखी दृष्टिकोण है।

Protocol

इस पांडुलिपि में वर्णित प्रक्रियाओं की समीक्षा की और यूसी बर्कले स्टेम सेल अनुसंधान निगरानी समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. संपादन के लिए स्टेम कोशिकाओं को तैयार

  1. आगे बढ़ें और mitomycin सी निष्क्रिय माउस भ्रूण fibroblast के 2.4 × 10 6 कोशिकाओं / प्लेट युक्त 6 अच्छी तरह से थाली पर संस्कृति मानव स्टेम कोशिकाओं (hPSCs) (MEF) फीडरों जिलेटिन 32 पर हो। अच्छी तरह से (hESC मीडिया) के अनुसार मानव भ्रूण स्टेम सेल मीडिया के 3 मिलीलीटर में hPSCs बनाए रखें और एक 37 में हो जाना 3% 2 हे / 5% सीओ 2 के साथ डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर।
    नोट: इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए, यह एक कम ऑक्सीजन इनक्यूबेटर में hPSCs बनाए रखने के लिए आवश्यक नहीं है; हालांकि यह समय और सेल नंबर के हिसाब से समायोजित किया जाना चाहिए, ताकि hPSCs, एक उच्च ओ 2 के माहौल में तेजी से पैदा करना है कि नोट के लिए महत्वपूर्ण है। यह भी कम ऑक्सीजन में बनाए रखा hPSCs सहज भेदभाव 33 की कम दर है कि ध्यान दिया जाना चाहिए।
    1. टीओ 500 मिलीलीटर hESC मीडिया 380 मिलीलीटर DMEM / F12, 75 मिलीलीटर भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) का गठबंधन बनाने, 25 मिलीलीटर पीटा सीरम रिप्लेसमेंट (एस आर)। Glutamine (1 मिमी अंतिम एकाग्रता), 5 मिलीलीटर 100x गैर आवश्यक अमीनो एसिड, 100 इकाइयों / एमएल पेनिसिलीन स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस), बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF) (4 एनजी / एमएल अंतिम एकाग्रता), और 2- जोड़ें mercaptoethanol (5.5 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता)।
  2. मीडिया (3 एमएल) की पूरी मात्रा को हटाने के लिए एक गिलास पिपेट और निर्वात का उपयोग करके मीडिया बदलें। 3 मिलीलीटर गर्म hESC मीडिया एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग के साथ बदलें। HPSCs लगभग 50% मिला हुआ दिवस (-1) कर रहे हैं जब तक दोहराएँ मीडिया हर दिन बदल जाते हैं।
  3. एक दिन (दिन -1) को निशाना बनाने से पहले, पुराने मीडिया को दूर करने और 10 माइक्रोन वाई 27,632 के साथ पूरक गर्म hESC मीडिया जोड़ने, hESC मीडिया बदल जाते हैं।
  4. इसके अलावा दिन -1 पर, DR4 चूहों (2.4 × 10 6 कोशिकाओं / प्लेट) 34 से दवा प्रतिरोधी MEF फीडर कोशिकाओं के दो 6 अच्छी तरह से या 10 सेमी प्लेटों के लिए एक तैयार करते हैं।
    नोट: सामान्य में, 6 अच्छी तरह प्लेटें विज्ञापन कर रहे हैंvantageous 10 से अधिक सेमी प्लेटों, वे और अधिक मीडिया को समायोजित के रूप में। 6 अच्छी तरह प्लेटें भी अलग कुओं से अलग है कि क्लोन स्वतंत्र हैं सुनिश्चित करें। हालांकि, एक 10 सेमी की थाली इस प्रक्रिया के लिए उपलब्ध माइक्रोस्कोप पर निर्भर करता है, आसान उठा सकेंगे।

2. संपादन स्टेम सेल

  1. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में CRISPR / Cas9 px330 एन्कोडिंग प्लाज्मिड (चित्रा 1) के ZFN 1 और 2, TALEN 1 और 2, या 15 ग्राम के 5 ग्राम प्रत्येक pipetting द्वारा अभिकर्मक समाधान तैयार करें। पिपेट 30 के रूप में अच्छी तरह से इस ट्यूब में मरम्मत प्लाज्मिड के माइक्रोग्राम। अंत में, ट्यूब में पिपेट 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) 300 μl करने के लिए खंड को लाने के लिए।
    नोट: 300 μl के तहत अभिकर्मक समाधान की कुल मात्रा रखने के लिए 300 एनजी / μl की एक न्यूनतम एकाग्रता के साथ (किसी भी किट उपयुक्त है) एक midiprep रूप प्लास्मिडों तैयार करें। यह प्लाज्मिड linearize करने के लिए, या एक endoto का उपयोग करने के लिए, फिनोल / क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक नहीं हैजिन मुक्त प्लाज्मिड तैयारी किट।
  2. एक गिलास पिपेट और निर्वात का उपयोग कर hPSCs से मीडिया निकालें। प्रत्येक कुएं में पिपेट 2 मिलीलीटर गर्म 1x पीबीएस कोशिकाओं को धोने के लिए।
  3. तुरंत एक गिलास पिपेट और निर्वात का उपयोग कर पीबीएस निकालें। प्रत्येक कुएं में कोशिकाओं पर सीधे 0.5 मिलीलीटर 0.25% trypsin EDTA के समाधान जोड़ें। लगभग 10 मिनट के लिए इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2/3% ओ 2) में रखें। या फीडर परत प्लेट लिफ्ट बंद करने के लिए शुरू होता है जब तक।
  4. Trypsin प्रतिक्रिया को रोकने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 2 मिलीलीटर गर्म esWash मीडिया (470 मिलीलीटर DMEM / F12, 25 मिलीलीटर एफबीएस, 100 इकाइयों / एमएल पी / एस) जोड़ें।
  5. एक पत्रक के रूप में उतर आया है कि फीडर कोशिकाओं सुनिश्चित करें। सभी कुओं के संयोजन, अच्छी तरह से एक एकल 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में प्रत्येक की सामग्री पिपेट। एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग Triturate कोशिकाओं। यह फीडर परत को तोड़ने के लिए आवश्यक नहीं है; hPSCs कोमल विचूर्णन द्वारा फीडर परत के बंद आ जाएगा। सेल निलंबन के बारे में 15 मिलीलीटर होना चाहिए।
  6. Volu लाने के लिए ट्यूब के लिए esWash मीडिया के 25 मिलीलीटर जोड़ेंमुझे ऊपर से 40 मिलीलीटर कुल। बड़े फीडर मात्रा 1-2 मिनट के लिए ट्यूब के नीचे बसने की अनुमति दें। एक नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट और जमा का उपयोग कर ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला (~ 38 मिलीलीटर) निकालें।
  7. 190 x जी पर 5 मिनट के लिए स्पिन। एक गिलास पिपेट और निर्वात का उपयोग कर ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला निकालें। सेल गोली परेशान नहीं करना सुनिश्चित करें। पीबीएस 1x 500 μl में कोशिकाओं Resuspend। पहले तैयार प्लाज्मिड अभिकर्मक समाधान के साथ जुडा है। इस कदम पर कोशिकाओं की गणना। इलेक्ट्रोपोरेशन प्रति 5-10 मिलियन कोशिकाओं का प्रयोग करें।
  8. एक 4 मिमी electroporation क्युवेट में पूरे 800 μl निलंबन विंदुक 3-5 मिनट के लिए बर्फ पर जगह है। 250 वी, 500 μF, ∞ प्रतिरोध, और 4 मिमी क्युवेट का आकार: इलेक्ट्रोपोरेशन निम्नलिखित मानकों के साथ सिस्टम पर घातीय प्रोग्राम का उपयोग Electroporate कोशिकाओं। Electroporation के बाद, 3 मिनट के लिए बर्फ पर वापस क्युवेट जगह है।
    नोट: इलेक्ट्रोपोरेशन सिस्टम पर electroporation की लगातार समय को ध्यान से देखें। समय लगातारसेल नंबर और डीएनए पवित्रता के साथ बदलता रहता है। सूचीबद्ध की स्थिति और एक जीन pulser द्वितीय का उपयोग करते समय सफल transfections आमतौर पर 10-14 मिसे के बीच लगातार एक समय है। समय स्थायी इन मूल्यों से भिन्न होता है जब कम इलेक्ट्रोपोरेशन क्षमता हो सकता है।
  9. गर्म hESC मीडिया 10 माइक्रोन वाई 27,632 के साथ पूरक 18 मिलीलीटर में electroporated कोशिकाओं Resuspend। प्लेट 3 DR4 फीडर कोशिकाओं के साथ एक 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में इस एकल कक्ष निलंबन की मिलीलीटर। इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2/3% ओ 2) पर लौटें।

सकारात्मक कालोनियों की 3. चयन

  1. 2 दिन, एक गिलास पिपेट और निर्वात का उपयोग कर सभी मीडिया को हटा दें। 10 माइक्रोन वाई 27,632 के साथ पूरक गर्म hESC मीडिया के 3 मिलीलीटर के साथ बदलें। 3 दिन, एक गिलास पिपेट और निर्वात का उपयोग कर सभी मीडिया को हटा दें। वाई 27,632 को शामिल किए बिना गर्म hESC मीडिया के 3 मिलीलीटर के साथ बदलें। 4 दिन, एक गिलास पिपेट और निर्वात का उपयोग कर सभी मीडिया को हटा दें। 3 मिलीलीटर के साथ selecti के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक गर्म hESC मीडिया को बदलेंपर। इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2/3% ओ 2) पर लौटें।
    नोट: प्रतिरोध कैसेट पर निर्भर करेगा इस्तेमाल एंटीबायोटिक के प्रकार के मरम्मत टेम्पलेट में शामिल थे। WIBR # 3 hPSCs (एनआईएच रजिस्ट्री 0079), 0.5 ग्राम / मिलीलीटर puromycin, 70 माइक्रोग्राम / एमएल G418 (Geneticin), और 35 माइक्रोग्राम / एमएल hygromycin के साथ काम करना सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है। चयन के लिए सांद्रता लगभग एक सप्ताह के भीतर जंगली प्रकार की कोशिकाओं को मारने के लिए की जरूरत एंटीबायोटिक का न्यूनतम एकाग्रता स्थापित करके अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए।
  2. दिनों 5-12, एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक गर्म hESC मीडिया के साथ पुराने मीडिया हर बार की जगह, दैनिक मीडिया बदल जाते हैं।
    नोट: सेल मौत की एक बड़ी राशि की उम्मीद है। व्यक्तिगत कालोनियों दिन 8-10 चारों ओर से स्पष्ट हो जाएगा। एंटीबायोटिक दवाओं के बिना नियमित hESC मीडिया निरंतर चयन के 12-14 दिनों के बाद इस्तेमाल किया जा सकता है। सेल घनत्व अधिक है या कोशिका मृत्यु धीमी है, मीडिया का अम्लीकरण से बचा जाना चाहिए और यह मीडिया volu बढ़ाने के लिए आवश्यक हो सकता हैचयन के पहले कुछ दिनों के दौरान मुझे (ऊपर 4-5 मिलीलीटर)।

4. उठा चयनित कालोनियों दिवस (12-14)

  1. दिन 12-14 पर कालोनियों का निरीक्षण करें। एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप पर लेने के लिए और वे अंतर करने के लिए शुरू कर रहे हैं कि कोशिकाओं को शामिल नहीं करते, यह सुनिश्चित करने के लिए तैयार कर रहे हैं कि कालोनियों का निरीक्षण करें। अनुमानित आकार 800-1,200 माइक्रोन होना चाहिए। कालोनियों 12 दिन पहले इस आकार तक पहुँचने, तो यह है कि वे तब उठाया जाना चाहिए कि सिफारिश की है।
    नोट: प्रत्येक को निशाना प्रयोग के लिए, वांछित जीनोटाइप अलग है सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक के रूप में के रूप में कई कालोनियों लेने। एक उदाहरण के रूप में, एएवी-CAGGS-EGFP मरम्मत टेम्पलेट के साथ AAVS1 संपादन लगातार मजबूत एकीकरण दिखाया गया है, और केवल 12-24 कालोनियों लगभग 5-10 heterozygously लक्षित क्लोन प्राप्त करने के लिए उठाया जा करने की आवश्यकता है। अधिक कालोनियों आवश्यकता हो सकती है अन्य को निशाना प्रयोगों (तालिका 1) उठाया जाएगा। सही लक्ष्य-निर्धारण की घटनाओं की आवृत्ति ऐसे एसएस की दक्षता जैसे कारकों पर निर्भर करता हैएन एक डीएसबी, डालने के आकार, और चयन की रणनीति लागू करने के लिए। सही ढंग से एक ठीक से निशाना बनाया क्लोन प्राप्त करने के लिए आवश्यक कालोनियों की संख्या को कम करने, लक्ष्य साइट पर एकीकृत जब यहाँ प्रस्तुत AAVS1 ठिकाना लिए जीन जाल दृष्टिकोण के मामले में चयन मार्कर ही व्यक्त की है।
  2. (प्रत्येक कॉलोनी उठाया के लिए / प्लेट 2.4 × 10 6 कोशिकाओं, एक अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जाएगा) एक दिन पहले उठा, MEFs की 12 अच्छी तरह प्लेटें तैयार करते हैं।
  3. उठा के दिन, एक गिलास पिपेट और निर्वात का उपयोग कर 12 अच्छी तरह से MEF प्लेटों से सभी मीडिया को हटाने और 1 मिलीलीटर hESC मीडिया के साथ बदलें। इसके अलावा उठा के दिन पर, उठाया जा करने जा रहे हैं कि 6 अच्छी तरह प्लेटों पर hESC मीडिया बदल जाते हैं।
  4. फीडर परत से अलग-अलग कालोनियों के यांत्रिक हदबंदी के लिए कांच pipettes खींचो। एक में हुड लेम्प बर्नर पर pipettes कम और कांच निंदनीय है जब तक विस्तार बिंदु पर नरम। जल्दी आंच पर से उतार और पिपेट अलावा एक कोणीय बिंदु बनाने खींच। तोड़ दोएक संकीर्ण चैनल छोड़ रहा है, तुला अक्ष से लगभग 2 सेमी इशारा करते हैं। 1-2 सेकंड के लिए लौ को उजागर करके चैनल के अंत पॉलिश।
    नोट: वैकल्पिक हालांकि, इस संस्कृति के क्लोनालिटी कम कर सकते हैं, कालोनियों एक P20 pipet टिप लेने, सुस्त टिप संभावित बाद के उच्छिष्ट दूषित, मीडिया में प्रत्येक कॉलोनी से कोशिकाओं का अधिक से अधिक मात्रा में जगह देना पड़ सकता है।
  5. एक P1000 फिल्टर विंदुक टिप ले रही है और संकीर्ण अंत के लिए एक सक्शन बल्ब संलग्न द्वारा डिवाइस उठा इकट्ठे। व्यापक अंत में खींच लिया गिलास पिपेट डालें।
  6. HPSCs के 6 अच्छी तरह से थाली एक टिशू कल्चर हुड में रखा एक विच्छेदन खुर्दबीन के मंच पर उठाया जाएगा रखें। उठा डिवाइस का बल्ब संक्षिप्त और धीरे मीडिया में टुकड़े जारी नहीं करने के ख्याल रख रही है, उत्पाद शुल्क और 10-20 समान रूप से आकार के टुकड़ों में एक व्यक्ति कॉलोनी काट दिया। बल्ब को रिहा द्वारा पिपेट में कॉलोनी के excised hPSC टुकड़े ले लो। स्थानांतरित करते हुए जितना संभव हो कम मीडिया लेने की कोशिश करें।
  7. Transfएर एक 12 अच्छी तरह से MEF प्लेट की एक भी खैर, अब टूट कॉलोनी रिहा, सीधे कुएं में फिर से बल्ब compressing करने के लिए अलग-अलग कॉलोनी। एकल कोशिका ली गई क्लोन की अनूठी पहचान की अनुमति के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से लेबल। कांच पिपेट हर बार बदलने के रूप में आवश्यक के रूप में कई कालोनियों के लिए दोहराएँ।
    नोट: उठा कालोनियों जानने के लिए कुछ समय लग सकता है। यह लक्षित कालोनियों को अलग-थलग करने की कोशिश करने से पहले कुछ नियंत्रण कक्षों पर प्रयोगकर्ता अभ्यास की सिफारिश की है।
  8. धीरे अच्छी तरह से प्रत्येक के बीच में कोशिकाओं के संचय से बचने के लिए पहले थाली कमाल, इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस / 3% 2 हे / 5% सीओ 2) के लिए 12 अच्छी तरह प्लेटें लौटें।
  9. अगले दिन और प्रत्येक बाद दिन, एक गिलास पिपेट और निर्वात का उपयोग कर मीडिया की पूरी मात्रा को दूर करने और कोशिकाओं के बारे में 50% मिला हुआ है, जब तक गर्म hESC मीडिया के 1.5 मिलीलीटर के साथ की जगह (यह आमतौर पर 10-12 दिन लगते हैं)।
  10. 10-12 दिनों के बाद, अच्छी तरह से प्रत्येक से दो कालोनियों के लिए एक लेने और फिर से नए 12 अच्छी तरह से MEF प्लेटों के लिए स्थानांतरणpeating एक प्रतिकृति प्लेट उत्पन्न करने के लिए 4.1-4.8 कदम।
  11. मूल MEF प्लेटों के प्रत्येक कुएं में शेष कालोनियों से डीएनए (देखें नीचे) को निकालें।
    1. एक गिलास पिपेट और निर्वात का उपयोग कर सभी कुओं से मीडिया निकालें। अच्छी तरह से कोशिकाओं को धोने के लिए प्रत्येक पर पीबीएस 1x पिपेट 1 मिलीलीटर। कांच पिपेट और निर्वात का उपयोग कर पीबीएस निकालें। पिपेट सेल बफर के 250 μl (एच 2 ओ में अंतिम सांद्रता: 10 मिमी Tris एचसीएल, 5 मिमी EDTA, 0.2% एसडीएस, 200 मिमी NaCl, 0.08 मिलीग्राम / एमएल Proteinase-कश्मीर) प्रत्येक कुएं पर। इनक्यूबेटर में प्लेस (37 डिग्री सेल्सियस / 3% 2 हे / 5% सीओ 2) हे / एन।
    2. अगले दिन, पिपेट प्रत्येक की सामग्री अच्छी तरह से व्यक्तिगत 1.5 मिलीलीटर ट्यूब। पिपेट प्रत्येक ट्यूब में isopropyl शराब के 250 μl डीएनए वेग। सख्ती ट्यूब हिला। एक सफेद वेग दिखाई जानी चाहिए।
    3. एक तालिका के शीर्ष अपकेंद्रित्र में 13,000 rpm पर 3 मिनट के लिए प्रत्येक ट्यूब स्पिन। स्पिन के नीचे के बाद, तरल अपशिष्ट में decanting से सतह पर तैरनेवाला त्यागें। एक छोटा सा डीएनए गोली की तह तक अटका रहना चाहिएनली। डीएनए गोली धोने के लिए प्रत्येक ट्यूब में 70% इथेनॉल के 250 μl पिपेट। जोश से हिलाएं। एक तालिका के शीर्ष अपकेंद्रित्र में 13,000 rpm पर 3 मिनट के लिए प्रत्येक ट्यूब स्पिन।
    4. नीचे कताई के बाद, तरल अपशिष्ट में decanting से सतह पर तैरनेवाला त्यागें। एक छोटा सा डीएनए गोली ट्यूब के नीचे अटक रहना चाहिए। ट्यूब में छोड़ कोई तरल है तो वहाँ सतह पर तैरनेवाला के शेष के बाहर पिपेट। 5-10 मिनट के लिए benchtop पर सुखाने के लिए खुला ट्यूब को छोड़ दें। सूखने के बाद, 250 μl ते बफर में डीएनए resuspend। डीएनए भंग करने की अनुमति देने के लिए 6 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  12. एक पीसीआर अनुकूलित-पूर्व या दक्षिणी धब्बा रणनीति का उपयोग कर प्रत्येक नमूना जीनोटाइप।
    नोट:।। AAVS1 एएवी-CAGGS-EGFP मरम्मत टेम्पलेट का उपयोग कर लक्षित करने के लिए, दक्षिणी धब्बा रणनीति एट अल, 2009 4 एक व्यापक दक्षिणी सोख्ता प्रोटोकॉल, दक्षिणी में पाया जा सकता है Hockemeyer में पाया जा सकता है 2006 35 के मल्टीप्लेक्स पीसीआर जीनोटाइपिंग के लिए। एक ही प्रयोग, प्राइमरों और शर्तों किया जा सकता हैतालिका 2 36 में पाया।
  13. ठीक ढंग से लक्षित नहीं कर रहे हैं कि कुओं त्यागें और हर दिन ठीक से लक्षित कोशिकाओं पर hESC मीडिया को बदलने के लिए जारी है। वे लगभग 50% मिला हुआ है, जब कोशिकाओं नीचे रुक प्रोटोकॉल ठंड के लिए नीचे देखें।
    1. एक दिन ठंड से पहले, पुराने मीडिया को दूर करने और 10 माइक्रोन वाई 27,632 के साथ पूरक गर्म hESC मीडिया जोड़ने, hESC मीडिया बदल जाते हैं।
    2. ठंड के दिन दो 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में नीचे जमे हुए किया जा रहा है कि एक 12 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह समाधान एक और समाधान बी के 0.5 मिलीलीटर प्रत्येक तैयार करते हैं। बर्फ पर रखें समाधान। समाधान एक: 50% hESC मीडिया और 50% FBS; समाधान बी: ​​80% FBS और 20% डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO)।
    3. ठंड से पहले एकल कक्षों में hPSC कालोनियों अलग कर देना। तदनुसार मात्रा में स्केलिंग, यह करने के लिए कदम 2.2-2.8 का पालन करें। समाधान ए के 0.5 मिलीलीटर में पूरी तरह से resuspend सेल गोली
    4. सेल निलंबन, पिपेट अप करने के लिए 0.5 मिलीलीटर समाधान बी जोड़ें और नीचे सेल निलंबन समरूप बनाने के लिए। Takई 2 मिलीलीटर cryotube में सेल निलंबन (~ 1 एमएल) और जमा की कुल मात्रा। कसकर पर टोपी भाड़ में।
    5. एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर हे / एन में रखें cryotube। ठंड के बाद दिन, -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से जमे हुए कोशिकाओं को हटाने और तुरंत लंबी अवधि के भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन टैंक में जगह है।

Representative Results

यहाँ हम अनुवांशिक इंजीनियर hPSC लाइनें बनाने के लिए तीन अलग-अलग एसएसएन प्लेटफार्म के साथ संगत एक प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है। हम एक EGFP संवाददाता और एक puromycin प्रतिरोध कैसेट 4 का परिचय है कि एक की मरम्मत टेम्पलेट का उपयोग कर पहले प्रकाशित ZFNs 4, TALENS 5 और CRISPR / Cas9s 37 का उपयोग कर AAVS1 ठिकाना पर WIBR # 3 मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं को निशाना बनाया।

हम अविभाजित hPSCs के रखरखाव और विस्तार की अनुमति देने के लिए एक सेल संस्कृति कार्यप्रवाह (चित्रा 2) के लिए MEFs पर हमारे hPSCs सुसंस्कृत, यह भी कहा कि प्रभावी और स्केलेबल लागत है। कोशिकाओं आवश्यक से अधिक समय बड़े हो रहे हैं, तो ट्रांसफ़ेक्ट हैं कि pluripotent कोशिकाओं की संख्या और फलस्वरूप प्राप्त सही ढंग से लक्षित hPSC कालोनियों की संख्या को कम करने, बढ़ भेदभाव का एक खतरा नहीं है।

हम electropएसएसएन मंच प्रति 5.0 x 10 6 कोशिकाओं orated और DR4 MEFs की एक भी 6 अच्छी तरह से थाली पर प्रत्येक को निशाना बनाने से कोशिकाओं को चढ़ाया। चयन के बाद, हर मंच EGFP पॉजिटिव कालोनियों (चित्रा 3) और अलक्षित homozygously लक्षित और heterozygously लक्षित क्लोन (; 3 टेबल चित्रा -4 ए, बी) का एक संयोजन में हुई। यहाँ प्रस्तुत शर्तों के तहत, हम AAVS1 TALENS सबसे EGFP पॉजिटिव क्लोन में हुई हैं। इस प्रयोग के लिए इस्तेमाल की मरम्मत टेम्पलेट EGFP संवाददाता और puromycin प्रतिरोध कैसेट के अपस्ट्रीम एक ब्याह स्वीकर्ता साइट के होते हैं। इस 'जीन-जाल "रणनीति (चित्रा 1) का उपयोग करना, निर्माण puromycin प्रतिरोध कैसेट की अभिव्यक्ति ड्राइव अंतर्जात प्रमोटर का उपयोग कर, AAVS1 ठिकाना का पहला Intron में सम्मिलित करना चाहिए। में अभिव्यक्ति को रोकने चाहिए मरम्मत टेम्पलेट के भीतर puromycin प्रतिरोध जीन की अभिव्यक्ति ड्राइविंग एक प्रमोटर की कमी यादृच्छिक एकीकरण की घटना।

इसलिए, हम सभी puromycin प्रतिरोधी क्लोन AAVS1 स्थल पर लक्षित किया जाएगा कि उम्मीद है। यह नहीं, बल्कि सबसे पीसीआर रणनीतियों (चित्रा 1, चित्रा 4C) द्वारा, क्लोन के एक सबसेट एक आंतरिक जांच का उपयोग दक्षिणी धब्बा द्वारा detectable हैं कि AAVS1 ठिकाना में न्यायपालिका एकीकरण ले कि ध्यान दिया जाना चाहिए 4। ये एकीकरण की घटनाओं की संभावना सबसे अधिक दाता प्लाज्मिड 4 के एकाधिक एकीकरण के लिए अग्रणी heterologous को निशाना बनाने की घटनाओं के परिणाम हैं। हम प्रत्येक एसएसएन प्रयोग से 24 कालोनियों उठाया और सभी प्लेटफार्मों बहुत उच्च लक्ष्य-निर्धारण क्षमता थी और केवल न्यूनतम अंतर दिखाया है कि पाया। पीसीआर ने पूछताछ के रूप में TALEN मंच सबसे homozygously लक्षित क्लोन (3 टेबल) था, जबकि CRISPR / Cas9 सबसे सही ढंग से लक्षित क्लोन झुकेंगे।

/files/ftp_upload/53583/53583fig1highres.jpg "चौड़ाई =" 700 "/>
जीन की चित्रा 1. योजनाबद्ध एएवी-CAGGS-EGFP मरम्मत टेम्पलेट। से Hockemeyer एट अल। संशोधित का उपयोग कर AAVS1 ठिकाना संपादित, 2009 में यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
WIBR # 3 कोशिकाओं की चित्रा 2. कालोनियों। 3 मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से पहले लक्षित करने के लिए WIBR # की कालोनियों के प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवियों। भेदभाव की कमी और एक गैर आदर्श एक (दाएं) के लिए विरोध के रूप में एक आदर्श कॉलोनी (बाएं) में फीडर परत से स्पष्ट विभाजन पर ध्यान दें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. EGFP पॉजिटिव WIBR # 3 कोशिकाओं। WIBR # AAVS1 ठिकाना पर एक EGFP व्यक्त की मरम्मत टेम्पलेट के साथ लक्षित 3 कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियाँ। ZFNs के साथ संपादित प्रतिनिधि कालोनियों की छवियाँ, TALENS और CRISPR / Cas9 दिखाए जाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. जीनोटाइपिंग रणनीतियों सही लक्ष्य-निर्धारण पुष्टि करने के लिए। (ए) तीन एसएसएन प्लेटफार्मों भर में, अलक्षित विषमयुग्मजी और समयुग्मक लक्षित क्लोन दिखा प्रतिनिधि पीसीआर जीनोटाइपिंग का परिणाम है। गुम्मट सीटीएल जंगली प्रकार नियंत्रण =। (बी) के प्रतिनिधिएक विषमयुग्मजी लक्षित क्लोन और एक 3 'बाहरी जांच के साथ पता चला एक समयुग्मक लक्षित क्लोन दिखा सरीखे दक्षिणी धब्बा का परिणाम है। टुकड़ा आकार: WT-6.5 KB, एडिट-6.9 केबी। (सी) एक ठीक से संपादित क्लोन और एक गैर यादृच्छिक डबल एकीकरण के साथ एक विषमयुग्मजी क्लोन दिखा प्रतिनिधि दक्षिणी धब्बा का परिणाम है। टुकड़ा आकार:। ठीक से संपादित-6.9 KB, न्यायपालिका अतिरिक्त एकीकरण-5 KB यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अध्ययन जीन लक्षित मंच मरम्मत टेम्पलेट प्रकार क्लोन के # उठाया लक्ष्य-निर्धारण दक्षता
सेक्सटन एट अल।, 2014 TPP1 ZFN GFP-प्यूरो unreported unreported
सेक्सटन एट अल।, 2014 TERT ZFN Hygromycin unreported unreported
Hockemeyer एट अल।, 2009 POU5F1 ZFN GFP-प्यूरो 31 39.0%
Hockemeyer एट अल।, 2009 PITX3 ZFN GFP-प्यूरो 74 14.9%
Hockemeyer एट अल।, 2011 POU5F1 TALEN GFP-प्यूरो 68 91.0%
Hockemeyer एट अल।, 2011 PITX3 TALEN GFP-प्यूरो 96 13.0%
मर्कल एट अल।, 2015 वासा Cas9 रिपोर्टर-Geneticin 139 94.0%
मर्कल एट अल। </ Em> 2015 सीआरएच Cas9 रिपोर्टर-Geneticin 30 93.0%
मर्कल एट अल।, 2015 HCRT Cas9 रिपोर्टर-Geneticin 154 92.0%
मर्कल एट अल।, 2015 HMX2 Cas9 रिपोर्टर-Geneticin 11 45.0%
फोर्स्टर एट अल।, 2014 LRG5-Nterm ZFN GFP-प्यूरो unreported 30.0%
फोर्स्टर एट अल।, 2014 LRG5-Cterm ZFN GFP-प्यूरो unreported 14.0%
Soldner एट अल।, 2011 SNCA ZFN प्यूरो 96 1.0%

टेबल अन्य जीन की 1. विवरण Corre के साथ, इस विधि का उपयोग कर निशाना बनायाsponding पहले से प्रकाशित अध्ययन से लिया क्षमता को लक्षित। 4,5,38-41

ठिकाना अनुक्रम नोट्स
AAVS1-एफ प्राइमर CTCTAACGCTGCCGTCTCTC पीसीआर की स्थिति: टी मीटर = 57 डिग्री सेल्सियस, 35 चक्र
AAVS1-गुम्मट आर प्राइमर GCTTCTCCTCTTGGGAAGTG गुम्मट बैंड: 1273 बीपी
AAVS1-लक्षित आर प्राइमर CGTCACCGCATGTTAGAAGA लक्षित बैंड: 992 बीपी
टी 2-Cas9-गाइड GGGCCACTAGGGACAGGAT माली से एट अल।, 2013
AAVS1-ZFN-राइट TAGGGACAGGAT Hockemeyer से एट अल।, 2009
AAVS1-ZFN-वाम TGGGGTGTCACC Hockemeyer से एट अल।, 2009
AAVS1-TALEN-राइट TCCTAACCACTGTCTTT Hockemeyer से एट अल।, 2011
AAVS1-TALEN-वाम CCCCTCCACCCCACAGT Hockemeyer से एट अल।, 2011

प्राइमर और एसएसएन को निशाना दृश्यों की तालिका 2 सूची।

निर्माण के लक्ष्य निर्धारण EGFP + कालोनियों की संख्या लक्षित उठाया क्लोन (पीसीआर सत्यापित) (दक्षिणी धब्बा द्वारा) पिछला दी सही लक्ष्य निर्धारण क्षमता
ZFN 150 86.9% (73.9% बेचैन / 13.0% होमोसेक्सुअल) 56% (50% बेचैन / 6% होमोसेक्सुअल)
TALEN 412 91.3% (47.8% बेचैन / 39.1% होमोसेक्सुअल) 47% (37.5% बेचैन / 9.3% होमोसेक्सुअल)
CRISPR-Cas9 235 95.7% (69.5% बेचैन / 26.3% होमोसेक्सुअल) unreported

तालिका 3. तुलनात्मक EGFP पॉजिटिव की संख्या और TALEN, ZFN लक्षित और CRISPR / Cas9 मानव स्टेम सेल कालोनियों। पीसीआर पिछले प्रयोगों 4,5 में उचित एकल एकीकरण सत्यापित दक्षिणी धब्बा की तुलना कर रहे इस प्रयोग के लिए AAVS1 ठिकाना पर एकीकरण सत्यापित।

Discussion

जीन-सम्पादित मानव स्टेम कोशिकाओं के समरूप आबादी को अलग-थलग करने के लिए यहाँ प्रस्तुत विधि लक्षित ठिकाना पर ही मतभेद है कि isogenic hPSC लाइनों पैदा करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। इन कोशिकाओं को मानव सेलुलर भेदभाव और विकास के तंत्र की जांच के लिए और साथ ही एक नियंत्रित आनुवंशिक सेटिंग में monogenic रोगों के pathophysiology को समझने के लिए एक आदर्श व्यवस्था कर रहे हैं। यहां प्रदर्शन के रूप में, यह AAVS1 ठिकाना पर लक्षित एकीकरण को प्राप्त करने के लिए तीन स्वतंत्र एसएसएन डिजाइन रणनीतियों (ZFNs, TALENS, और CRISPR / Cas9) का उपयोग करने के लिए संभव है। इन तरीकों में से प्रत्येक के अपने फायदे और नुकसान है। एक संभावित ZFNs का लाभ और, कुछ हद तक, TALENS व्यक्ति न्युक्लिअसिज़ 42 के डोमेन बाध्यकारी डीएनए में सुधार के क्रम में चलने का इंजीनियरिंग की अनुमति देता है जो उनके डिजाइन लचीलापन है। इस nuclease अनुकूलन सीआरआई के साथ प्राप्त है क्या परे ZFNs और TALENS की विशिष्टता को बढ़ा सकता हैएसपीआर / Cas9 प्रणाली। इस तरह के चयनात्मकता लक्ष्य विशिष्टता के एक उच्च स्तर की आवश्यकता नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है। CRISPR / Cas9 प्रणाली के प्राथमिक लाभ प्रयोग के अपने आसानी है। TALEN और ZFN निर्माण किट (Addgene 21 के माध्यम से, यानी) जनता के लिए उपलब्ध कराया गया है हालांकि केवल आवश्यक अनुकूलन एक 20 आधार जोड़ी oligonucleotide है के रूप में px330 प्लाज्मिड का उपयोग करते समय, CRISPR / Cas9 आधारित SSNs (, के निर्माण के लिए काफी आसान कर रहे हैं डिजाइन 14)। इस सादगी को उनकी पढ़ाई में जीनोम संपादन में शामिल करने के लिए देख अनुसंधान प्रयोगशालाओं के लिए फायदेमंद साबित होता है।

जीन-सम्पादित hPSC लाइनें बनाने के लिए nucleofection के 43, सहित वैकल्पिक अभिकर्मक तकनीक, कर रहे हैं; हालांकि इलेक्ट्रोपोरेशन सुसंगत और लागत प्रभावी 4,5,25 होना दिखाया गया है। Nucleofection एसएसएन दक्षता एक बढ़ती हुई, सीधे नाभिक में Cas9-गाइड आरएनए ribonucleoprotein परिसरों transfect करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताडी निष्ठा 44। MEFs पर hPSCs बढ़ रहा अत्यधिक भेदभाव के बिना एक pluripotent राज्य में hPSCs बनाए रखने के लिए एक मजबूत और सस्ता तरीका है। इसके अलावा, यह आनुवंशिक रूप से समान कालोनियों के आसान अलगाव के लिए अनुमति देता है। वैकल्पिक रूप से, यह हालांकि इन संस्कृति की स्थिति फीडर आधारित संस्कृतियों की तुलना में अधिक महंगा हो सकता है, MEFs बिना संस्कृति hPSCs के लिए संभव है। इसके अलावा, पूरी प्रक्रिया बहुत ही दुर्लभ संपादन घटनाओं के अलगाव या समानांतर संपादन प्रयोगों में कई अलग सेल लाइनों की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है, स्केलेबल है।

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल मजबूत है; हालांकि सही ढंग से संपादित क्लोन प्राप्त किया जा सकता है, जिसके साथ दक्षता को प्रभावित करने वाले कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। इस विधि के लिए सबसे महत्वपूर्ण घटक उच्च गुणवत्ता MEFs और दवा प्रतिरोधी DR4 MEFs हो रही है। एकल hPSCs के अस्तित्व कमजोर है, और कम गुणवत्ता MEFs अविभाजित hPSC लाइनों के अलगाव को रोकना होगा। दूसरा, वाई 27,632 का उपयोग भी हैएक असामान्य कुपोषण 45 के साथ कोशिकाओं के लिए एक चयनात्मक दबाव पैदा करने के बिना एक सेल अस्तित्व की अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है। तीसरा, अच्छी तरह से स्थान कालोनियों उठा ली गई कोशिका लाइनों के आनुवंशिक एकरूपता सुनिश्चित करता है। अंत में, यह उद्घाटन कई छोटे टुकड़ों में कॉलोनी को तोड़ने के लिए काफी छोटा है तो यह है कि कई कालोनियों नए तरह में विकसित होगा सुनिश्चित करना है कि कांच pipettes तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक प्रतिकृति प्लेट जीनोटाइपिंग के लिए पृथक कालोनियों के मूल प्लेट छोड़ रहा है, संस्कृति में है करने के लिए यह अच्छी तरह से स्थान subclones की उठा परमिट। इस प्रोटोकॉल में एक चुनौतीपूर्ण हिस्सा कांच pipettes की खींच मैनुअल है; यह पहले अभ्यास किया जाना चाहिए। यह एक गिलास पिपेट की आवश्यकता नहीं है कि क्लोन उठा के कई तकनीकों हैं कि ध्यान दिया जाना चाहिए। प्रयोगकर्ता उनके लिए सबसे अच्छा काम करता है कि एक खोजने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है।

सरल संशोधनों के द्वारा दूर किया जा सकता है कि इस प्रोटोकॉल के लिए सीमाएं हैं। ओ करने के उद्देश्य से एक प्रयोगnly जिनकी मरम्मत टेम्पलेट एक चयन कैसेट शामिल नहीं है, संपादित किया गया है कि कोशिकाओं के लिए समृद्ध बनाने का एक और तरीका का उपयोग करना चाहिए की मरम्मत या एक के बिना ब्याज का ठिकाना बाधित। एक सकारात्मक क्लोन लगाने के लिए उठाया जाना चाहिए कि कालोनियों की संख्या चयन के अभाव में काफी बढ़ जाती है कि ध्यान दें। दक्षता में सुधार करने के लिए एक रणनीति के एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करता है कि एक गैर समेकित करने प्लाज्मिड सह transfect करने के लिए है। कोशिकाओं दो दिनों के लिए ठीक करने के लिए अनुमति के बाद, लक्षित कोशिकाओं प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई का उपयोग कर सकारात्मक प्रतिदीप्ति पर हल और 29 replated जा सकता है। यह प्रक्रिया electroporation द्वारा plasmids के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया है कि कोशिकाओं के लिए समृद्ध करती है और इस तरह की सेल में एक समवर्ती संपादन घटना की संभावना बढ़ जाती है।

यहाँ वर्णित तकनीक एक साथ कई लोकी 14,46,47 को लक्षित करने के लिए कई गाइड आरएनए का उपयोग करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। कई प्रोटोकॉल hPSCs अंतर करने के लिए स्थापित किया गया हैविशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं में, ब्याज 30 की प्रकार की कोशिकाओं में विभिन्न आनुवंशिक जोड़तोड़ की इजाजत दी। कुल मिलाकर, हम भले ही एसएसएन पसंद का hPSCs में कुशल जीनोम संपादन के लिए क्षमता का प्रदर्शन किया है। हम इस तकनीक किसी भी जीनोमिक ठिकाना पर जीन संपादित किया गया है कि isogenic hPSC लाइनें बनाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि प्रस्ताव।

Disclosures

लेखकों ने प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की अनुपस्थिति की घोषणा की।

Acknowledgments

इस काम हेलेन Bateup के लिए एक ब्रेन रिसर्च फाउंडेशन बीज अनुदान (BRFSG-2014-02) द्वारा समर्थित किया गया। डिर्क Hockemeyer एलिसन मेडिकल फाउंडेशन की उम्र बढ़ने में एक नया विद्वान है और ग्लेन नींव के साथ ही Shurl और Kay CURCI फाउंडेशन द्वारा समर्थित है। डीएच भी एनआईएच अनुदान 1R01CA196884-01 द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 Life Technologies 11320082
Fetal Bovine Serum (HI) Life Technologies 10082-147
Knockout Serum Life Technologies 10828-028
Fibroblast Growth Factor - basic Life Technologies PHG0261
Pen/Strep Life Technologies 15140-122
Glutamine Life Technologies 25030-081
MEM NEAA Life Technologies 11140-050
2-mercaptoethanol Life Technologies 21985-023
Y-27632 Calbiochem 688000
6-well plates Corning 3506
12-well plates Corning 3512
4 mm Electroporation cuvettes Bio-rad 165-2081
X-cel gene pulser II Bio-rad 165-2661
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200-056
10× Phosphate buffered saline (PBS) pH7.4  Life Technologies 70011-044
Puromycin Life Technologies A11138-02
Pasteur pipettes, plugged VWR 14672-412
Tris-HCl Sigma-Aldrich S5941
NaCl Sigma-Aldrich S9888
SDS Sigma-Aldrich L3771
EDTA Sigma-Aldrich E5134
Proteinase-K Life Technologies AM2544
Ethanol VWR TX89125-172SFU
Isopropyl Alcohol VWR MK303216
TE Buffer Life Technologies 12090-015
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
1.8 ml Cryotubes ThermoScientific 377267

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Blair, J. D., Bateup, H. S., Hockemeyer, D. F. Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation. J. Vis. Exp. (108), e53583, doi:10.3791/53583 (2016).

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