A simple and general method for the synthesis of cyclic peptides using microwave irradiation is outlined. This procedure enables the synthesis of backbone cyclic peptides with a collection of different conformations while retaining the side chains and the pharmacophoric moieties., and therefore, allows to screen for the bioactive conformation.
Eiwit-eiwit interacties (PPI) zijn nauw betrokken bij bijna alle biologische processen en zijn verbonden met vele menselijke ziekten. Daarom is er een grote inspanning om protonpompremmers in fundamenteel onderzoek en in de farmaceutische industrie richten. Eiwit-eiwit interfaces zijn meestal groot, plat, en vaak niet zakken, complicerende de ontdekking van kleine moleculen die dergelijke sites richten. Alternatieve targeting benaderingen met behulp van antilichamen hebben beperkingen als gevolg van slechte orale biologische beschikbaarheid, lage cel-permeabiliteit, en de productie inefficiëntie.
Met behulp van peptiden aan PPI interfaces doel heeft verschillende voordelen. Peptiden hebben hogere conformationele flexibiliteit, verhoogde selectiviteit en die in het algemeen goedkoop. Echter, peptiden hun eigen beperkingen waaronder slechte stabiliteit en inefficiëntie oversteken celmembranen. Om zulke beperkingen te overwinnen, kan peptide cyclisatie worden uitgevoerd. Cyclisatie werd aangetoond dat peptide selectiviteit te verbeteren, Metabolische stabiliteit en biobeschikbaarheid. Echter, het voorspellen van de biologisch actieve conformatie van een cyclisch peptide is niet triviaal. Om deze uitdaging te overwinnen, een aantrekkelijke benadering is om een gerichte bibliotheek scherm waarin alle backbone cyclische peptiden hebben dezelfde primaire sequentie, maar verschillen in parameters die hun conformatie beïnvloeden, zoals de ring grootte en positie te screenen.
We beschrijven een gedetailleerd protocol voor de synthese van een bibliotheek van backbone cyclische peptiden gericht op specifieke parasiet PPI. Met behulp van een rationeel ontwerp aanpak, ontwikkelden we peptiden afgeleid van het schavot eiwit L eishmania receptor voor geactiveerde C-kinase (gebrek). Onze hypothese was dat sequenties in LACK die geconserveerd in parasieten, maar niet in de zoogdiergastheer homoloog kan interactieplaatsen voor eiwitten die essentieel zijn voor de levensvatbaarheid van de parasieten zijn vertegenwoordigen. De cyclische peptiden werden gesynthetiseerd onder microgolfbestraling op reactietijden verminderen enefficiency. Het ontwikkelen van een bibliotheek van backbone cyclische peptiden met verschillende ringmaten vergemakkelijkt een systematische scherm voor de meest biologisch actieve conformatie. Deze werkwijze geeft een algemene, snelle en gemakkelijke manier om cyclische peptiden te synthetiseren.
Eiwit-eiwit interacties (PPI's) spelen een centrale rol in de meeste biologische processen, van intracellulaire signaaltransductie celdood 1. Daarom richten PPI is van fundamenteel belang voor fundamenteel onderzoek en therapeutische toepassingen. PPI kan worden geregeld door specifieke en stabiele antilichamen, maar antilichamen zijn duur en moeilijk te vervaardigen en hebben een slechte biobeschikbaarheid. Als alternatief kan PPI's worden gericht op kleine moleculen. Kleine moleculen zijn gemakkelijker te synthetiseren en goedkoop in vergelijking met antilichamen; Maar ze relatief minder flexibel en beter passen aan kleine holtes dan groot eiwit-eiwit interfaces 2,3. Diverse studies hebben aangetoond dat peptiden, die eenvoudiger en goedkoper dan antilichamen en flexibeler dan kleine moleculen, eiwitten interfaces kunnen binden en reguleren PPI 4,5. De wereldwijde therapeutisch peptide markt werd gewaardeerd zo'n vijftien miljard dollar in 2013 en groeit 10,5% annually 6. Verder zijn er meer dan 50 gebracht peptiden, ongeveer 270 peptiden in verschillende stadia van klinische proeven, en ongeveer 400 peptiden in gevorderde preklinische stadia 7. Hoewel talrijke peptiden worden gebruikt als geneesmiddelen, peptiden nog stel verschillende problemen die hun wijdverbreide toepassing zoals een slechte biologische beschikbaarheid en stabiliteit, ondoelmatigheid kruising celmembranen en conformationele flexibiliteit 8,9 beperken. Een alternatief voor deze nadelen overwinnen is om verschillende modificaties toepassen zoals lokale (D-aminozuur en N-alkylering) en globale (ringvorming) beperkingen 8,10-12. Deze wijzigingen komen ook van nature. Bijvoorbeeld, cyclosporine A, een immunosuppressivum cyclisch natuurlijke peptide, bevat één D-aminozuur en ondergaat N-alkylering modificaties 13,14.
Modificatie van natuurlijke aminozuren aan lokale beperkingen, zoals de D- en N-alkylering veroorzaken, vaak van invloed op het peptide9; s biologische activiteit. Echter, cyclisatie, waarbij de sequentie van interesse kan hetzelfde blijven, is het waarschijnlijker dat de biologische activiteit behouden. Cyclisatie is een zeer aantrekkelijke manier om peptide conformationele ruimte te beperken door het verminderen van het evenwicht tussen de verschillende conformaties. Het verhoogt gewoonlijk biologische activiteit en selectiviteit door het op de peptide om de actieve conformatie dat slechts één functie medieert. Cyclisatie peptide verbetert ook de stabiliteit door het houden van het peptide in een conformatie die minder wordt herkend door enzymen. Inderdaad werden cyclische peptiden getoond metabolische stabiliteit, biologische beschikbaarheid en selectiviteit te zijn verbeterd in vergelijking met hun lineaire tegenhangers 15-17.
Echter, cyclisatie een tweesnijdend zwaard omdat in sommige gevallen de beperking mogelijk dat de peptiden van het bereiken van een bioactieve conformatie. Om deze hindernis te overwinnen, een gerichte bibliotheek waarin alle peptiden hebben dezelfde primaire sequencere en daardoor constant farmacoforen kunnen worden gesynthetiseerd. Peptiden in de bibliotheek verschillen parameters die de structuur beïnvloeden, zoals ring grootte en positie, om vervolgens screenen op de biologisch actieve conformatie 9,18.
Peptiden kunnen worden gesynthetiseerd zowel in oplossing en een vaste-fase peptidesynthese (SPPS) benadering, die thans de meest voorkomende peptidesynthese benadering en zullen verder worden besproken. SPPS is een proces waarbij chemische transformaties worden uitgevoerd op een vaste drager via een linker aan een groot aantal synthetische verbindingen 19 te bereiden. SPPS maakt het samenstellen peptiden door achtereenvolgende koppeling van aminozuren stapsgewijs vanaf de C-terminus, die aan een vaste drager is gehecht aan de N-terminus. De N-α-aminozuur zijketens worden gemaskeerd met beschermende groepen die stabiel zijn bij de reactieomstandigheden tijdens peptide verlenging aan de toevoeging van één aminozuur per st waarborgenep. In de laatste stap wordt het peptide vrijgemaakt uit de hars en de zijketen beschermende groepen worden tegelijkertijd verwijderd. Terwijl het peptide wordt gesynthetiseerd, kunnen alle oplosbare reagentia uit de peptide-vaste dragermatrix door filtratie verwijderd en weggespoeld aan het einde van elke koppelingsstap. Met een dergelijk systeem kan een grote overmaat reagentia in hoge concentratie koppelingsreacties rijden voltooid en alle stappen van de synthese kan in hetzelfde vat worden uitgevoerd zonder overdracht van materiaal 20.
Ofschoon SPPS heeft een aantal beperkingen zoals de productie van onvolledige reacties, nevenreacties, onzuivere reagentia, alsook problemen de reactie 21, zijn de voordelen van SPPS is de "gouden standaard" voor peptidesynthese gemaakt. Deze voordelen omvatten de mogelijkheid om niet-natuurlijke aminozuren, automatisering, gemakkelijke zuivering omvatten de minimale fysieke verliezen, en het gebruik van overmaat reagentia, waardoorhoge opbrengsten. SPPS is gebleken uiterst nuttig bij de synthese van moeilijke sequenties 21,22, fluorescent wijzigingen 23 en peptidebibliotheken 24,25 zijn. SPPS is ook zeer nuttig zijn voor andere poly-keten samenstellen zoals oligonucleotiden 26,27, 28,29 oligosacchariden en peptidenucleïnezuren 30,31. Interessant is dat in sommige gevallen, werd SPPS getoond voordelig voor het synthetiseren van kleine moleculen die traditioneel in oplossing 32,33 te zijn. SPPS wordt zowel in kleine schaal voor onderzoek en onderwijs 34,35 evenals grote schaal in de industrie 36-38.
Twee synthesestrategiën die hoofdzakelijk worden gebruikt in SPPS methodologie voor de synthese van peptiden butyloxycarbonyl (Boc) en 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc). De originele strategie ingevoerd voor SPPS is Boc, die sterk zure omstandigheden vereist zij keten van r te verwijderen beschermende groepen en splitsen van de peptideEsin. Fmoc gebaseerde peptidesynthese echter gebruik gematigde basisomstandigheden en een milder alternatief voor de zuur-labiele Boc protocol 39. De Fmoc strategie maakt gebruik van orthogonale t-butyl (tBu) zijketen bescherming die wordt verwijderd in de laatste stap van de synthese, terwijl het splitsen van het peptide van de hars onder zure omstandigheden.
Het algemene principe van peptidesynthese op vaste drager wordt in figuur 1. De eerste aminozuur, gemaskeerd door een tijdelijke beschermende groep op het N-α-terminus wordt op de hars van de C-terminus geladen. Een semi-permanente beschermende groep aan de zijketen maskeren wordt eveneens gebruikt indien nodig (Figuur 1, stap 1). De synthese van de doelwit peptide is samengesteld uit de C-terminus aan de N-terminus van herhaalde cycli van ontscherming van de N-α-tijdelijke beschermende groep (Figuur 1, stap 2) en koppelen van het volgende beschermde aminozuur (Figuur 1 </str ong>, stap 3). Na het laatste aminozuur wordt geladen (Figuur 1, stap 4), wordt het peptide gesplitst van de hars drager en de semi-permanente beschermende groepen worden verwijderd (Figuur 1, stap 5).
Figuur 1. Algemene schema van vaste fase peptidesynthese. Het is N-α-beschermde aminozuur verankerd via de carboxylgroep via een linker aan de hars (stap 1). Het gewenste peptide wordt vervaardigd lineair vanaf de C-terminus aan de N-terminus van herhaalde cycli van ontscherming van de tijdelijke beschermgroep (TPG) van de N-α (stap 2) en aminozuur- koppeling (stap 3). Na voltooiing van de synthese (stap 4) worden de semi-permanente beschermende groepen (SPG) gedeprotecteerd in splitsingsplaats (stap 5).krijgen = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Na montage van de volledige peptideketen, kan cyclisering worden bereikt door verscheidene alternatieven: (A) head-to-tail cyclisatie – Dit is een handige manier maar beperkt omdat het voorziet slechts één optie voor ringsluiting (figuur 2A), (B) cyclisatie met de aminozuren van de sequentie van belang die bioactieve functionele groepen bevatten – Het gebruik van deze aminozuren kunnen de biologische activiteit (Figuur 2B), en (C) ringsluiting te beïnvloeden door het toevoegen van aminozuren (of andere bouwblokken) zonder verstoring het biologisch actieve sequentie. Introductie van deze moleculen wijdverspreid omdat hiermee de productie van gerichte bibliotheken zonder dat de van belang zijnde sequentie (figuur 2C).
Figure 2. Alternatieve peptide cyclisatie strategieën (A) kop aan staart cyclisatie, via een peptide binding tussen de C-terminus en de N-terminus.; (B) cyclisatie tussen functionele groepen zoals een disulfidebinding tussen cysteïneresiduen (1), of een amidebinding tussen de zijketens van lysine / glutaminezuur (2) of zijketen aan N- of C-terminus (3 Aspartic -4); (C) cyclisatie door het toevoegen van extra aminozuren of aminozuur derivaten of kleine moleculen, bijvoorbeeld voor (R0) en na (R7) de bioactieve reeks. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
-Microgolf-geassisteerde synthese maakt gebruik van microgolfstraling om reacties te verwarmen, waardoor het versnellen van organische chemische omzettingen 40,41. Magnetron chemie is gebaseerd op het vermogen van het reagens / oplosmiddel aan het absorberenmicrogolf energie omzetten in warmte 42. Voor de techniek algemeen werd, had grote bezwaren worden overwonnen, zoals de controleerbaarheid en de reproduceerbaarheid van syntheseprotocollen en gebrek aan beschikbare systemen voldoende temperatuur en druk controles 43,44. De eerste melding van microgolven peptide synthese werd uitgevoerd met een keuken microgolf verscheidene korte peptiden te synthetiseren (7-10 aminozuren) met een significante verbetering van de koppelingsefficiëntie en zuiverheid 45. Bovendien werd microgolfenergie aangetoond keten aggregatie verlagen kant reacties te verminderen, racemisatie te beperken, en het verbeteren van de koppeling tarieven, die alle kritische voor moeilijke en lange sequenties 46-53 zijn.
Momenteel is het gebruik van microgolfbestraling voor de synthese van peptiden of verwante verbindingen op een vaste drager is uitgebreid, waaronder (A) synthese in water in plaats van organische oplosmiddelen 54; (B) de synthese van peptiden metgemeenschappelijke post-translationele modificaties, zoals glycopeptiden 55-58 of 59-61 fosfopeptiden, waarvan de synthese is meestal moeilijk vanwege de lage koppelingsrendement van sterisch gehinderde aminozuur derivaten; (C) synthese van peptiden met wijzigingen in de backbone, zoals azapeptides, dat kan worden gevormd door de vervanging van de C (α) van een aminozuurrest met een stikstofatoom 62 of peptoïden, waarvan de zijketen is verbonden met de amide stikstof in plaats van de Ca-atoom 63,64; (D) synthese van cyclische peptiden 65-71; en (E) synthese van combinatorische bibliotheken 51,72. In veel gevallen, de auteurs rapporteerden hogere efficiëntie en verminderde synthese keer met microgolfbestraling in vergelijking met de conventionele protocol.
Met behulp van een rationeel ontwerp 73-75, ontwikkelden we anti-parasitaire peptiden die zijn afgeleid van receptor het schavot L eishmania's for geactiveerde C-kinase (gebrek). GEBREK speelt een belangrijke rol in de vroege fase van Leishmania-infectie 76. Parasieten uitdrukken lagere niveaus van GEBREK niet om zelfs immuun-gecompromitteerde muizen parasiteren 77 een gebrek is betrokken bij essentiële parasiet signalering processen en eiwitsynthese 78. Daarom GEBREK is een belangrijke scaffold eiwit 79 en een waardevolle drug target. Gericht op sequenties in LACK die geconserveerd in de parasieten, maar niet in het ontvangende zoogdier homoloog RACK identificeerden we een 8 aminozuurpeptide (RNGQCQRK) die Leishmania sp. Levensvatbaarheid daalde in kweek.
We beschrijven hier een protocol voor de synthese van hoofdketen cyclische peptiden afgeleid van de eiwitsequentie LACK hierboven beschreven. De peptiden werden gesynthetiseerd op een vaste drager via microgolf verhitting door SPPS methodologie Fmoc / tBu protocol. Peptiden werden geconjugeerd aan een TAT 47-57 (YGRKKRRQRRR) dragerpeptide via een amidebinding alseen deel van de SPPS. TAT-gebaseerde transport van diverse ladingen in cellen is gebruikt voor meer dan 15 jaar en de levering van de lading in subcellulaire organellen is bevestigd 80. Vier verschillende linkers, barnsteenzuuranhydride en glutaarzuuranhydride en adipinezuur en pimelinezuur, werden gebruikt om de cyclisatie uit te voeren om carbonzuur linkers van 2 tot 5 koolstofatomen genereren. Cyclisering werd uitgevoerd met microgolfenergie, en de uiteindelijke splitsing en zijketen-deprotectie stappen handmatig zonder microgolfenergie. Het gebruik van een geautomatiseerde synthesizer microgolf verbeterde de product zuiverheid, verhoogde de productopbrengst en verminderde de duur van de synthese. Deze algemene protocol kan worden toegepast op andere studies die peptiden gebruiken om belangrijke moleculaire mechanisme te begrijpen in vitro en in vivo en verdere ontwikkeling van potentiële geneesmiddelen voor ziekten bij de mens.
De synthese van een gefocusseerde bibliotheek van hoofdketen cyclische peptiden afgeleid uit het ontbreken eiwit van de Leishmania parasiet met een volautomatische magnetron synthesizer wordt beschreven. Een gerichte bibliotheek van cyclische peptiden werd ontwikkeld met geconserveerde farmacoforen en diverse linkers. Toevoeging van verschillende linkers zoals glutaarzuuranhydride, barnsteenzuuranhydride, adipinezuur, pimelinezuur, lysine, ornithine en andere bouwstenen kan worden gebruikt om de verscheidenheid…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Lauren Van Wassenhove, Sunhee Hwang en Daria Mochly-Rosen voor behulpzaam discussies. Het werk werd gesteund door de National Institutes of Health Grant NIH RC4 TW008781-01 C-IDEA (VONK) naar NQ de financiers hadden geen rol in de onderzoeksopzet, het verzamelen en analyseren van gegevens, het besluit te publiceren, of de bereiding van het manuscript.
REAGENTS | |||
Solid support, Rink Amide AM resin ML | CBL | BR-1330 | loading: 0.49 mmol/g |
Fmoc-Ala-OH | Advanced Chemtech | FA2100 | |
Fmoc-Arg(Pbf)-OH | Advanced Chemtech | FR2136 | |
Fmoc-Asn(Trt)-OH | Advanced Chemtech | FN2152 | |
Fmoc-Asp(OBut)-OH | Advanced Chemtech | FD2192 | |
Fmoc-Cys(Trt)-OH | Advanced Chemtech | FC2214 | |
Fmoc-Gln(Trt)-OH | Advanced Chemtech | FQ2251 | |
Fmoc-Glu(OtBu)-OH | Advanced Chemtech | FE2237 | |
Fmoc-Gly-OH | Advanced Chemtech | FG2275 | |
Fmoc-His(Trt)-OH | Advanced Chemtech | FH2316 | |
Fmoc-Ile-OH | Advanced Chemtech | FI2326 | |
Fmoc-Leu-OH | Advanced Chemtech | FL2350 | |
Fmoc-Lys(Boc)-OH | Advanced Chemtech | FK2390 | |
Fmoc-Met-OH | Advanced Chemtech | FM2400 | |
Fmoc-Phe-OH | Advanced Chemtech | FF2425 | |
Fmoc-Pro-OH | Advanced Chemtech | FP2450 | |
Fmoc-Ser-(tBu)-OH | Advanced Chemtech | FS2476 | |
Fmoc-Thr(tBu)-OH | Advanced Chemtech | FT2518 | |
Fmoc-Trp(Boc)-OH | Advanced Chemtech | FW2527 | |
Fmoc-Tyr(But)-OH | Advanced Chemtech | FY2563 | |
Fmoc-Val-OH | Advanced Chemtech | FV2575 | |
1-Methyl-2-pyrrolidinone (NMP) | Sigma | 328634 | Caution Toxic/Highly flammable/Irritant. |
N,N-Dimethylformamide (DMF) | Alfa Aesar | 43465 | Caution Toxic |
Use high quality DMF to eliminate side reactions such as Fmoc removal as a result of the dimethylamine traces from DMF decomposition. | |||
Dichloromethane (DCM) | Sigma | D65100 | Caution Harmful |
Dibromomethane (DBM) | Sigma | D41868 | Caution Harmful |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma | T62200 | Caution Corrosive/Toxic |
Trifluoroacetic acid, HPLC grade (TFA) | Sigma | 91707 | Caution Corrosive/Toxic |
Diethylether | Sigma | 31690 | Caution Highly flammable/Harmful |
Triisopropylsilane (TIS) | Sigma | 233781 | Caution Irritant/Flammable |
Water, HPLC grade | Sigma | 270733 | |
Acetonitroile, HPLC grade (ACN) | Fisher Scientific | A998-4 | Caution Flammable/Irritant/Harmful |
N,N-Diisopropylethylamine (DIEA) | Sigma | 3440 | Caution Corrosive/Highly flammable |
Piperidine | Sigma | W290807 | Caution Toxic/Highly flammable |
Pyridine | Sigma | 270970 | Caution Highly flammable/Harmful |
Ethanol (EtOH) | Sigma | 459844 | Caution Highly flammable/Irritant |
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBt) | Sigma | 157260 | Caution Highly flammable/Irritant/Harmful |
O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) | Sigma | 12804 | Caution Irritant/Harmful |
Benzotriazole-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP) | Advanced Chemtech | RC8602 | Caution Irritant |
Ninhydrin | Sigma | 454044 | Caution Harmful |
Phenol | Sigma | P3653 | Caution Corrosive/Toxic |
Potassium cyanide (KCN) | Sigma | 11813 | Caution Very Toxic |
Potassium hydroxide (KOH) | Sigma | 221473 | Caution Toxic |
N,N’- | Sigma | 38370 | Caution Flammable/ Toxic |
Diisopropylcarbodiimide (DIC) | |||
4-Dimethylaminopyridine (DMAP) | Sigma | 522805 | Caution Toxic/Irritant |
Glutaric anhydride | Sigma | G3806 | Caution Flammable/Irritant/Harmful |
Succinic anhydride | Sigma | 239690 | Caution Irritant/Harmful |
Adipic acid | Sigma | A26357 | Caution Toxic/Irritant |
Pimelic acid | Sigma | P45001 | Caution Toxic/Irritant |
Chloranil | Sigma | 23290 | Caution Toxic/Irritant |
Acetaldehyde | Sigma | 402788 | Caution Flammable/ Toxic |
EQUIPMENT | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R centrifuge | |
Lyophilizer | Labconco | freezone 4.5 | |
Vacuum pump | Franklin Electric | model 1101101416 with 3/4 HP | Alcatel pump with Franklin Motor |
Polypropylene cartridge 12 ml | Applied Separation | 2419 | |
Cap plug for 12 ml polypropylene cartridge | Applied Separation | 8157 | |
Polypropylene cartridge 3 ml | Applied Separation | 2413 | |
Cap plug for 3 ml polypropylene cartridge | Applied Separation | 8054 | |
Stop cocks PTFE | Applied Separation | 2406 | |
Tubes flat, 50 ml | VWR | 21008-240 | |
Extraction manifold, 20 pos, 16 x 100 mm tubes | Waters | WAT200609 | |
Shaker, BD adams™ nutator mixer | Fisher scientific | 22363152 | |
Nalgene HDPE narrow mouth IP2 bottles, 125 ml | Fisher scientific | 03-312-8 | |
Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | FB-501, 500 ml | |
Heating block | Thermolyne | 1760 dri bath | |
Disposable borosilicate glass tubes with plain end | Fisher Scientific | 14-961-25 | |
Micropipettes and tips Finnpipette | Thermo | 20–200 and 100–1,000 μl | |
HPLC vials – micro vl pp 400 µl PK100 | VWR | 69400-124 | |
HPLC vial- Blue Snap-It Cap | VWR | 66030-600 | |
Analytical HPLC column | Peeke Scientific | U1-5C18Q-JJ | ultro 120 5 µm C18Q, 4.6 mm ID 150 mm |
Prep HPLC column, XBridge | Waters | OBD C18 5 µm column | 19 mm × 150 mm |
Mass spectrometer | Applied Biosystems | Voyager DE-RP |