Protocol
1. H2B-PSmOrange ARNm de transcription in vitro et la purification de l'ARNm
- Linéariser le H2B-PSmOrange contenant pCS2 + plasmidique en utilisant l'enzyme de restriction Notl, selon les instructions du fabricant.
Remarque: effectuer les étapes suivantes à l'aide de protections appropriées telles que des gants et une blouse de laboratoire pour éviter la contamination et de la dégradation de l'ARNm. - Purifier l'ADN linéarisé en utilisant une PCR méthodes basées sur un kit de purification ou au phénol-chloroforme selon les protocoles du fabricant.
- En utilisant 1 ug d'ADN matrice linéarisé pour Sp6-transcription de l'ARNm selon les instructions du fabricant.
- Éliminer l'ADN en ajoutant 1,0 U RNase DNase I pendant 10-20 min à 37 ° C.
- Nettoyer l'ARNm en utilisant une ARN nettoyer Kit selon le protocole du fabricant.
- Pour augmenter la pureté et la concentration de l'ARNm, l'ARNm précipiter par addition de 6 ul d'acétate de sodium (3,0 M, pH 5,2) et 150 ul de 96% d'éthanol. Incuber le mixe solution à -20 ° C pendant au moins 30 minutes et jusqu'à 24 heures.
- Recueillir l'ARNm en faisant tourner la solution à 18,407 g pendant 45 min à 4 ° C. Jeter le liquide et le remettre en suspension dans 150 pi d'ARNm 70% d'éthanol. Mélanger et centrifuger la solution pendant 15 min à 4 ° C. Jeter le liquide, sécher le culot pendant 5 minutes sur de la glace et remettre l'ARNm dans 20 ultrapure pi RNase eau libre.
- Évaluer la concentration et la pureté de l'ARNm par la mesure photométrique d'un mélange 1: ARNm de dilution 100 (1 pi d'ARNm dans l'eau exempte de RNase ultrapure 99 pi).
- Pour le stockage à court terme, maintenir la solution d'ARNm à -20 ° C. Pour le stockage à long terme, maintenir l'ARNm à -80 ° C.
2. H2B-PSmOrange ARNm microinjection dans des embryons de poissons zèbres
- Mettre en place l'accouplement paires la nuit avant l'injection en utilisant tg (foxD3: GFP); tg (FLH: GFP) deux de poissons transgéniques (ou tout autre GFP poisson transgénique). Laissez le poisson séparés en plaçant une entretoiseentre eux pour contrôler le temps de l'accouplement.
- Retirer l'entretoise dans la matinée de l'injection et de laisser le compagnon de poisson pendant 20 min.
- Pendant le temps de l'accouplement, diluer le H2B-PSmOrange ARNm à la concentration finale de 130 pg / nl (en RNase eau libre) et le transfert 6 solution d'injection de pi dans un capillaire de micro-injection à l'aide d'une pointe de microloader. Vérifiez le volume d'injection avec une lame de verre calibré. Régler la pression d'injection pour injecter 2 Solution de ARNm nl (260 p).
- Ramasser les oeufs dans une boîte de Petri en plastique stérilisée contenant embryon 1x (E3) moyen.
- Transférer 20 à 30 embryons dans un plat d'injection à l'aide d'une pipette en plastique de pasteur.
- Injecter 2 nl ARNm contenant une solution dans la cellule ou juste en dessous de la cellule dans le jaune d'oeuf à l'étape 11 une cellule.
- Transfert d'embryons injectés dans une boîte de Pétri contenant du milieu 1x E3, supprimer les embryons se développent normalement non fécondés ou non et se développent entre eux à 28 ° C.
Remarque: Protection contre la lumière of les embryons ne sont pas requis pendant toute l'expérience. - Soulever les embryons de poisson zèbre dans un milieu de 1x E3 et ajouter 0,2 mM PTU (1-phényl-2 thio) après la gastrulation pour inhiber la pigmentation. Changer le milieu deux fois par jour afin de minimiser le risque de contaminations bactériennes.
3. embryon Embedding
- Sélectionnez la GFP (vert) et PSmOrange embryons (orange / rouge) co-exprimant l'aide d'un microscope binoculaire équipé d'une lampe à fluorescence et les filtres d'émission appropriés. Transférer les embryons positifs dans une boîte de Pétri stérile contenant le milieu 1x E3.
- Embryons Dechorionate sous un microscope stéréoscopique en utilisant une pince 12.
- Transfert d'un embryon dans un tube de 1,5 ml contenant 1,0 ml de pré-chauffé 1,0% agarose bas point de fusion (LMA) préparé dans de l'eau ultra-pure à l'aide d'une pipette coupe-pointe (P200). Remarque: Chauffer le LMA à 80 ° C et refroidir pendant 3-5 min à température ambiante avant de l'intégrer l'embryon.
- Transférer l'embryon dans 150 ul LMA dans unchambré lamelle et d'ajuster l'orientation de l'embryon, par exemple face dorsale vers le bas dans l'expérience décrite pour le laser microscope confocal à balayage A1R inversé + (ou tout autre microscope approprié), en utilisant un bout de plastique bien. Lorsque le LMA est polymérisé, remplir la chambre avec de l'eau de poisson contenant mM PTU 0,2 et 0,02% éthyl méthanesulfonate 3-aminobenzoate (Tricaine) pour l'anesthésie.
- Avant l'imagerie de l'échantillon, attendre 15 min pour déterminer l'effet de Tricaine. L'anesthésie empêche les mouvements de l'embryon, qui peuvent être contrôlés au moyen d'un stéréomicroscope équipé d'un éclairage en fond clair.
Remarque: Les chambres peuvent être réutilisés à deux reprises.
4. PSmOrange Photoconversion
- Placer l'échantillon sous le microscope confocal et analyser les échantillons pour identifier la zone à l'aide de photoconvert 488 nm et 561 nm lasers pour imager la GFP et PSmOrange respectivement.
Remarque: Utilisez le confocal à balayage laser microscope A1R + inversé sur la sta inversége TiEcontrolled par le logiciel d'imagerie de microscope et équipées 488 nm, 561 nm et 640 nm pour les lasers photoconversion et d'imagerie. Toutefois, l'application est certes pas limitée à cette microscope aussi longtemps que les rayons laser et l'imagerie de conversion sont disponibles.- Mettez l'objectif de l'air 20X en place (NA: 0,75; WD: 1,0 mm; FOV: 0,64 x 0,64 mm).
- Utiliser les paramètres suivants au microscope pour détecter la protéine PSmOrange avant photoconversion: 561 nm laser, 0,74 mW mesurée au plan focal de l'objectif ci-dessus.
Remarque: ce qui correspond à 40% par rapport à ce système (mesure dans le plan de mise au point est le seul moyen pour déterminer la puissance effective). Régler la puissance du laser en fonction des besoins expérimentaux que l'efficacité des injections H2B-PSmOrange peut varier. - Ajouter facteurs de zoom pour mettre en évidence la zone d'intérêt. grossissements plus élevés réduisent le temps d'acquisition d'image et donc la phototoxicité.
- Acquérir un z-stack couvrant la structures d'intérêt en utilisant 488 nm et 561 nm lasers à mode séquentiel (mode ligne 1-> 4). Fixer le z-étape entre 1,0 et 2,0 um. moyenne de la ligne et de la fréquence de balayage peuvent être utilisés pour optimiser la qualité d'image.
- Balayez l'échantillon et sélectionnez la région d'intérêt (ROI) outil pour mettre en évidence la zone à photoconvert. Fixer le retour sur investissement que la zone de stimulation. Sélectionnez le module photo Activation / Blanchiment, activer le laser de 488 nm en cochant la case correspondante et réglez le laser de 488 nm à 80% (de la puissance du laser 1 mW mesurée à l'objectif). Réglez la vitesse de balayage à 0,5 sec / cadre.
- Ouvrez l'utilitaire de photoconversion (ND Stimulation) et spécifier les paramètres de photoconversion.
- Cliquez sur la commande "Ajouter" pour indiquer le protocole de photoconversion.
- Set "Phase" 1 dans le menu "Acquisition / Stimulation" à "Acquisition" et indiquer le nombre d'images à être acquis avant photoconversion dans le menu "Loops".
- Réglez "Phase" 2 à "Stimulation "et entrez le nombre d'événements de stimulation à effectuer.
- Ajuster "Phase" 3 comme décrit pour "Phase" 1. En option, insérer une attente "Phase" après "Phase" 2 en entrant le temps à attendre avant la dernière ronde de l'acquisition d'images.
- Une fois que tous les paramètres sont réglés, appliquer le réglage de la stimulation et exécuter le photoconversion.
Remarque: Puissance du laser, la fréquence de balayage et le nombre d'itérations pour chaque tour de photoconversion peut varier et diffère de l'embryon à l'embryon. Un cadre pour commencer est indiqué dans le tableau 1.
- Acquérir un z-stack final en utilisant 488 nm, 561 nm et 640 nm lasers appliquant les paramètres comme ci-dessus. Régler le laser 640 nm pour visualiser l'PSmOrange convertie, en utilisant la puissance de laser élevée (jusqu'à 4,5 mW).
5. Démonter embryon de LMA
- Retirer l'embryon chambre contenant du microscope. Retirez délicatement l'embryon de l'u agarosechanter forceps.
- Transférer l'embryon dans un nouveau plastique stérilisé boîte de Pétri ou dans une 6 puits plaque stérilisée contenant 1x E3 et mM PTU 0,2. Incuber l'embryon à 28 ° C jusqu'à ce que le stade de développement souhaité.
6. Analyse du destin de Photoconverted PSmOrange protéines cellules exprimant
- Re-intégrer l'embryon comme indiqué aux points 3.3 et 3.4.
- Placer l'échantillon sous le microscope confocal et analyser l'échantillon pour identifier les cellules photoconverted (640 nm) dans la structure transgénique GFP d'intérêt (488 nm).
- Acquérir un z-stack couvrant les structures d'intérêt en utilisant 488 nm, 561 nm et 640 nm lasers à mode séquentiel (mode ligne 1-> 4). Fixer le z-étape entre 1,0 et 2,0 um. moyenne de la ligne et de la fréquence de balayage peuvent être utilisés pour optimiser la qualité d'image.
- Utilisez l'une des méthodes suivantes pour identifier les cellules qui GFP co-express et la protéine photoconverted.
- Du sur mesure automatique Fidji imageJ 3 Macro
- Convolve la pile d'origine en utilisant le plugin "GaussianBlur" (→ Processus → Filtres → GaussianBlur) et soustraire les piles lisses de l'original à l'aide du plug-in "de la calculatrice de l'image" (→ Processus → Calculatrice de l'image). Cette étape permet de visualiser les structures d'intérêt et de réduire le temps de calcul pour l'analyse.
- Appliquer des seuils spécifiques aux canaux vert et rouge lointain afin de mettre en évidence les cellules photoconverted (→ Photo → Ajuster → Seuil). Utilisez l'outil "analyser des particules" pour détecter les zones de seuil avec un réglage approprié (→ Analyser → analyser des particules).
- Ouvrez le "calculateur d'image" plugin et afficher les ROI de chevauchement dans le canal vert et rouge lointain en jaune (→ Processus → Calculatrice de l'image).
- logiciel d'imagerie Microscope pour l'évaluation des données 3D
- Afficher la pile3D en utilisant la vue option Afficher le volume (→ 3D Visualization Menu → Afficher Volume View). Utiliser l'interface graphique pour sélectionner les canaux vert, rouge et rouge lointain, régler la luminosité et le contraste et recadrer la pile 3D pour mettre en évidence la zone photoconverted (Figure 1).
Remarque: Des méthodes similaires pour analyser les données sont disponibles dans la plupart des logiciel commun pour l'analyse d'images.
- Afficher la pile3D en utilisant la vue option Afficher le volume (→ 3D Visualization Menu → Afficher Volume View). Utiliser l'interface graphique pour sélectionner les canaux vert, rouge et rouge lointain, régler la luminosité et le contraste et recadrer la pile 3D pour mettre en évidence la zone photoconverted (Figure 1).
- Du sur mesure automatique Fidji imageJ 3 Macro
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Representative Results
La figure 1 illustre un exemple de système PSmOrange de photoconversion. Le complexe pinéale est une structure conservée dans la dorsale diencéphale vertébrés. Comme dans beaucoup d'autres vertébrés, le complexe se compose de la glande pinéale dans le centre du diencéphale et les cellules parapineal du côté gauche. Expériences uncaging élégantes mais chronophages montré que les cellules parapineal originaires de la partie antérieure de la glande pinéale 13. En tg (foxD3: GFP); tg (FLH: GFP) embryons transgéniques, les cellules à la fois pinéale et parapineal sont marqués au cours du développement. Pour évaluer la pertinence du système PSmOrange nous avons utilisé ces embryons de reproduire le développement complexe pinéale rapporté. 260 ARNm pg codant la forme nucléaire de PSmOrange, H2B-PSmOrange, ont été injectés dans stade unicellulaire doubles embryons transgéniques pour exprimer la protéine dans tous les noyaux cellulaires. embryons injectés ont été incubées à 28 ° C jusqu'à 24 heures après fertilization (HPF), sélectionné pour la GFP et une forte expression H2B-PSmOrange et noyée dans LMA dans un système à chambre de lamelle avec la face dorsale tournée vers le bas. L'échantillon a été placé sous une inversé laser confocale à balayage commandé par un logiciel d'imagerie de microscope et équipées 488 nm, 561 nm et 640 nm et des lasers un objectif de 20X de photoconversion air et de suivi. Deux agrégats de cellules dans la partie antérieure de la glande pinéale et ont été immédiatement photoconverted imagées (Figure 1A - F). Les cellules photoconverted peuvent être visualisées en utilisant le laser de 640 nm (rouge lointain - la figure 1C), mais pas avec le laser 561 nm (orange / rouge - figure 1B). Expression de la GFP dans ces cellules a d'abord été également réduit en raison de photoblanchiment (Figure 1A, 1D, 1F). À 52 hpf H2B-GFP et PSmOrange a été détectée dans les cellules exprimant la protéine H2B-PSmOrange photoconverted (Figure 1A '- F'). En effet, quelques-uns de ces cellules ont formé le parapineal sur le côté gauche du cerveau (flèches sur la figure 1A '- F'). Ce résultat est cohérent avec des rapports antérieurs sur l'origine de la cellule parapineal et montre l'applicabilité de la technique de PSmOrange chez le vertébré embryon vivant.
. Figure 1. Identification de l'origine des cellules parapineal utilisant le système PSmOrange de photoconversion à vivre des embryons de poisson zèbre (A - F ') vues dorsale antérieure au sommet axé sur le diencéphale dorsale d'un tg (foxD3: GFP); tg (FLH: GFP) mettant en évidence l'embryon transgénique pinéale (P) et les cellules parapineal (pp) à (A - F) immédiatement après 26 hpf photoconversion et (A '- C & # 39;) 26 heures plus tard à 52 HPF. L'embryon a été injecté avec ARNm codant H2B-PSmOrange. Les images montrent reconstructions 3D. L'expression de (A, A ') GFP transgénique, (B, B') non converti H2B-PSmOrange (canal rouge) et (C, C ') après photoconversion (canal rouge lointain). cercles en pointillés blancs mettent en évidence la zone de photoconversion, qui est dépourvue de fluorescence orange / rouge. (D, D ') fusion des trois chaînes (vert, rouge, rouge lointain), (E, E') canaux rouge et rouge lointain et (F, F ') des canaux vert et rouge lointain. (A'-F ') des pointes de flèches blanches soulignent l'emplacement des cellules parapineal, qui montrent, orange / fluorescence rouge et rouge lointain vert. (AF) La barre d'échelle est affichée dans le coin inférieur droit de chaque image.pload / 53604 / 53604fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Phase | Nombre de boucle | Lasers actifs |
| Acquisition | 1 cycle | 488 nm, 561 nm, 640 nm |
| Stimulation | 15 à 30 cycles | 488 nm |
| Maturation | 1 minute | # |
| Acquisition | 1 cycle | 488 nm, 561 nm, 640 nm |
Tableau 1: Conditions pour H2B-PSmOrange photoconversion.
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Discussion
embryons transgéniques portant reporters fluorescents ont contribué fondamentalement à comprendre le développement embryonnaire. Cependant, il y a encore le besoin essentiel pour les promoteurs pour faciliter la visualisation précise des structures particulières. En leur absence, les chercheurs comptent sur des techniques telles que la photoconversion de protéines fluorescentes de se renseigner sur l'origine et le développement de leur structure d'intérêt. Cela est une condition préalable essentielle pour identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans son développement. Les progrès techniques dans le domaine du poisson zèbre permettent maintenant de remplacer la FP dans des lignées transgéniques avec, par exemple, des protéines photoconvertible l'aide d'un coup médiation CRISPR-cas9 approche 14,15. Cependant, cette technique est relativement fastidieux et pas toujours avec succès. En revanche, l'application de façon ubiquitaire exprimé H2B-PSmOrange en GFP et éventuellement d'autres milieux transgéniques est une technique simple pour suivre cellules à travers emdéveloppement bryonic.
Par exemple, l'origine de la habenulae ventrale du poisson zèbre, une partie d'un système de conduction nerveuse conservée dans le diencéphale dorsale de vertébrés, a été difficile à atteindre, jusqu'à récemment, et donc pas de cascade génétique sous-jacente de son développement a été découvert. En utilisant le système de PSmOrange et l'analyse time-lapse à long terme à suivre cellules migrantes, nous avons pu montrer que, contrairement aux dorsales noyaux habénulaires, qui proviennent gauche et à droite adjacentes à l'épiphyse, neurones habénulaires ventrales développer postérieure à cette région dans le thalamus 3. Cette connaissance nous a permis ensuite d'identifier la fonction cruciale de la signalisation Wnt canonique gène en aval TCF7L2 pour le développement des neurones habénulaires ventrale.
L'application du système de PSmOrange photoconvertible est simple, rapide et a l'avantage sur les protéines photoactivatible que les embryons peuvent être sélectionnés pour l'expression des protéines forte avant illumination. synthétique mRcodant pour la NA-H2B PSmOrange est injecté dans l'embryon transgénique de la GFP à exprimer la protéine fluorescente de façon ubiquitaire dans tous les noyaux d'orange. Nous avons rencontré aucun des effets secondaires lors de l'injection et la protéine est stable pendant au moins 96 h. La protéine est ensuite photoconverted GFP dans des cellules transgéniques dans la ROI à l'aide d'un laser d'excitation de 488 nm et l'embryon peut être analysée pour la protéine fluorescente rouge lointain maintenant contenant des cellules à l'intérieur de l'subséquente environ 48 heures. Il est essentiel de suivre le succès photoconversion que les conditions peuvent varier en fonction du stade de développement de l'embryon et le tissu ciblé. Le logiciel d'imagerie de microscope acquiert une image de chaque canal (vert, rouge et rouge lointain) avant et après photoconversion. Le rendement de photoconversion peut être évaluée à mesurer la fluorescence d'intensité moyenne dans la ROI entre les différents canaux avant et après photoconversion. Si aucune fluorescence rouge lointain est détecté immédiatement après photoconversion annoncetours de photoconversion conditionnelles doivent être appliquées. GFP blanchiment est fréquente après photoconversion. Toutefois, la translation continue de la protéine fluorescente transgénique surmonte ce problème en environ 2 heures.
Une macro sur mesure pour les Fidji ImageJ pour faciliter l'identification des cellules co-exprimant la protéine photoconverted et la GFP transgénique est disponible 3. création future de lignées transgéniques stables exprimant le H2B-PSmOrange va encore simplifier cette procédure. Il facilitera également l'analyse des événements de développement après 4 jours après la fécondation, ce qui pourrait avoir une valeur intéressante pour la recherche des domaines tels que la régénération des tissus. En outre, la combinaison de la mère exprimant transgéniques de PSmOrange et imagerie time-lapse 16 sera un outil puissant pour étudier les événements migratoires de cellule de départ avant la gastrulation au niveau de la cellule unique. D'autres applications peuvent inclure l'échange de la balise nucléaire H2B avec, fou une instance, GAP43 de visualiser les membranes cellulaires et potentiellement axones dans le développement de l'embryon.
Une des limites de cette technique est que la protéine zygotic ne commence à être exprimé après la gastrulation et est donc pas applicable à l'analyse des processus de gastrulation. Il doit également être considéré qu'il est assez difficile de photoconvert la protéine dans les cellules situées en profondeur dans l'embryon. paramètres de photoconversion doivent être adaptés en tant que puissance laser élevée et relativement longtemps de stimulation nécessaire pour photoconversion peut entraîner des lésions des tissus, ce qui nécessite une surveillance attentive.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | |
| RNeasy MiniElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| Plastic Pasteur | alpha laboratories | LW4000 | |
| Original H2B-PSmOrange Plasmid | Addgene | 31920 | The plasmid described in the paper is available in the Carl lab |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | 5247 000.013 | |
| Forceps (5 Inox) | NeoLab | 2-1633 | |
| Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System | Nunc | 155382 | |
| Nikon A1R+ | Nikon GmbH Germany | No Number | |
| Nikon PLAN Apo λ 20X air objective | Nikon GmbH Germany | No Number | |
| NIS Elements AR Software (v. 4.30.02) | Nikon GmbH Germany/Laboratory Imaging | No Number |
References
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- Subach, O. M., et al. A photoswitchable orange-to-far-red fluorescent protein, PSmOrange. Nature Methods. 8, 771-777 (2011).
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