Protocol
1. H2B-PSmOrange mRNA transcrição in vitro e mRNA Purificação
- Linearizar o H2B-PSmOrange contendo pCS2 + plasmídeo utilizando a enzima de restrição NotI de acordo com as instruções do fabricante.
Nota: Execute as seguintes etapas usando proteções adequadas, tais como luvas e bata de laboratório para evitar a contaminação e degradação do mRNA. - Purifica-se o ADN linearizado utilizando um kit de purificação ou de fenol-clorofórmio PCR métodos baseados acordo com os protocolos dos fabricantes.
- Use 1 ug de ADN molde linearizados para transcrição sp6-ARNm de acordo com as instruções do fabricante.
- Remover o DNA pela adição de 1,0 U de RNase livre ADNasel durante 10-20 min a 37 ° C.
- Limpar o mRNA usando um RNA limpar kit de acordo com o protocolo do fabricante.
- Para aumentar a pureza e concentração de ARNm, o ARNm de precipitar por adição de 6 ul de acetato de sódio (3,0 M, pH 5,2) e 150 ul de etanol a 96%. Incubar a mixed solução a -20 ° C durante pelo menos 30 minutos e até 24 h.
- Recolhe-se o ARNm por fiação da solução a 18,407 xg durante 45 min a 4 ° C. Descartar o líquido e ressuspender o ARNm em 150 ul de etanol a 70%. Misturar e centrifugar a solução durante mais 15 min a 4 ° C. Descartar o líquido, secar o sedimento durante 5 minutos em gelo e ressuspender o ARNm em 20 ul de ARNase ultrapura água livre.
- Avaliar a concentração e pureza do ARNm por medição fotométrica de uma diluição 1: 100 de ARNm (ARNm 1 ul em 99 ul ultrapura RNase isenta de água).
- Para armazenagem a curto prazo, manter a solução de ARNm a -20 ° C. Para armazenamento a longo prazo, manter o ARNm a -80 ° C.
2. H2B-PSmOrange mRNA microinjeção em embriões Zebrafish
- Configurar o acasalamento pares na noite antes da injeção usando tg (FOXD3: GFP); tg (FLH: GFP) peixes transgénicos casal (ou qualquer outro peixe transgénico GFP). Deixar o peixe separada por colocação de um espaçadorentre eles para controlar o tempo de acasalamento.
- Remova o espaçador na manhã de injecção e deixar o companheiro de peixe para 20 min.
- Durante o acasalamento tempo, dilui-se o ARNm H2B-PSmOrange até à concentração final de 130 pg / NL (em RNase isenta de água) e a transferência de 6 ul de solução de injecção para um capilar de microinjecção utilizando uma ponta de microloader. Verifique o volume de injeção com uma lâmina de vidro calibrado. Ajuste a pressão de injeção para injetar 2 solução mRNA nl (260 pg).
- Recolher os ovos em uma placa de petri de plástico esterilizado contendo Embryo 1x médio (E3).
- Transferir 20 a 30 embriões de um prato de injecção, utilizando uma pipeta de pasteur de plástico.
- Injectar 2 nl de ARNm contendo uma solução para a célula ou apenas abaixo da célula na gema no estádio de uma célula-11.
- Transferência de embriões injetado em uma-placa de petri contendo meio 1x E3, retire os embriões que se desenvolveram normalmente não fertilizados ou não e cultivá-las a 28 ° C.
Nota: A proteção Luz of os embriões não é necessário durante todo o experimento. - Elevar embriões de peixe-zebra em meio 1x E3 e adicionar PTU 0,2 mM (1-fenil-2 tioureia) após a gastrulação para inibir a pigmentação. Mudar o meio duas vezes por dia para minimizar o perigo de contaminações bacterianas.
3. Embryo Embedding
- Seleccione a GFP (verde) e PSmOrange (laranja / vermelho) embriões co-expressando usando um microscópio binocular equipado com uma lâmpada fluorescente e filtros de emissão adequados. Transferir os embriões positivos em uma placa de petri estéril contendo meio 1x E3.
- Embriões Dechorionate sob um microscópio estereoscópico com a pinça 12.
- Transferência de um embrião em um tubo de 1,5 ml contendo 1,0 ml de pré-aquecido 1,0% de agarose de baixa fusão (LMA) preparadas em água ultrapura, utilizando uma pipeta de corte de ponta (P200). Nota: Aquecer o LMA a 80 ° C e arrefecer durante 3-5 minutos à temperatura ambiente antes de incorporar o embrião.
- Transferir o embrião em 150 ul LMA numacompartimentado lamela e ajustar a orientação do embrião, por exemplo, o lado dorsal para baixo na experiência descrita para o laser confocal de varredura microscópio invertido A1R + (ou qualquer outro microscópio adequado), utilizando uma ponta de plástico fino. Quando o LMA é polimerizado, encher a câmara com água de peixe contendo PTU 0,2 mM e 0,02% de acetato de 3-aminobenzoato metanossulfonato (tricaina) para a anestesia.
- Antes de imagem da amostra, esperar 15 min para determinar o efeito de tricaina. A anestesia impede movimentos embrião, que pode ser monitorado usando um estereomicroscópio equipado com iluminação de campo claro.
Nota: As câmaras podem ser reutilizado duas vezes.
4. PSmOrange fotoconversão
- Colocar a amostra sob o microscópio confocal e digitalizar a amostra para identificar a área para photoconvert usando 488 nm e 561 nm lasers para geração de imagens GFP e PSmOrange respectivamente.
Nota: Use o confocal de varredura a laser do microscópio invertido A1R + no sta invertidoge TiEcontrolled pelo software de imagem de microscópio e equipado com 488 nm, 561 nm e 640 nm lasers para fotoconversão e imagem. No entanto, a aplicação, certamente, não está restringido a esta microscópio, enquanto as linhas de laser para a conversão e de imagem estão disponíveis.- Coloque o objectivo de ar 20X no lugar (NA: 0,75; WD: 1,0 mm; FOV: 0,64 x 0,64 mm).
- Use as seguintes configurações microscópio para detectar a proteína PSmOrange antes fotoconversão: 561 nm laser, 0,74 mW medido no plano de foco acima do objetivo.
Nota: Isto corresponde a 40% neste sistema (de medida no plano do foco é a única forma de determinar a potência efectiva). Ajustar a potência de laser de acordo com as necessidades experimentais como a eficiência de injecções H2B-PSmOrange pode variar. - Adicionar fatores de zoom para destacar a área de interesse. ampliações reduzir o tempo de aquisição de imagem e, portanto, fototoxicidade.
- Adquirir uma z-stack que cubra a estruturas de interesse utilizando 488 nm e 561 nm lasers no modo sequencial (modo de linha 1-> 4). Fixar o z-passo entre 1,0 e 2,0 mm. média linha ea frequência de scaneamento pode ser usado para otimizar a qualidade da imagem.
- Digitalizar a amostra e selecione a região de interesse ferramenta (ROI) para realçar a área para photoconvert. Fixar o ROI como área de estimulação. Selecione o módulo Foto Activation / Branqueamento, ativar o laser de 488 nm, marcando a respectiva caixa de e definir o laser de 488 nm a 80% (potência do laser 1 mW medida no objetivo). Defina a velocidade de digitalização para 0,5 seg / Frame.
- Abra o utilitário fotoconversão (ND Stimulation) e especifique as configurações fotoconversão.
- Clique no comando "Adicionar" para especificar o protocolo de fotoconversão.
- Ajuste "Fase" 1 no menu "Aquisição / Estimulação" a "Aquisição" e indicar o número de imagens a serem adquiridos antes fotoconversão no menu "Loops".
- Ajuste "Fase" 2 para "Stimulation "e digite o número de eventos de estimulação a ser realizada.
- Ajuste "Fase" 3 como descrito para "Fase" 1. Opcionalmente, insira uma espera "Phase" depois de "Phase" 2 digitando o tempo de espera antes da última rodada de aquisição de imagem.
- Uma vez que todos os parâmetros são definidos, aplicar a definição estimulação e executar o fotoconversão.
Nota: A potência do laser, a frequência de digitalização e número de iterações para cada rodada de fotoconversão pode variar e ser diferente de embrião para embrião. Uma configuração para começar com é mostrado na Tabela 1.
- Adquirir uma z-stack final usando 488 nm, 561 nm e 640 nm lasers de aplicar as configurações como acima. Definir o laser de 640 nm para visualizar a PSmOrange convertido utilizando alta potência do laser (até 4,5 mW).
5. Desmontar Embrião de LMA
- Remover o embrião contendo câmara do microscópio. Remova cuidadosamente o embrião do u agarosecantar fórceps.
- Transferência do embrião para um novo plástico esterilizado placa de petri ou em um de 6 poços de placa esterilizada contendo 1x E3 e UTP 0,2 mM. Incubar o embrião a 28 ° C até à fase de desenvolvimento desejado.
6. Analisando o Fate of Photoconverted PSmOrange proteína células que expressam
- Re-inserir o embrião como descrito nos pontos 3.3 e 3.4.
- Colocar a amostra sob o microscópio confocal e digitalizar a amostra para identificar as células photoconverted (640 nm) na estrutura transgênica GFP de interesse (488 nm).
- Adquirir uma z-stack cobrindo as estruturas de interesse utilizando 488 nm, 561 nm e 640 nm lasers no modo sequencial (modo de linha 1-> 4). Fixar o z-passo entre 1,0 e 2,0 mm. média linha ea frequência de scaneamento pode ser usado para otimizar a qualidade da imagem.
- Use um dos seguintes métodos para identificar células, que GFP co-express e a proteína photoconverted.
- personalizado feito Imagem automática FijiJ 3 Macro
- Convolve a pilha original usando o plugin "GaussianBlur" (→ Processo → Filtros → GaussianBlur) e subtrair as pilhas lisas do original usando o plugin "Calculadora de Imagens" (→ Processo → Calculadora de Imagem). Usar este passo de visualizar as estruturas de interesse e reduzir o tempo de processamento para a análise.
- Aplicar limites específicos para os canais verde e vermelho-distante, a fim de destacar as células photoconverted (→ Imagem → Ajuste → Threshold). Use o "Analisar Particles" ferramenta para detectar as áreas de limiar com um ambiente adequado (→ Analisar → Analisar Partículas).
- Abra o plugin "Calculadora Imagem" e exibir os ROIs sobrepostos no canal verde e vermelho-distante em amarelo (→ Processo → Calculadora de Imagem).
- software de imagem de microscópio para avaliação de dados 3D
- Mostrar a pilha no3D utilizando a opção view show de volume (→ 3D Menu de visualização → Mostrar Volume View). Use a interface gráfica para selecionar os canais verde, vermelho e far-vermelhos, ajustar o brilho eo contraste e recortar a pilha 3D para destacar a área photoconverted (Figura 1).
Nota: métodos similares para analisar os dados estão disponíveis na maior parte do software comum para análise de imagem.
- Mostrar a pilha no3D utilizando a opção view show de volume (→ 3D Menu de visualização → Mostrar Volume View). Use a interface gráfica para selecionar os canais verde, vermelho e far-vermelhos, ajustar o brilho eo contraste e recortar a pilha 3D para destacar a área photoconverted (Figura 1).
- personalizado feito Imagem automática FijiJ 3 Macro
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Representative Results
A Figura 1 ilustra um exemplo do sistema PSmOrange fotoconversão. O complexo pineal é uma estrutura conservada no diencéfalo dorsal vertebrado. Como em muitos outros vertebrados, esse complexo é constituído por o órgão pineal no centro do diencéfalo e as células parapineal do lado esquerdo. Experimentos uncaging elegantes, mas demoradas mostraram que as células parapineal originam na parte anterior do órgão pineal 13. Em tg (FOXD3: GFP); tg (FLH: GFP) embriões transgênicos, células tanto pineal e parapineal são rotulados durante o desenvolvimento. Para avaliar a adequação do sistema de PSmOrange usamos esses embriões para reproduzir o complexo desenvolvimento pineal relatado. 260 pg de ARNm que codificam a forma nuclear de PSmOrange, H2B-PSmOrange, foi injectado no estádio de uma célula duplos embriões transgénicos para expressar a proteína em todos os núcleos celulares. embriões injectados foram incubados a 28 ° C até 24 h pós fertilizatde iões (HPF), seleccionado para GFP e forte expressão H2B-PSmOrange e incorporado no LMA num sistema lamela septadas, com o lado dorsal orientada na direcção do fundo. A amostra foi colocada sob um microscópio invertido confocal de varrimento laser controlado por software de imagem de microscópio e equipado com 488 nm, 561 nm e 640 nm e um laser de objectiva 20X ar para fotoconversão e acompanhamento. Dois grupos de células na parte anterior da pineal foram photoconverted e imediatamente fotografada (Figura 1A - F). As células photoconverted pode ser visualizada usando o laser de 640 nm (vermelho longínquo - Figura 1C), mas não com o laser de 561 nm (laranja / vermelho - Figura 1B). Expressão de GFP nestas células foi inicialmente também reduzida devido à fotodegradação (Figura 1A, 1D, 1F). Aos 52 HPF GFP e H2B-PSmOrange foi detectada nas células que expressam proteínas H2B-PSmOrange photoconverted (Figura 1A '- F'). De facto, algumas dessas células formadas a parapineal no lado esquerdo do cérebro (pontas de seta na Figura 1A '- F'). Este resultado é consistente com relatórios anteriores sobre a origem celular parapineal e mostra a aplicabilidade da técnica PSmOrange no embrião vertebrado vivo.
. Figura 1. Identificar a origem celular parapineal usando o sistema PSmOrange fotoconversão em viver embriões de peixe-zebra (A - F ') vista dorsal com anterior ao topo focada no diencéfalo dorsal de um tg (FOXD3: GFP); tg (FLH: GFP) de embriões transgênicos destacando a pineal (P) e as células parapineal (pp) em (A - F) 26 hpf imediatamente após fotoconversão e (A '- F & # 39;) 26 horas mais tarde, em 52 hpf. O embrião foi injectado com ARNm codificando H2B-PSmOrange. As imagens mostram reconstruções 3D. A expressão de (A, A ') GFP transgénico, (B, B') não convertido H2B-PSmOrange (canal de vermelho) e (C, C '), após o fotoconversão (canal de medida-vermelho). círculos brancos pontilhadas destacar a área de fotoconversão, que é desprovido de fluorescência laranja / vermelho. (D, D ') Fusão de todos os três canais (verde, vermelho, vermelho-extremo), (E, E') canais vermelho e far-vermelhos e canais verde e vermelho-distante (F, F '). (A'-F ') setas brancas destacar a localização das células parapineal, que mostram verde, laranja fluorescente / vermelho e vermelho-distante. (AF ') A barra de escala é exibida no canto inferior direito de cada imagem.pload / 53604 / 53604fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Estágio | Número de volta | Lasers ativos |
| acquistion | 1 ciclo | 488 nm, 561 nm, 640 nm |
| Estimulação | 15 a 30 ciclos | 488 nm |
| Maturação | 1 minuto | # |
| acquistion | 1 ciclo | 488 nm, 561 nm, 640 nm |
Tabela 1: Condições para H2B-PSmOrange fotoconversão.
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Discussion
embriões transgénicos portadores de repórteres fluorescentes têm ajudado fundamentalmente para entender o desenvolvimento embrionário. No entanto, existe ainda a necessidade essencial de promotores de facilitar a visualização específica de estruturas particulares. Na sua ausência, os pesquisadores dependem de técnicas como a fotoconversão de proteínas fluorescentes para saber mais sobre a origem eo desenvolvimento de sua estrutura de interesse. Esta por sua vez é um pré-requisito fundamental para identificar os mecanismos moleculares envolvidos no seu desenvolvimento. Avanços técnicos no domínio peixe-zebra agora permitem substituir a FP em linhagens transgênicas com, por exemplo, proteínas photoconvertible usando uma batida mediada CRISPR-Cas9 na abordagem 14,15. No entanto, esta técnica é relativamente demorado e nem sempre bem sucedida. Em contraste, a aplicação de ubiquamente expressa H2B-PSmOrange em GFP e possivelmente outros fundos transgênicas é uma técnica simples e direta para seguir células através emdesenvolvimento bryonic.
Por exemplo, a origem do habenulae ventral peixe-zebra, uma parte de um sistema de condução neural conservada no diencéfalo dorsal dos vertebrados, tem sido difícil até recentemente e, portanto, nenhuma cascata genética subjacente seu desenvolvimento foi descoberto. Usando o sistema PSmOrange e análise de lapso de tempo de longo prazo para acompanhar células migratórias, podemos mostrar que, ao contrário dos núcleos habenular dorsais, que se originam esquerda e à direita ao lado da epífise, neurônios habenular ventral desenvolver posterior a esta região no tálamo 3. Este conhecimento permitiu-nos, em seguida, para identificar a função crucial do Wnt canônica sinalização gene a jusante TCF7L2 para ventral desenvolvimento neurônio habenular.
A aplicação do sistema PSmOrange photoconvertible é simples, rápido e tem a vantagem sobre proteínas photoactivatible embriões que podem ser seleccionados para expressão de proteína forte antes da iluminação. mR sintéticacodificação de NA para H2B-PSmOrange é injectado no embrião transgénico-GFP para expressar a proteína fluorescente ubiquamente laranja em todos os núcleos. Nós não encontrou quaisquer efeitos secundários após a injecção e a proteína é estável durante pelo menos 96 horas. A proteína é então photoconverted em células de GFP-transgénico na ROI usando um laser de excitação de 488 nm e o embrião pode ser analisado para a proteína fluorescente vermelha distante agora contendo as células dentro da subsequente aproximadamente 48 h. É crítico para monitorizar o sucesso como fotoconversão condições podem variar dependendo da fase de desenvolvimento do embrião e o tecido alvo. O software de imagem de microscópio adquire uma imagem de cada canal (verde, vermelho e vermelho-extremo) antes e depois fotoconversão. A eficiência fotoconversão pode ser avaliada medindo a intensidade de fluorescência média do ROI entre os diferentes canais antes e após fotoconversão. Se nenhuma fluorescência vermelha distante é detectada imediatamente após anúncio fotoconversãorodadas nal de fotoconversão tem que ser aplicado. GFP branqueamento é comum após fotoconversão. No entanto, a conversão contínua da proteína fluorescente transgénico ultrapassa este problema dentro de cerca de 2 horas.
Uma macro feito à medida para Fiji ImageJ para facilitar a identificação de células que co-expressam a proteína e o GFP photoconverted transgénico está disponível 3. estabelecimento futuro de linhas transgénicas estáveis expressando o H2B-PSmOrange irá simplificar ainda mais este procedimento. Ele também irá facilitar a análise dos eventos de desenvolvimento após 4 dias após a fertilização, que podem ter valor intrigante para pesquisar áreas como a regeneração dos tecidos. Além disso, a combinação de maternalmente expressando transgênicos PSmOrange e de imagem time-lapse 16 será uma ferramenta poderosa para investigar eventos migratórios célula inicial antes gastrulação em um nível única célula. Outras aplicações podem incluir a troca da marca nuclear H2B com, fou instância, GAP43 para visualizar membranas celulares e, potencialmente, axônios no embrião em desenvolvimento.
Uma limitação desta técnica é que a proteína zigótica só começa a ser expressa após a gastrulação e, por conseguinte, não é aplicável à análise de processos gastrulação. Ele também tem de ser considerado que é bastante difícil de photoconvert a proteína em células localizadas no fundo do embrião. configurações fotoconversão devem ser adaptados como o alto poder de laser e tempo de estimulação relativamente longo necessário para fotoconversão pode resultar em danos nos tecidos, o que exige um acompanhamento cuidadoso.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | |
| RNeasy MiniElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| Plastic Pasteur | alpha laboratories | LW4000 | |
| Original H2B-PSmOrange Plasmid | Addgene | 31920 | The plasmid described in the paper is available in the Carl lab |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | 5247 000.013 | |
| Forceps (5 Inox) | NeoLab | 2-1633 | |
| Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System | Nunc | 155382 | |
| Nikon A1R+ | Nikon GmbH Germany | No Number | |
| Nikon PLAN Apo λ 20X air objective | Nikon GmbH Germany | No Number | |
| NIS Elements AR Software (v. 4.30.02) | Nikon GmbH Germany/Laboratory Imaging | No Number |
References
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