Protocol
1. Н2В-PSmOrange мРНК In Vitro Транскрипция и мРНК Очистка
- Линеаризуем H2B-PSmOrange содержащий шт.2 + плазмиды с помощью фермента рестрикции NotI в соответствии с инструкциями изготовителя.
Примечание: Выполните следующие шаги, используя соответствующие средства защиты, такие как перчатки и халате, чтобы предотвратить загрязнение и деградацию мРНК. - Очищают линеаризованной ДНК с использованием набора для очистки или фенол-хлороформ методы, основанные ПЦР в соответствии с протоколами производителей.
- Используйте 1 мкг линеаризованной ДНК-матрицы для транскрипции Sp6-мРНК в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Удалить ДНК добавлением 1,0 U РНКазы DNAseI в течение 10-20 мин при 37 ° С.
- Очистка мРНК с использованием РНК очистки на комплект в соответствии с протоколом производителя.
- Для повышения чистоты мРНК и концентрации, осаждения мРНК путем добавления 6 мкл ацетата натрия (3,0 М, рН 5,2) и 150 мкл 96% этанола. Выдержите мixed раствор при -20 ° С в течение по меньшей мере 30 мин и до 24 ч.
- Собирают мРНК, вращая раствора при 18.407 х г в течение 45 мин при 4 ° С. Отменить жидкость и ресуспендируют мРНК в 150 мкл 70% этанола. Смешайте и центрифугировать раствор в течение дополнительных 15 мин при 4 ° С. Откажитесь от жидкости, сушить гранулы в течение 5 минут на льду и ресуспендируют мРНК в 20 мкл сверхчистой РНКазы свободной воды.
- Оценка концентрации и чистоты мРНК фотометрического измерения 1: мРНК разбавления 100 (мРНК 1 мкл в 99 мкл сверхчистой РНКазы свободной воды).
- Для кратковременного хранения, держать решение мРНК при -20 ° С. Для длительного хранения, держать мРНК при -80 ° С.
2. Н2В-PSmOrange мРНК микроинъекции в эмбрионы рыбок данио
- Настройка спаривания парах ночь перед инъекцией с использованием TG (Foxd3: GFP); TG (FLH: GFP) дважды трансгенных рыб (или любой другой GFP трансгенных рыб). Оставьте рыбу разделенных размещения распоркумежду ними, чтобы контролировать время спаривания.
- Удалить прокладку утром впрыска и пусть сопряжение рыбы в течение 20 мин.
- Во время спаривания, разбавить мРНК Н2В-PSmOrange к конечной концентрации 130 пг / нл (в РНКазы свободной воды) и передача 6 мкл раствора для инъекций в микроинъекции капилляра с использованием наконечника microloader. Проверьте объем впрыска с помощью калиброванного стекло. Отрегулируйте давление впрыска до придать 2 NL решение мРНК (260 PG).
- Сбор яйца в стерилизованные пластиковые чашки Петри, содержащей 1x эмбрионов (E3) среде.
- Передача от 20 до 30 эмбрионов с инъекционной чашки с помощью пластиковой пипетки Пастера.
- Вводят 2 NL мРНК, содержащие раствор в клетке или чуть ниже ячейки в желток на стадии одной клетки 11.
- Передача вводили эмбрионы в чашке Петри, содержащей 1x E3 среду, удалить неоплодотворенные или нет нормально развивающихся эмбрионов и выращивать их при 28 ° С.
Примечание: Светозащита Oе эмбрионов не требуется в течение всего эксперимента. - Повысить эмбрионов данио в 1x E3 среды и добавить 0,2 мм ПТУ (1-фенил-2 тиомочевины) после гаструляции ингибировать пигментацию. Изменение среды дважды в день, чтобы свести к минимуму опасность бактериальных загрязнений.
3. Эмбрион Вложение
- Выберите GFP (зеленый) и PSmOrange (оранжевый / красный) коэкспрессирующей эмбрионов с использованием бинокулярного микроскопа, снабженного флуоресценции лампы и соответствующие фильтры выбросов. Перенесите положительные эмбрионов в стерильной чашке Петри, содержащей 1x E3 среду.
- Dechorionate эмбрионы под стереомикроскопа с помощью щипцов 12.
- Передача одного эмбриона в 1,5 мл пробирку, содержащую 1,0 мл подогретого 1,0% агарозы низкой температурой (LMA), полученного в сверхчистой воды с помощью отключения пипетки (P200). Примечание: Нагреть LMA до 80 ° С и остыть в течение 3-5 минут при комнатной температуре, прежде чем вложение эмбрион.
- Передача эмбриона в 150 мкл LMA впатрон покровного стекла и отрегулировать ориентацию эмбриона, например спинной стороной вниз в эксперименте, описанном в перевернутом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии A1R + (или любого другого подходящего микроскопом), с помощью тонкой пластмассовый наконечник. Когда LMA полимеризуется, заполнить камеру с рыбой в воде, содержащей 0,2 мм ПТУ и 0,02% этил-3-аминобензойной метансульфонат (Tricaine) для анестезии.
- Перед визуализации образца, подождите 15 минут, чтобы выяснить влияние Tricaine. Анестезии предотвращает движения эмбрион, который можно контролировать с помощью стереомикроскопа, снабженного светлого освещения.
Примечание: Камеры могут быть повторно использованы в два раза.
4. PSmOrange фотоконверсии
- Поместите образец под микроскопом и конфокальной сканирования образца с указанием зоны, чтобы photoconvert использованием 488 нм и 561 нм лазеров для визуализации GFP и PSmOrange соответственно.
Примечание: Используйте перевернутую конфокальной лазерной сканирующей микроскопии A1R + на перевернутой ГНАGE TiEcontrolled с помощью программного обеспечения визуализации микроскопа и оснащены 488 нм, 561 нм и 640 нм лазеров для фотоконверсии и визуализации. Однако применение, конечно, не ограничено этим микроскопом тех пор, пока лазерные линии для преобразования и обработки изображений доступны.- Поместите цель 20X воздуха в месте (NA: 0,75; WD: 1.0 мм; угол обзора: 0,64 х 0,64 мм).
- Используйте следующие параметры микроскопа для обнаружения белка PSmOrange Перед фотоконверсии: 561 нм лазер, 0,74 мВт, измеренную при фокальной плоскости выше цели.
Примечание: Это соответствует 40% от этой системы (измерение в фокальной плоскости является единственным способом для определения эффективной мощности). Регулировка мощности лазера согласно экспериментальным потребностей как эффективность инъекций Н2В-PSmOrange может меняться. - Добавить факторы масштабирования, чтобы выделить интересующую область. Увеличениями сократить время получения изображений и, следовательно фототоксичности.
- Приобретать Z-стек, закрывающую структуруs интерес, используя 488 нм и 561 нм лазеров в последовательном режиме (режим линии 1-> 4). Закрепить Z-шаг между 1,0 и 2,0 мкм. Линия среднем и частота развертки может быть использован для оптимизации качества изображения.
- Сканирование образца и выберите интересующую область (ROI) инструмента, чтобы выделить область для photoconvert. Закрепить ROI как область стимуляции. Выберите модуль стока Активация / отбеливания, активировать 488 нм лазер, проверяя соответствующий флажок и установите 488 нм лазер до 80% (1 мВт мощности лазера, измеренный на цели). Установить скорость сканирования до 0,5 сек / кадр.
- Откройте фотопреобразования полезность (ND стимуляции) и задайте параметры фотоконверсии.
- Нажмите на команду "Добавить", чтобы указать протокол фотопреобразования.
- Набор "Фаза" 1 в меню "Приобретение / стимуляции» на «приобретение» и указать количество изображений, которые будут приобретены до фотоконверсии в меню "петли".
- Набор "Фаза" 2 "Stimulation "и ввести номер стимуляции событий должны быть выполнены.
- Регулировка "Фаза" 3, как описано для "Фаза" 1. Дополнительно, вставить ожидание "Фаза" после "Фаза" 2 при вводе времени, чтобы ждать до последнего раунда получения изображения.
- После того как все параметры заданы, применить настройку стимуляции и запустить фотоконверсии.
Примечание: Мощность лазера, частота сканирования и число итераций для каждого раунда фотоконверсии может варьироваться и отличаться от эмбриона эмбриона. Установка для запуска с показан в таблице 1.
- Приобретать окончательное Z-стек, используя 488 нм, 561 нм и 640 нм лазеров применения настроек, как указано выше. Установите 640 нм лазер для визуализации преобразованный PSmOrange используя высокую мощность лазера (до 4,5 мВт).
5. Демонтаж эмбрионов от LMA
- Удалить эмбрион, содержащий камеру с микроскопом. Осторожно снимите эмбрион из агарозного Uпеть щипцов.
- Передача эмбриона в новом стерилизуют пластиковой чашке Петри или в стерилизованную 6-луночного планшета, содержащего 1x E3 и 0,2 мм ПТУ. Инкубируйте эмбрион при 28 ° С до желаемой стадии развития.
6. Анализируя судьбу Photoconverted PSmOrange белковых клеток, экспрессирующих
- Re-внедрить эмбрион, как описано в пунктах 3.3 и 3.4.
- Поместите образец под микроскопом и конфокальной сканирования образца для идентификации photoconverted клетки (640 нм) при GFP трансгенной интересующей структуры (488 нм).
- Приобретать Z-стек, охватывающий структур, представляющих интерес с помощью 488 нм, 561 нм и 640 нм лазеров в последовательном режиме (режим линии 1-> 4). Закрепить Z-шаг между 1,0 и 2,0 мкм. Линия среднем и частота развертки может быть использован для оптимизации качества изображения.
- Используйте один из следующих методов для идентификации клеток, которые взаимодействуют экспресс GFP и photoconverted белок.
- На заказ автоматические Фиджи ИзображениеJ Макро 3
- Размывания оригинальная стека с помощью "GaussianBlur" плагин (→ Процесс → Фильтры → GaussianBlur) и вычесть гладкую стеки от оригинала с помощью "изображение калькулятора" плагин (→ Процесс → Калькулятор Изображение). Используйте этот шаг, чтобы визуализировать структуры интереса и уменьшить время вычислений для анализа.
- Применить определенные пороговые значения на зеленые и дальней красной каналов для того, чтобы подчеркнуть photoconverted клетки (→ Изображение → Настройка → Порог). Используйте "Анализ частиц" инструмент для обнаружения пороговых областей с подходящей настройкой (→ Анализ → Анализ частиц).
- Откройте "Изображение Калькулятор" плагин и отображения перекрывающихся трансформирования в зеленом и дальнего красного канала в желтом (→ Процесс → Image Calculator).
- ПО для обработки изображений микроскоп для оценки данных 3D
- Отображение стека в3D с помощью опции просмотра шоу громкости (→ 3D Визуализация меню → Том View). Используйте графический интерфейс для выбора зеленый, красный и дальнего красного каналов, регулировки яркости и контрастности и обрезать 3D стек, чтобы выделить photoconverted область (рисунок 1).
Примечание: Подобные методы анализа данных доступны в большинстве популярных программ для анализа изображений.
- Отображение стека в3D с помощью опции просмотра шоу громкости (→ 3D Визуализация меню → Том View). Используйте графический интерфейс для выбора зеленый, красный и дальнего красного каналов, регулировки яркости и контрастности и обрезать 3D стек, чтобы выделить photoconverted область (рисунок 1).
- На заказ автоматические Фиджи ИзображениеJ Макро 3
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 иллюстрирует пример системы PSmOrange фотопреобразования. Шишковидной Комплекс представляет собой консервативный структура в позвоночных спинной промежуточного мозга. Как и во многих других позвоночных, этот комплекс состоит из шишковидной органа в центре промежуточного мозга и parapineal клеток левосторонней. Элегантные, но трудоемкие uncaging эксперименты показали, что parapineal клетки происходят в передней части шишковидной органа 13. В ТГ (Foxd3: GFP); TG (FLH: GFP) трансгенные эмбрионы, как шишковидная и parapineal клетки помечены в процессе разработки. Для оценки пригодности системы PSmOrange мы использовали эти эмбрионы воспроизвести сообщалось шишковидной комплексное развитие. 260 мРНК, кодирующие пг ядерной форму PSmOrange, Н2В-PSmOrange, вводили в стадии одноклеточный двойных трансгенных эмбрионов для экспрессии белка во всех клеточных ядер. Введенные эмбрионы инкубировали при 28 ° С до тех пор, 24 ч после fertilizatион (ФВЧ), выбран для GFP и сильное выражение Н2В-PSmOrange и заливали в LMA в камерно системы покровного с спинной стороне, ориентированной на дне. Образец был помещен под перевернутой конфокальной лазерной сканирующей микроскопии под управлением специализированного программного визуализации микроскопа, оснащенного 488 нм, 561 нм и 640 нм лазеров и цели воздушной 20Х для фотоконверсии и отслеживания. Два сотовых кластеры в передней части эпифиза были photoconverted и сразу в образ (1А - F). В photoconverted клетки могут быть визуализированы с помощью 640 нм лазер (далеко красный - Рисунок 1С), но не с нм лазера 561 (оранжевый / красный - 1В). Выражение GFP в этих клетках изначально также снижается из-за фотообесцвечивания (Фигура 1А, 1D, 1F). На 52 HPF GFP и Н2В-PSmOrange был обнаружен в photoconverted Н2В-PSmOrange белковых клеток, экспрессирующих (рис 1A '- F'). Действительно, некоторые из этих клеток формируется parapineal на левой стороне мозга (стрелки на рисунке 1А '- F'). Этот результат согласуется с предыдущими сообщениями о parapineal клеток происхождения и показывает применимость метода PSmOrange в живом эмбрионов позвоночных.
. Рисунок 1. Определение parapineal клеток происхождение с использованием системы PSmOrange фотопреобразования в живых эмбрионов данио (А - F ') спинного просмотров с передней к вершине, ориентированной на спинной промежуточного мозга от Тс (Foxd3: GFP); TG (FLH: GFP) трансгенной эмбриона выделив шишковидной (P) и parapineal клетки (ПП) на (А - F) 26 HPF сразу после фотопреобразования и (А '- F & # 39;) 26 ч позже в 52 часов после оплодотворения. Эмбрион вводили мРНК, кодирующей H2B-PSmOrange. На снимках 3D реконструкции. Выражение (А, А ') трансгенной GFP, (B, B') не преобразуется H2B-PSmOrange (красный канал) и (C, C ') после фотопреобразования (дальнего красного канала). Белые пунктирные круги выделить область фотопреобразования, которая лишена оранжевой / красной флуоресценции. (D, D ') Объединить всех трех каналов (зеленый, красный, далеко красный), (Е, Е') красные и далеко красные каналы и (F, F ') зеленый и дальнего красного каналов. (Х-Р ') Белые стрел выделить расположение parapineal клеток, которые показывают зеленый, оранжевый / красный и далеко красную флуоресценцию. (AF ') Шкалы отображается в правом нижнем углу каждого изображения.pload / 53604 / 53604fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
| фаза | Количество Loop | Активные Лазеры |
| Acquistion | 1 цикл | 488 нм, 561 нм, 640 нм |
| Стимуляция | От 15 до 30 циклов | 488 нм |
| Созревание | 1 мин | # |
| Acquistion | 1 цикл | 488 нм, 561 нм, 640 нм |
Таблица 1: Условия Н2В-PSmOrange фотоконверсии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Трансгенные эмбрионы, несущие флуоресцентные журналистам помогли принципиально понять эмбриональное развитие. Тем не менее, есть еще насущную необходимость промоторов для облегчения конкретного визуализацию конкретных конструкций. В их отсутствие, исследователи опираются на методы, такие как фотопревращения флуоресцентных белков, чтобы узнать о происхождении и развитии их структуры, представляющей интерес. Это, в свою очередь, является важнейшей предпосылкой для выявления молекулярных механизмов, участвующих в его развитии. Технический прогресс в области данио теперь позволяют заменить FP в трансгенных линий с, например, photoconvertible белков с использованием CRISPR-cas9 опосредованного стук в подходе 14,15. Однако эта методика является относительно трудоемким и не всегда успешным. В противоположность этому, применение повсеместно экспрессируется H2B-PSmOrange в GFP и, возможно, другие трансгенные фоны является прямой вперед технику, чтобы следовать клетки через эмbryonic развитие.
Например, происхождение данио вентральной habenulae, одна часть системы консервативной нервной проводимости в спинной промежуточного мозга позвоночных, не было неуловимым до недавнего а значит никакого генетического каскада, лежащий в основе его развития не был раскрыт. Использование системы PSmOrange и долгосрочный анализ покадровой следовать мигрирующих клеток, мы могли бы показать, что в отличие от спинных habenular ядер, которые происходят слева и справа, прилегающих к эпифиза, брюшные habenular нейроны развиваются кзади от этого региона в таламус 3. Это знание позволило затем определить решающую функцию канонического Wnt сигнального гена вниз по течению TCF7L2 для вентральной развития habenular нейрона.
Применение photoconvertible системы PSmOrange является простым, быстрым и имеет преимущество над photoactivatible белков, что эмбрионы могут быть выбраны для сильной экспрессии белка перед освещением. Синтетический мРКодирование Н.А. для Н2В-PSmOrange вводится в GFP-трансгенной эмбриона повсеместно выразить оранжевый флуоресцентный белок во всех ядрах. Мы не обнаружил никаких побочных эффектов при инъекции, и белок является стабильным в течение по меньшей мере 96 часов. Затем белок photoconverted в GFP-трансгенной клетки в ROI использованием лазерного возбуждения 488 нм и эмбрион может быть проанализирован на ныне дальним красным флуоресцентным белком, содержащим клетки в последующем примерно 48 ч. Очень важно следить за успешную фотоконверсии качестве условия могут изменяться в зависимости от стадии развития эмбриона и ткани целевой. Программное обеспечение визуализации микроскопа получает изображение каждого канала (зеленый, красный и дальнего красного) до и после фотоконверсии. Эффективность фотопреобразования может быть оценена измерения средней интенсивности флуоресценции в ROI между различными каналами до и после фотоконверсии. Если нет дальней красной флуоресценции не обнаружено сразу после фотопреобразования объявлениемнительные раунды фотоконверсии должны применяться. GFP отбеливание является общим после фотоконверсии. Однако непрерывное перевод трансгенного флуоресцентного белка преодолевает эту проблему в течение примерно 2 ч.
Пользовательский сделал макрос Фиджи ImageJ, чтобы облегчить идентификацию клеток совместно выражающих photoconverted белок и трансгенная GFP доступно 3. Будущее установление стабильных трансгенных линий, выражающих H2B-PSmOrange будет еще больше упростить эту процедуру. Это также будет способствовать анализ событий развития через 4 дня после оплодотворения, которые могут иметь интригующее значение для исследования таких областях, как регенерация тканей. Кроме того, сочетание материнской выражающих PSmOrange трансгенов и покадровой визуализации 16 станет мощным инструментом для исследования клеточных мигрирующих события, начиная перед гаструляцией на одном уровне клетки. Дальнейшие приложения могут включать в себя обмен на Н2В ядерной тега с, Fили экземпляр, GAP43 визуализировать клеточные мембраны и потенциально аксоны в развивающемся эмбрионе.
Одним из ограничений этого метода является то, что зиготический белок только начинает быть выражены после гаструляции и поэтому не применяется к анализу гаструляции процессов. Он также должен быть рассмотрен, что это достаточно сложно, чтобы photoconvert белка в клетках, расположенных глубоко в эмбрионе. Настройки фотоконверсии должна быть адаптирована как высокая мощность лазера и относительно длительного времени, необходимого для стимуляции фотоконверсии может привести к повреждению тканей, что требует тщательного контроля.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | |
| RNeasy MiniElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| Plastic Pasteur | alpha laboratories | LW4000 | |
| Original H2B-PSmOrange Plasmid | Addgene | 31920 | The plasmid described in the paper is available in the Carl lab |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | 5247 000.013 | |
| Forceps (5 Inox) | NeoLab | 2-1633 | |
| Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System | Nunc | 155382 | |
| Nikon A1R+ | Nikon GmbH Germany | No Number | |
| Nikon PLAN Apo λ 20X air objective | Nikon GmbH Germany | No Number | |
| NIS Elements AR Software (v. 4.30.02) | Nikon GmbH Germany/Laboratory Imaging | No Number |
References
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (4350), (2012).
- Subach, O. M., et al. A photoswitchable orange-to-far-red fluorescent protein, PSmOrange. Nature Methods. 8, 771-777 (2011).
- Beretta, C. A., Dross, N., Bankhead, P., Carl, M. The ventral habenulae of zebrafish develop in prosomere 2 dependent on Tcf7l2 function. Neural Development. 8, 19 (2013).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 12651-12656 (2002).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3, e3944 (2008).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6, 131-133 (2009).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2, 2024-2032 (2007).
- Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature Methods. 6, 153-159 (2009).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297, 1873-1877 (2002).
- Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. J Am Chem Soc. 132, 6481-6491 (2010).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5150/zebrafish-breeding-and-embryo-handling (2015).
- Concha, M. L., et al. Local tissue interactions across the dorsal midline of the forebrain establish CNS laterality. Neuron. 39, 423-438 (2003).
- Auer, T. O., Duroure, K., Concordet, J. P., Del Bene, F. CRISPR/Cas9-mediated conversion of eGFP- into Gal4-transgenic lines in zebrafish. Nature Protocols. 9, 2823-2840 (2014).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24, 142-153 (2014).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
