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Developmental Biology

GFP ट्रांसजेनिक Zebrafish Photoconvertible PSmOrange प्रणाली का प्रयोग में कोशिकाओं की ट्रैकिंग

Published: February 5, 2016 doi: 10.3791/53604
Automatic Translation
1,2,3, 2, 2, 1
1Medical Faculty Mannheim, Department of Cell and Molecular Biology, Heidelberg University, 2COS and Nikon Imaging Center at the University of Heidelberg, Heidelberg University, 3Excellenzcluster CellNetworks, University of Heidelberg

Protocol

1. H2B-PSmOrange mRNA इन विट्रो प्रतिलेखन और mRNA शोधन

  1. H2B-PSmOrange चना प्रतिबंध निर्माता के निर्देशों के अनुसार एंजाइम का उपयोग pCS2 + प्लाज्मिड युक्त Linearize।
    नोट: इस तरह के दस्ताने और प्रयोगशाला कोट के रूप में उपयुक्त सुरक्षा का उपयोग कर mRNA प्रदूषण और गिरावट को रोकने के लिए अगले चरणों का प्रदर्शन।
  2. linearized डीएनए 'निर्माताओं प्रोटोकॉल के अनुसार एक पीसीआर शुद्धि किट या फिनोल के क्लोरोफॉर्म आधारित तरीकों का उपयोग कर शुद्ध।
  3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार sp6-mRNA प्रतिलेखन के लिए linearized टेम्पलेट डीएनए की 1 ग्राम का प्रयोग करें।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 10-20 मिनट के लिए 1.0 यू RNase मुक्त DNaseI जोड़कर डीएनए निकालें।
  5. एक आरएनए निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार किट का उपयोग कर साफ mRNA को साफ करो।
  6. mRNA पवित्रता और एकाग्रता बढ़ाने के लिए, 6 μl सोडियम एसीटेट (3.0 मीटर, पीएच 5.2) और 150 μl 96% इथेनॉल जोड़कर mRNA वेग। एम सेतेकम से कम 30 मिनट के लिए और 24 घंटा के लिए ऊपर -20 डिग्री सेल्सियस पर ixed समाधान।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए १८.४०७ XG पर समाधान कताई द्वारा mRNA लीजिए। तरल त्यागें और 150 μl 70% इथेनॉल में mRNA resuspend। मिक्स और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त 15 मिनट के लिए समाधान अपकेंद्रित्र। तरल त्यागें, बर्फ पर 5 मिनट के लिए गोली सूखी और 20 μl ultrapure RNase मुक्त पानी में mRNA resuspend।
  8. 100 mRNA कमजोर पड़ने (99 μl ultrapure RNase मुक्त पानी में 1 μl mRNA): एक 1 की भामिति माप से एकाग्रता और mRNA की पवित्रता का आकलन करें।
  9. छोटी अवधि के भंडारण के लिए, -20 डिग्री सेल्सियस पर mRNA समाधान रखें। लंबी अवधि के भंडारण के लिए, -80 डिग्री सेल्सियस पर mRNA रहते हैं।

2. H2B-PSmOrange mRNA Zebrafish भ्रूण में microinjection

  1. जोड़े टीजी का उपयोग कर इंजेक्शन से पहले रात संभोग सेट अप (foxD3: GFP); टीजी (FLH: GFP) डबल ट्रांसजेनिक मछली (या किसी भी अन्य GFP ट्रांसजेनिक मछली)। मछली एक स्पेसर रखकर अलग छोड़ दोउन दोनों के बीच संभोग के समय को नियंत्रित करने के लिए।
  2. इंजेक्शन की सुबह में स्पेसर निकालें और 20 मिनट के लिए मछली दोस्त करते हैं।
  3. समय संभोग के दौरान, 130 स्नातकोत्तर के अंतिम एकाग्रता के लिए H2B-PSmOrange mRNA पतला / nl और एक microloader टिप का उपयोग कर एक microinjection केशिका में हस्तांतरण 6 μl इंजेक्शन समाधान (RNase मुक्त पानी में)। एक calibrated गिलास स्लाइड के साथ इंजेक्शन की मात्रा की जाँच करें। 2 nl mRNA समाधान (260 पीजी) इंजेक्षन करने के लिए इंजेक्शन के दबाव को समायोजित करें।
  4. 1x भ्रूण (E3) मध्यम युक्त एक निष्फल प्लास्टिक पेट्री डिश में अंडे ले लीजिए।
  5. एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर एक इंजेक्शन डिश के लिए 20 से 30 भ्रूण स्थानांतरण।
  6. 2 nl एक सेल चरण में 11 जर्दी में सेल में या बस के नीचे सेल समाधान युक्त mRNA इंजेक्षन।
  7. 1x E3 के माध्यम से युक्त एक पेट्री डिश में इंजेक्शन भ्रूण स्थानांतरण, unfertilized या नहीं सामान्य रूप से विकसित भ्रूण को हटाने और उन्हें 28 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ता है।
    नोट: प्रकाश संरक्षण ओभ्रूण च प्रयोग के दौरान की आवश्यकता नहीं है।
  8. 1x E3 के माध्यम में zebrafish भ्रूण उठाएँ और रंजकता को बाधित करने के बाद gastrulation 0.2 मिमी पीटीयू (1-फिनाइल-2- Thiourea) जोड़ें। बैक्टीरियल संदूषण के खतरे को कम करने के लिए प्रति दिन दो बार मध्यम बदलें।

3. भ्रूण एम्बेडिंग

  1. GFP (हरा) और PSmOrange (नारंगी / लाल) सह व्यक्त एक दूरबीन एक प्रतिदीप्ति दीपक और उचित उत्सर्जन फिल्टर के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग भ्रूण का चयन करें। 1x E3 के माध्यम से युक्त एक बाँझ पेट्री डिश में सकारात्मक भ्रूण स्थानांतरण।
  2. एक stereomicroscope संदंश का उपयोग कर 12 के तहत Dechorionate भ्रूण।
  3. स्थानांतरण के 1.0 मिलीग्राम से युक्त एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में एक भ्रूण पूर्व गर्म 1.0% कम पिघलने agarose (LMA) एक कट-टिप पिपेट (P200) का उपयोग करके ultrapure पानी में तैयार किया। नोट: 80 डिग्री सेल्सियस तक गर्म LMA और भ्रूण embedding से पहले आरटी पर 3-5 मिनट के लिए शांत हो जाओ।
  4. एक में 150 μl LMA में भ्रूण स्थानांतरणcoverglass संभाग और, प्रयोग उल्टे लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग A1R + (या किसी भी अन्य उपयुक्त माइक्रोस्कोप) के लिए वर्णित में नीचे भ्रूण के उन्मुखीकरण, जैसे पृष्ठीय पक्ष को समायोजित ठीक एक प्लास्टिक की टिप का उपयोग कर। जब LMA polymerized है, संज्ञाहरण के लिए 0.2 मिमी पीटीयू और 0.02% एथिल 3-aminobenzoate methansulfonate (Tricaine) से युक्त मछली पानी के साथ चैम्बर भरें।
  5. नमूना इमेजिंग से पहले, Tricaine के प्रभाव का पता लगाने के लिए 15 मिनट तक प्रतीक्षा करें। संज्ञाहरण भ्रूण आंदोलनों, जो brightfield रोशनी से लैस एक stereomicroscope का उपयोग नजर रखी जा सकती रोकता है।
    नोट: कक्षों में दो बार पुन: उपयोग किया जा सकता है।

4. PSmOrange photoconversion

  1. confocal खुर्दबीन के नीचे नमूना प्लेस और नमूना स्कैन क्षेत्र की पहचान करने के लिए क्रमश: 488 एनएम और GFP और PSmOrange इमेजिंग के लिए 561 एनएम लेजर का उपयोग करने के लिए photoconvert।
    नोट: उल्टे स्टेशन पर उल्टे लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग A1R + उपयोगमाइक्रोस्कोप इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा जीई TiEcontrolled और 488 एनएम, 561 एनएम और photoconversion और इमेजिंग के लिए 640 एनएम लेज़रों के साथ सुसज्जित है। हालांकि, आवेदन निश्चित रूप में लंबे समय के रूप में रूपांतरण और इमेजिंग के लिए लेजर लाइनों उपलब्ध हैं इस माइक्रोस्कोप के लिए ही सीमित नहीं है।
    1. जगह में 20X हवा उद्देश्य रखो (एनए: 0.75; WD: 1.0 मिमी, FOV: 0.64 x 0.64 मिमी)।
    2. photoconversion पहले PSmOrange प्रोटीन का पता लगाने के लिए निम्न माइक्रोस्कोप सेटिंग्स का उपयोग करें: 561 एनएम लेजर, 0.74 मेगावाट उद्देश्य से ऊपर फोकस विमान में मापा जाता है।
      नोट: यह इस सिस्टम पर 40% से मेल खाती है (ध्यान विमान में मापने प्रभावी शक्ति निर्धारित करने के लिए एक ही रास्ता है)। H2B-PSmOrange इंजेक्शन की दक्षता में भिन्न हो सकते हैं के रूप में प्रयोगात्मक जरूरतों के हिसाब से लेजर शक्ति को समायोजित करें।
    3. जूम कारकों हित के क्षेत्र को उजागर करने के लिए जोड़ें। उच्चतर आवर्धन छवि अधिग्रहण के समय और इसलिए phototoxicity कम।
  2. मोल एक z ढेर संरचना को कवर488 एनएम और अनुक्रमिक मोड (लाइन मोड 1-> 4) में 561 एनएम लेजर का उपयोग ब्याज की है। 1.0 और 2.0 माइक्रोन के बीच z कदम को ठीक करें। रेखा औसत और आवृत्ति स्कैन छवि गुणवत्ता का अनुकूलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  3. नमूना स्कैन और ब्याज (आरओआई) उपकरण के क्षेत्र का चयन करने के लिए क्षेत्र photoconvert पर प्रकाश डाला। उत्तेजना क्षेत्र के रूप में रॉय को ठीक करें। फोटो एक्टिवेशन / ब्लीचिंग मॉड्यूल का चयन करें, संबंधित बॉक्स को चेक करके 488 एनएम लेजर को सक्रिय करने और 80% (1 मेगावाट बिजली लेजर उद्देश्य पर मापा जाता है) के लिए 488 एनएम लेजर निर्धारित किया है। 0.5 सेकंड / फ्रेम करने के लिए स्कैन गति सेट करें।
  4. photoconversion उपयोगिता (एनडी उत्तेजना) खोलें और photoconversion सेटिंग्स निर्दिष्ट करें।
    1. photoconversion प्रोटोकॉल निर्दिष्ट करने के लिए "जोड़ें" आदेश पर क्लिक करें।
    2. "अधिग्रहण / उत्तेजना" मेनू पर "अधिग्रहण" में "चरण" 1 सेट और छवियों की संख्या से संकेत मिलता है "छोरों" मेनू में photoconversion से पहले अधिग्रहण किया जाना है।
    3. "सेंट करने के लिए सेट" चरण "2imulation "और उत्तेजना की घटनाओं की संख्या दर्ज प्रदर्शन किया जाएगा।
    4. समायोजित करें "चरण" के रूप में 3 के लिए "चरण" 1. वैकल्पिक रूप से वर्णित है, "चरण" 2 समय छवि अधिग्रहण के अंतिम दौर से पहले इंतजार करने के बाद दर्ज करके एक प्रतीक्षा "चरण" डालें।
    5. एक बार जब सभी मापदंडों सेट कर रहे हैं, उत्तेजना सेटिंग लागू करते हैं और photoconversion चलाते हैं।
      नोट: लेजर शक्ति, स्कैनिंग और पुनरावृत्तियों की संख्या photoconversion भिन्न हो सकते हैं के प्रत्येक दौर के लिए की आवृत्ति और भ्रूण को भ्रूण से भिन्न होते हैं। स्थापना के साथ तालिका 1 में दिखाया गया है शुरू करने के लिए।
  5. एक अंतिम Z ढेर 488 एनएम, 561 एनएम और 640 एनएम के रूप में ऊपर सेटिंग्स को लागू करने लेसरों का उपयोग मोल। (4.5 मेगावाट तक) परिवर्तित PSmOrange उच्च लेजर शक्ति का उपयोग कर कल्पना करने के लिए 640 एनएम लेजर सेट करें।

5. LMA से उतरो भ्रूण

  1. माइक्रोस्कोप से चैम्बर युक्त भ्रूण निकालें। ध्यान agarose यू से भ्रूण को हटा देंसंदंश गाते हैं।
  2. एक नया निष्फल प्लास्टिक पेट्री डिश में या एक निष्फल 6 अच्छी तरह से थाली 1x E3 और 0.2 मिमी पीटीयू युक्त में भ्रूण स्थानांतरण। विकास के वांछित स्तर तक 28 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण सेते हैं।

6. Photoconverted PSmOrange प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं के भाग्य का विश्लेषण

  1. भ्रूण पुनः एम्बेड 3.3 और 3.4 अंक के तहत वर्णित है।
  2. confocal खुर्दबीन के नीचे नमूना प्लेस और नमूना स्कैन ब्याज (488 एनएम) के GFP ट्रांसजेनिक संरचना में photoconverted कोशिकाओं (640 एनएम) की पहचान करने के लिए।
  3. एक z ढेर 488 एनएम, 561 एनएम और अनुक्रमिक मोड (लाइन मोड 1-> 4) में 640 एनएम लेजर का उपयोग ब्याज की संरचनाओं को कवर मोल। 1.0 और 2.0 माइक्रोन के बीच z कदम को ठीक करें। रेखा औसत और आवृत्ति स्कैन छवि गुणवत्ता का अनुकूलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  4. निम्न विधियों का उपयोग करें, कोशिकाओं की पहचान करने के लिए जो सह एक्सप्रेस GFP और photoconverted प्रोटीन।
    1. कस्टम मेड स्वत: फिजी छविजम्मू मैक्रो 3
      1. Convolve मूल ढेर "GaussianBlur" प्लगइन का उपयोग (→ प्रक्रिया → फिल्टर → GaussianBlur) और "छवि कैलक्यूलेटर" प्लगइन (→ प्रक्रिया → छवि कैलक्यूलेटर) का उपयोग कर मूल से चिकनी ढेर घटाना। ब्याज की संरचनाओं कल्पना और विश्लेषण के लिए कम्प्यूटेशनल समय को कम करने के लिए यह कदम का प्रयोग करें।
      2. आदेश photoconverted कोशिकाओं को उजागर करने में हरे और दूर लाल चैनलों के लिए विशिष्ट थ्रेसहोल्ड लागू करें (→ छवि → → दहलीज समायोजित)। एक उपयुक्त सेटिंग के साथ सीमा क्षेत्रों का पता लगाने के लिए "विश्लेषण कण" उपकरण का उपयोग करें (→ → विश्लेषण विश्लेषण कण)।
      3. "छवि कैलक्यूलेटर" प्लगइन खोलें और पीला (→ प्रक्रिया → छवि कैलक्यूलेटर) में हरे और दूर लाल चैनल में ओवरलैपिंग ROIs प्रदर्शित करते हैं।
    2. 3 डी डेटा मूल्यांकन के लिए माइक्रोस्कोप इमेजिंग सॉफ्टवेयर
      1. में ढेर प्रदर्शन3 डी शो मात्रा देखें विकल्प (→ 3 डी दृश्य मेनू → शो खंड देखें) का उपयोग। , हरे, लाल और दूर लाल चैनलों का चयन चमक और विपरीत समायोजित करने और 3 डी photoconverted क्षेत्र (चित्रा 1) को उजागर करने के लिए ढेर फसल के लिए ग्राफिक इंटरफ़ेस का उपयोग करें।
        नोट: डेटा का विश्लेषण करने छवि विश्लेषण के लिए आम सॉफ्टवेयर के अधिकांश में उपलब्ध हैं इसी तरह के तरीकों।

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Representative Results

चित्रा 1 PSmOrange photoconversion प्रणाली का एक उदाहरण दिखाता है। चीटीदार जटिल कशेरुकी पृष्ठीय diencephalon में एक संरक्षित संरचना है। कई अन्य रीढ़ में की तरह, इस जटिल diencephalon और बाईं तरफा parapineal कोशिकाओं के केंद्र में चीटीदार अंग होते हैं। सुरुचिपूर्ण लेकिन समय लेने वाली uncaging प्रयोगों से पता चला है कि parapineal कोशिकाओं चीटीदार अंग 13 के पूर्वकाल भाग में आरंभ। टीजी में (foxD3: GFP); टीजी (FLH: GFP) ट्रांसजेनिक भ्रूण, दोनों चीटीदार और parapineal कोशिकाओं के विकास के दौरान चिह्नित कर रहे हैं। PSmOrange प्रणाली की उपयुक्तता का मूल्यांकन करने के लिए हम सूचना चीटीदार जटिल विकास को पुन: पेश करने के लिए इन भ्रूण का इस्तेमाल किया। 260 पीजी PSmOrange, H2B-PSmOrange के परमाणु प्रपत्र एन्कोडिंग mRNA, एक सेल चरण डबल ट्रांसजेनिक भ्रूण में इंजेक्ट किया गया था सभी सेल नाभिक में प्रोटीन व्यक्त करने के लिए। इंजेक्शन भ्रूण तक 24 घंटे बाद fertilizat 28 डिग्री सेल्सियस पर incubated रहे थेआयन (HPF), GFP और मजबूत H2B-PSmOrange अभिव्यक्ति के लिए चुने गए और नीचे की ओर उन्मुख पृष्ठीय पक्ष के साथ एक संभाग coverslip प्रणाली में LMA में एम्बेडेड। नमूना एक औंधा लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग माइक्रोस्कोप इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित और 488 एनएम, 561 एनएम और 640 एनएम लेजर और photoconversion और ट्रैकिंग के लिए एक 20X हवा उद्देश्य के साथ सुसज्जित के तहत रखा गया था। चीटीदार का अग्र भाग में दो सेल समूहों photoconverted रहे थे और तुरंत imaged (चित्रा 1 ए - एफ)। Photoconverted कोशिकाओं 640 एनएम लेजर (दूर लाल - चित्रा 1 सी) का उपयोग करते हुए देखे जा सकते हैं, लेकिन नहीं 561 एनएम लेजर के साथ (नारंगी / लाल - चित्रा 1 बी)। इन कोशिकाओं में GFP अभिव्यक्ति शुरू में भी कारण photobleaching (चित्रा 1 ए, 1 डी, 1F) के लिए कम हो गया था। 52 HPF पर GFP और H2B-PSmOrange photoconverted H2B-PSmOrange प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं में पाया गया था (चित्रा 1 ए '- एफ')। दरअसल, इन कोशिकाओं के कुछ ही मस्तिष्क के बाईं ओर parapineal का गठन (चित्रा 1 ए में तीर '- एफ')। यह परिणाम parapineal सेल मूल पर पिछली रिपोर्टों के अनुरूप है और रहने वाले कशेरुकी भ्रूण में PSmOrange तकनीक के लागू चलता।

आकृति 1
। चित्रा 1. parapineal सेल मूल पहचान zebrafish भ्रूण जीने में PSmOrange photoconversion प्रणाली का उपयोग (ए - एफ ') एक टीजी के पृष्ठीय diencephalon पर ध्यान केंद्रित करने के लिए शीर्ष पूर्वकाल के साथ पृष्ठीय दृश्य (foxD3: GFP); टीजी (FLH: GFP) ट्रांसजेनिक भ्रूण में चीटीदार (पी) और parapineal कोशिकाओं (पीपी) पर प्रकाश डाला (ए - एफ) 26 HPF के तुरंत बाद photoconversion और (ए '- F & # 39;) 26 घंटा के बाद में 52 HPF पर। भ्रूण mRNA एन्कोडिंग H2B-PSmOrange इंजेक्शन के साथ किया गया था। तस्वीरें दिखा 3D पुनर्निर्माण। (ए, ए ') ट्रांसजेनिक GFP, (बी, बी') की अभिव्यक्ति नहीं photoconversion (दूर लाल चैनल) के बाद H2B-PSmOrange (लाल चैनल) और (सी, सी ') में बदल दिया। सफेद बिंदीदार हलकों photoconversion का क्षेत्र है, जो नारंगी / लाल प्रतिदीप्ति से रहित है पर प्रकाश डाला। (डी, डी ') सभी तीन चैनलों के मर्ज (हरे, लाल, दूर लाल), (ई, ई') लाल और दूर लाल चैनलों और (एफ, एफ '), हरे और दूर लाल चैनल। (A'- एफ ') सफेद तीर parapineal कोशिकाओं है, जो हरे, नारंगी / लाल और दूर लाल प्रतिदीप्ति दिखाने के स्थान पर प्रकाश डाला। (वायुसेना) पैमाने पर पट्टी प्रत्येक छवि के ठीक नीचे कोने पर प्रदर्शित होता है।पलोड करें / 53,604 / 53604fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अवस्था लूप की संख्या सक्रिय लेजर
acquistion 1 चक्र 488 एनएम, 561 एनएम, 640 एनएम
उत्तेजना 15 से 30 चक्र 488 एनएम
परिपक्वता 1 मिनट #
acquistion 1 चक्र 488 एनएम, 561 एनएम, 640 एनएम

तालिका 1: H2B-PSmOrange photoconversion के लिए शर्तें।

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Discussion

ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट संवाददाताओं को ले जाने भ्रूण भ्रूण के विकास को समझने के लिए मौलिक रूप से मदद की है। हालांकि, अब भी प्रमोटरों के लिए अनिवार्य आवश्यकता विशेष संरचनाओं के विशेष दृश्य की सुविधा के लिए है। उनकी अनुपस्थिति में, शोधकर्ताओं ने मूल और ब्याज के अपने संरचना के विकास के बारे में पता लगाने के लिए इस तरह के फ्लोरोसेंट प्रोटीन की photoconversion के रूप में तकनीक पर भरोसा करते हैं। यह बदले में एक महत्वपूर्ण शर्त आणविक इसके विकास में शामिल तंत्र की पहचान है। Zebrafish क्षेत्र में तकनीकी प्रगति के साथ अब ट्रांसजेनिक लाइनों, उदाहरण के लिए, photoconvertible प्रोटीन दृष्टिकोण 14,15 में एक CRISPR-Cas9 मध्यस्थता पारी का उपयोग करने में एफपी को बदलने के लिए अनुमति देते हैं। हालांकि, इस तकनीक अपेक्षाकृत समय लेने वाली और हमेशा सफल नहीं है। इसके विपरीत, सर्वत्र के आवेदन GFP में H2B-PSmOrange और संभवतः अन्य ट्रांसजेनिक पृष्ठभूमि में व्यक्त एक सीधे आगे उन्हें तकनीक के माध्यम से कोशिकाओं का पालन करने के लिए हैbryonic विकास।

उदाहरण के लिए, zebrafish उदर habenulae की उत्पत्ति, रीढ़ की पृष्ठीय diencephalon में एक संरक्षित तंत्रिका चालन प्रणाली का एक हिस्सा है, हाल ही में और इसलिए कोई आनुवंशिक झरना इसके विकास अंतर्निहित का पर्दाफाश किया गया था जब तक मायावी किया गया है। PSmOrange प्रणाली और लंबी अवधि के समय व्यतीत हो जाने के विश्लेषण का उपयोग पलायन कोशिकाओं का पालन करने के लिए, हम दिखा सकता है कि पृष्ठीय habenular नाभिक है, जो छोड़ दिया और सही करने के लिए आसन्न एपिफ़ीसिस उत्पन्न विपरीत, उदर habenular न्यूरॉन्स पीछे इस क्षेत्र के लिए चेतक 3 में विकसित करना। यह ज्ञान हमें तो विहित Wnt उदर habenular न्यूरॉन विकास के लिए नीचे की ओर जीन TCF7L2 संकेत के महत्वपूर्ण कार्य की पहचान करने की अनुमति दी।

photoconvertible PSmOrange प्रणाली के आवेदन सरल, तेज है और photoactivatible प्रोटीन है कि भ्रूण रोशनी से पहले मजबूत प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए चुना जा सकता है अधिक लाभ है। सिंथेटिक श्रीH2B-PSmOrange के लिए na एन्कोडिंग GFP ट्रांसजेनिक भ्रूण में इंजेक्ट किया जाता है सर्वत्र सभी नाभिक में नारंगी फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए। हम इंजेक्शन पर किसी भी पक्ष प्रभाव सामना नहीं किया है और प्रोटीन कम से कम 96 घंटे के लिए स्थिर है। प्रोटीन तो एक 488 एनएम उत्तेजना लेजर का उपयोग करते हुए रॉय में GFP ट्रांसजेनिक कोशिकाओं में photoconverted है और भ्रूण अब दूर लाल फ्लोरोसेंट बाद लगभग 48 घंटे के भीतर कोशिकाओं से युक्त प्रोटीन के लिए विश्लेषण किया जा सकता है। यह सफल photoconversion की स्थिति भ्रूण के विकास के चरण और ऊतकों को लक्षित के आधार पर भिन्न हो सकते हैं के रूप में नजर रखने के लिए महत्वपूर्ण है। माइक्रोस्कोप इमेजिंग सॉफ्टवेयर से पहले और photoconversion के बाद प्रत्येक चैनल (हरे, लाल और दूर लाल) की एक छवि प्राप्त कर लेता है। photoconversion दक्षता से पहले और photoconversion के बाद विभिन्न चैनलों के बीच में रॉय मतलब तीव्रता प्रतिदीप्ति मापने का मूल्यांकन किया जा सकता है। कोई दूर लाल प्रतिदीप्ति photoconversion विज्ञापन के तुरंत बाद पता चला हैphotoconversion की पारंपरिक दौर से लागू किया जाना है। GFP विरंजन photoconversion के बाद आम है। हालांकि, ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन की सतत अनुवाद के बारे में 2 घंटा के भीतर इस समस्या पर काबू पा।

फिजी ImageJ के लिए एक कस्टम बनाया मैक्रो कोशिकाओं photoconverted प्रोटीन सह व्यक्त और ट्रांसजेनिक GFP उपलब्ध 3 की पहचान को कम करने के लिए। स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनों H2B-PSmOrange व्यक्त आगे इस प्रक्रिया सरल होगा का भविष्य स्थापना। यह भी 4 दिनों के बाद निषेचन के बाद विकास की घटनाओं, जो ऊतक उत्थान जैसे क्षेत्रों में शोध करने के लिए पेचीदा हो सकता है मूल्य के विश्लेषण की सुविधा होगी। इसके अलावा, माता के रूप में व्यक्त PSmOrange ट्रांसजेनिक्स और समय चूक इमेजिंग 16 के संयोजन सेल प्रवासी एक एकल कोशिका के स्तर पर gastrulation से पहले शुरू करने की घटनाओं की जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण होगा। इसके अलावा आवेदन पत्र के साथ, एफ H2B परमाणु टैग के आदान-प्रदान शामिल हो सकते हैंया उदाहरण के लिए, GAP43 विकासशील भ्रूण में कोशिका झिल्ली और संभावित एक्सोन कल्पना करने के लिए।

इस तकनीक की एक सीमा है कि युग्मज प्रोटीन केवल gastrulation के बाद व्यक्त किया जा करने के लिए शुरू होता है और इसलिए gastrulation प्रक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए लागू नहीं है। यह भी कि यह भ्रूण में गहरी स्थित कोशिकाओं में प्रोटीन photoconvert करने के लिए जगह मुश्किल है पर विचार किया गया है। Photoconversion सेटिंग्स उच्च लेजर शक्ति और अपेक्षाकृत लंबे समय उत्तेजना photoconversion ऊतकों को नुकसान है, जो सावधान निगरानी की आवश्यकता है में परिणाम हो सकता है के लिए आवश्यक के रूप में रूपांतरित किया जाना चाहिए।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
PCR Purification Kit Qiagen 28104
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit Ambion AM1340
RNeasy MiniElute Cleanup kit Qiagen 74204
Plastic Pasteur alpha laboratories LW4000
Original H2B-PSmOrange Plasmid Addgene 31920 The plasmid described in the paper is available in the Carl lab
FemtoJet Microinjector Eppendorf 5247 000.013
Forceps (5 Inox) NeoLab 2-1633
Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System  Nunc 155382
Nikon A1R+ Nikon GmbH Germany No Number
Nikon PLAN Apo λ 20X air objective  Nikon GmbH Germany No Number
NIS Elements AR Software (v. 4.30.02) Nikon GmbH Germany/Laboratory Imaging No Number

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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विकास जीवविज्ञान अंक 108 zebrafish चीटीदार photoconversion सेल ट्रैकिंग PSmOrange प्रतिदीप्ति इमेजिंग CLSM, विकास
GFP ट्रांसजेनिक Zebrafish Photoconvertible PSmOrange प्रणाली का प्रयोग में कोशिकाओं की ट्रैकिंग
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Beretta, C. A., Dross, N., Engel,… More

Beretta, C. A., Dross, N., Engel, U., Carl, M. Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System. J. Vis. Exp. (108), e53604, doi:10.3791/53604 (2016).

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