Summary
Мы опишем набор протоколов , которые вместе обеспечивают ткани имитирующие гидрогеля bioink , с которой функциональные и жизнеспособные конструкции 3-D ткани могут быть bioprinted для использования в приложениях скрининга в пробирке.
Introduction
В последние годы целый ряд технологий, стали доступны, что устраняет необходимость в альтернативных источниках функциональных органов и тканей, стремясь к производству, или biofabricate, их. Bioprinting стала одним из наиболее перспективных из этих технологий. Bioprinting можно рассматривать как форму роботизированного производства присадок биологических частей, которые могут быть использованы для создания или образец жизнеспособными органный или подобные ткани структуры в 3 -х измерениях. 1 В большинстве случаев bioprinting использует 3-мерный (3 -D) печатающее устройство, которое направлено на компьютер для осаждения клеток и биоматериалов в точные позиции, тем самым обобщал анатомически имитирующие физиологические архитектуры. 2 Эти устройства печати "bioink", который может принимать форму агрегатов клеток, клетки , инкапсулированные в гидрогели или вязких жидкостей, а также клеточные посеяны микроносителей, а также свободные от клеток полимеры, которые обеспечивают механическую структуру или выступают в качестве бесклеточной PLAceholders. 3,4 После процесса bioprinting, в результате структура может быть созревший в функциональные ткани или органа структур, а также используется для предполагаемого конечного применения. 5,6 На сегодняшний день полный полностью функциональный размером с человека орган не был напечатан, но она остается основным долгосрочным цель bioprinting исследований и разработок. 2 Тем не менее, мелкие "Органоид" конструкты ткани в настоящее время реализуются в ряде приложений, включая моделирование патологии, разработки лекарственных средств и токсикологии скрининга.
Одним из главных препятствий, которые исследователи столкнулись при применении технологии bioprinting является то, что очень немногие материалы были разработаны для явной целью bioprinting. Для эффективного успеха в bioprinting, биоматериал должен соответствовать 4 основным требованиям. Биоматериал должен иметь 1) соответствующие механические свойства, чтобы позволить осаждение (будь то экструзии через сопло в виде геля или двутавровойnkjet как капли), 2) способность удерживать свою форму в качестве компонента структуры 3-D после осаждения, 3) возможность для управления пользователем из 2-х предыдущих характеристик, и 4) клеток дружественной и благоприятной окружающей среды на всех этапы процедуры bioprinting. 7 Исторически bioprinting работы часто пытались использовать существующие традиционные биоматериалов в bioprinting устройств без учета их совместимости, а не проектирования биоматериал , чтобы иметь свойства , необходимые для bioprinting и последующих заявок после печати.
Разнообразие bioinks Недавно были разработаны для лучшего взаимодействия с аппаратными средствами осаждения и изготовления. Стандартные системы гидрогелевые создают серьезные проблемы, поскольку они обычно существуют либо как предшественника жидкости решения с недостаточными механическими свойствами, или полимеризуется гидрогели, что если напечатанных может засорить сопла или стать распались на процессе экструзии. Наша команда, а также флористикуР.С., исследовали различные гидрогелевые составы для решения этих проблем bioprinting, в том числе клеток сфероида печати в гидрогелевых субстратов, 5,8 клеток и гидрогель нити экструзии из микрокапиллярных труб, 9-11 экструдируемых гиалуроновая кислота (HA) -золото наночастиц гидрогели с динамическими свойствами поперечной сшивки , 12 временной контроль гидрогеля жесткости с использованием фотополимеризующегося метакрилированные HA и желатин, 13-фибриногена тромбином на основе поперечной сшивки, 14,15 ионного обмена альгинат-коллагеновый гель, 16 и в последнее время быстрого полимеризации ультрафиолетового света (УФ) -initiated сшивка, 17
Эти примеры демонстрируют возможность генерации материалов, которые могут с помощью bioprinted эффективно. Тем не менее, в дополнение к интеграции с аппаратными средствами, чтобы успешно генерировать жизнеспособные и функциональные конструкции 3-D ткани, биоматериалы должны содержать биохимические и механические сигналы, которые помогают в поддержании клеточногожизнеспособность и функции. Эти дополнительные факторы, биохимические и механические профили, могут оказать существенное влияние на успешную функцию bioprinted конструкций ткани.
Обе клетки и родной внеклеточного матрикса (ЕСМ) несут ответственность за представление широкого спектра сигнальных молекул, таких как факторы роста и другие цитокины к другим клеткам. Сочетание этих сигналов зависит от ткани к ткани, но может быть чрезвычайно мощным и влиятельным в регуляции клеток и тканей поведение. 18 Применение тканеспецифических компоненты ЕСМ из разных органов и реализации как гидрогель или как часть гидрогель был исследован с успех. 19-21 Этот подход, который состоит из decellularizing данной ткани, измельчением его, и его растворения, может быть использован для получения тканеспецифичную биохимические сигналы из любой ткани , и могут быть включены в 3-D - гидрогелевых конструктов. 22
Дополнительно,он широко документально подтверждено , что ткани в организме занимают широкий диапазон жесткостей. 23 , как таковой, возможность настраивать механические свойства биоматериалов, таких как модуль упругости Е 'или сдвига модуля упругости G', является полезным инструментом в тканевой инженерии , Как было описано выше, контроль над bioink механическими свойствами позволяет экструзии на основе biofabrication с использованием мягкого геля, который затем может дополнительно манипулируют вторичному сшиванию на более позднем этапе, при котором упругие уровни модуль упругости может быть достигнуто, что совпадающее типа органа-мишени. Например, биоматериалы могут быть настроены в соответствии с жесткостью 5-10 кПа , как родной печени, 23 или соответствовать жесткость 10-15 кПа , как родной сердечной ткани, 24,25 в теории повышения способности этих органелл функционировать в таким же образом, чтобы их родной коллегами ткани. Влияние жесткости окружающей среды на фенотип клеток был ехрlored в последние годы, особенно в отношении стволовых клеток. Энглер и др. Показали , что эластичность подложки помогают в движении мезенхимальных стволовых клеток (MSC) в направлении линий с эластичность ткани совпадающее подложки. 25 Эта концепция дальнейшего изучения для дифференцировки в мышцу, сердечную функцию, фенотипу печени, пролиферации гемопоэтических стволовых клеток и поддержание стволовых клеток терапевтический потенциал. 24,26-29 Будучи в состоянии настроить гидрогель к различным модуля упругости является важной особенностью биоматериала , который будет использоваться для biofabricate конструкции ткани. 30
Здесь мы опишем протокол, который представляет собой универсальный подход, используемый в нашей лаборатории, чтобы сформулировать систему гидрогеля, который может быть bioprinted экструзии, и адаптированную к 1) содержат биохимического профиля конкретного типа ткани и 2) имитировать модуль упругости этого типа ткани , Обращаясь к этим требованиям, мы стремимся к рrovide материал , который может резюмировать физико - химических и биологических характеристик в естественных условиях ткани. 31 Модульная комбинированная система гидрогель описанный здесь использует многосоставного сшивание подхода с получением экструдируемой bioinks, и позволяет вторичное сшивание для стабилизации и увеличивает жесткость конечные продукты, чтобы соответствовать различные типы тканей. Биохимический настройка выполняется с помощью ткане-специфических компонентов ECM. В качестве демонстрации, мы используем различные печени специфические этого гидрогеля системы bioprint функциональной печени Органоид конструкции. Протокол, описанный использует пользовательский 3-D bioprinting устройство. В общем, этот протокол может быть адаптирован для большинства экструзии на основе принтеров, конкретные параметры печати резко изменяются для каждого типа устройства и требует тестирования пользователем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. гидрогеля Bioink рецептур и подготовка
- Для того , чтобы обеспечить тканеспецифичную биохимические профили, подготовить тканеспецифическая ЕСМ переваривают решений , как было описано выше для печени. 20
Примечание: В общем случае, это ЕСМ дайджеста составит 40% от конечного объема гидрогеля bioink, который используется. Несколько сотен миллилитров раствора ЕСМ дайджеста может быть получен, аликвоты и замораживали при -80 ° С для последующего использования. - До гидрогеле препарата, растворить фотоинициатор, 2-гидрокси-4 '- (2-гидроксиэтокси) -2-метилпропиофенон, в воде в количестве 0,1% вес / об.
Примечание: Объемы в диапазоне 50-100 мл можно приготовить заранее и хранили экранированы от света месте при температуре 4 ° С в течение нескольких месяцев. - Для формирования гидрогелевые bioinks, сначала растворить компоненты основного материала из гиалуроновой кислоты (ГК) гидрогелевых комплекты в растворе на водной фотоинициатора.
- Растворите Тиолированный HA и тиолированным желатин отдельно в водно-рhotoinitiator решение (шаг 1.2) составит 2% вес / объем решений.
- Растворите полиэтиленгликоль диакрилат (PEGDA), сшивающий агент в комплекты гидрогелевых в растворе на водной фотоинициатора (этап 1.2), чтобы сделать 8% вес / об.
- Растворите полиэтиленгликоль (ПЭГ), 8-Arm алкина (ММ 10 кДа) в водно-фотоинициатора растворе (этап 1.2), чтобы сделать 8% вес / об.
- В общем случае, образуют гидрогели с использованием следующей схемы, хотя дополнительные настройки возможно.
- Объедините 4 части 2% тиолированным HA 4 части 2% тиолированного желатина, 1 часть сшиватель 1, 1 часть сшивающий 2 с 8 частей раствора ткани ECM и 2 части гепатоцитов культуры средств массовой информации (HCM) (или 10 частей воды в качестве общего отсутствия ткани -специфический гидрогель).
Примечание: Дополнительный немодифицированной ГК или желатин могут быть добавлены, чтобы сделать bioink выталкивать более плавно. Это будет описано ниже.
- Объедините 4 части 2% тиолированным HA 4 части 2% тиолированного желатина, 1 часть сшиватель 1, 1 часть сшивающий 2 с 8 частей раствора ткани ECM и 2 части гепатоцитов культуры средств массовой информации (HCM) (или 10 частей воды в качестве общего отсутствия ткани -специфический гидрогель).
- Vortex полученную смесь на высокой скорости (10 из 10) в течение 10 секунд, чтобы перемешать перед использованием. </ Li>
- Использование гидрогеля bioink
- Для экструзии или тестирования bioprinting, переноса смеси в шприц или картридж для принтера и дайте ему сшивать спонтанно в течение 30 мин (стадия 1 сшивающего) при 37 ° С.
- Для реологических измерений переноса смеси в 35 мм чашку Петри и дайте ему сшивать в течение 30 мин.
Примечание: Смесь сразу же начинает сшивать через образование тиол-акрилат связи и начнет увеличиваться вязкость. Смесь должна быть переведена на шприц, картридж, или целевое местоположение в течение 10 мин, чтобы избежать засорения пипетки или шприца во время передачи данных. - Когда вторичное сшивание (этап 2) желательно, облучить 1 стадии сшитых гели с ультрафиолетовым светом (365 нм, 18 Вт / см 2) для инициирования реакции полимеризации тиольную-алкиновая.
Примечание: Продолжительность облучения зависит от площади поверхности материала. В общем случае, квадратный сантиметр материала требует только 1-2 сек УФ-облучения при этом мощность УФ.
Тестирование на совместимость 2. Принтер
- До интеграции тестирования с bioprinting устройств, испытание экструзионных характеристик на лабораторном столе с помощью простых тестов экструзии с использованием стандартных шприцев и игл небольшие советы калибра (20-30 избыточное давление).
- Нажмите bioink через стандартный шприц для достижения плавно экструдированных нитей гидрогеля с небольшим количеством или без каких-либо ударов. Выдавливание линий или простых моделей достаточно для определения успеха.
- Для интеграции bioprinter, загрузите bioink препараты с помощью пипетки их в картриджи для принтеров, и позволяют 30 мин для bioink подвергаться спонтанному стадии 1 сшивание внутри картриджа.
Примечание: Объем bioink зависит от конкретного применения и должны быть определены пользователем. Картриджи для принтеров может напоминать или быть шприцы, которые совместимы с bioprinter устройством. - Оценка совместимости экструзионныйдля bioprinting путем печати простой шаблон с помощью bioink. Например, напечатать рисунок 7 х 7 мм, состоящий из параллельных линий. Подайте давление (например, 20 кПа пневматическое давление) в то время как печатающая головка движется в плоскости XY со скоростью приблизительно 300 мм / мин.
Примечание: можно использовать сопла печатающей головки диаметры различных размеров, но конические сопла с отверстиями диаметром 400-500 мкм оптимально для печати сфероидов в диапазоне 250-350 мкм.- Если экструдированные материалы кусковых или неправильной формы, см шаг 2.4, или уменьшить количество PEGDA, чтобы смягчить сшитый материал 1-й этап. Правильно подготовленные bioink составы выдавливать плавно, позволяя точное нанесение в желаемых моделей или архитектур.
Примечание: Процедуры bioprinting описано использование пользовательского 3-D bioprinting устройство , предназначенное в доме специально для ткани печати построить 32 Как таковые, конкретные параметры печати варьируются значительно для каждого типа устройства и требуют testin.г пользователем.
- Если экструдированные материалы кусковых или неправильной формы, см шаг 2.4, или уменьшить количество PEGDA, чтобы смягчить сшитый материал 1-й этап. Правильно подготовленные bioink составы выдавливать плавно, позволяя точное нанесение в желаемых моделей или архитектур.
- Для улучшения свойств экструзия, дополняют неизмененный HA и желатин к bioinks (1,5 мг / мл и 30 мг / мл, соответственно).
3. Проверка по Bioprinting с первичными Печени конструктов
- Подготовьте 3-D сфероидов первичной клетки печени путем повешения методы падения в качестве клеточного компонента 33
Примечание: Bioprinting может быть выполнена без сфероидов, но вместо этого с отдельными клетками, взвешенными в гидрогелевых bioinks а. Spheroids используются здесь для ускорения межклеточных взаимодействий и построить функциональные возможности. Число сфероидов или клеток, используемых в зависимости от конкретного применения и должны быть определены пользователем. Эти шаги должны быть выполнены в стерильных условиях, с использованием стерильных расходных материалов.- Подготовка ГКМ путем добавления размороженного содержимое набора добавка компонента НСМ к гепатоцитов основных сред (НВМ) и стерильной фильтрации.
- Разморозить ип дополнения компонентовсезам жидкости.
- Добавьте Добавка компоненты (аскорбиновую кислоту, 0,5 мл бычьего сывороточного альбумина [жирных кислот свободно], 10 мл гентамицина сульфат / амфотерицин В, 0,5 мл; гидрокортизона 21-гемисукцинат, 0,5 мл; инсулин, 0,5 мл, эпидермальный фактор роста рекомбинантного человеческого , 0,5 мл; перенос 0,5 мл) в 500 мл НВМ.
- Стерильный фильтр через фильтр мкм 0,45 мкм или 0,22 с использованием блока фильтров бутылочной верхний или фильтр наконечника шприца.
- Определить плотность клеток в первичных человеческих гепатоцитов, клеток Купфера и звездчатых клеток путем подсчета на гемоцитометра после того, как каждый тип клеток был размораживают в соответствии с инструкциями производителя.
- Объединить первичные гепатоциты человека, клетки Купфера и звездчатых клеток в соотношении 80:10:10 по числу клеток в ГКМ средах, которые прогрет до 37 ° С в конической трубе.
Примечание: Объем средств массовой информации, которые будут использоваться, зависит от общего числа клеток специфическими для применения и должна определяться йе пользователем. - Центрифуга клеточной суспензии в течение 5 мин при 520 х г при 20 ° С.
- Аспирируйте супернатант, оставляя за собой осадок клеток.
- Ресуспендируют осадок клеток в ГКМ средах с получением клеточной суспензии, содержащей 1000 клеток на 40 мкл среды. Общий объем зависит от количества сфероидов производится.
- Передача суспензии клеток в 96-луночного висячей капли плит. Добавить в общей сложности около 1000 клеток в каждую лунку в ГКМ и выдерживают при температуре 37 ° С, в 5% CO 2 в течение 3 -х дней , в течение которого многоклеточные сфероиды образуют.
- Собрать сфероидов печень от висячей капли пластины с помощью пипетки. Передача в стерильный 15 мл коническую трубку.
- Подготовка ГКМ путем добавления размороженного содержимое набора добавка компонента НСМ к гепатоцитов основных сред (НВМ) и стерильной фильтрации.
- Bioprint сфероиды печени в печени специфических гидрогеля bioink
- Приготовьте формулировку печени ECM-содержащего гидрогеля bioink, как описано в шаге 1, используя 8% PEGDA и 8% 8-Arm ПЭГ алкиновой в качестве сшивающих агентов. Используйте эту комбинацию для его способности в RESUlting в гидрогеле в тесном сдвига модуля упругости к нативной ткани печени.
- Пусть сфероиды оседают на дно конической трубки, в котором они были помещены в шаге 3.1.7. Это изменяется в зависимости от сфероида размера и плотности, но обычно происходит в течение 1-2 мин. Удалить все средства массовой информации тщательно аспирационных или с дозаторов.
- Перенести желаемый объем свежеприготовленного раствора гидрогель bioink в конической трубе, содержащей сфероидов. Как правило, соответствующий объем составляет 10% -25% больше, чем объем 3-D конструкции для печати. Аккуратно пипеткой вверх и вниз для ресуспендирования сфероидов в растворе гидрогеля bioink. Переход к bioprinter картриджа с помощью пипетки или серологические пипетки.
- Внутри bioprinter картриджа, чтобы раствор пройти первую стадию сшивающий (тиол-акрилат реакции) в течение 30 мин.
Примечание: В зависимости от размера сфероида, картридж может быть необходимо медленно вращать или содержимое может потребоваться смешивать сстерильным шпателем, чтобы держать сфероидов распределенные по всему bioink во время сшивания стадии 1. Это меньше необходимости bioinks, приготовленных с взвешенными клетками вместо сфероидов.
Примечание: После этапа 1 сшиванию, пользователи имеют рабочее окно несколько часов. Тем не менее, рекомендуется выполнить процесс bioprinting быстро улучшить жизнеспособность клеток. - После 1-й этап сшивания, используют bioprinting устройство для создания желаемых структур гидрогеля, содержащего первичные сфероидов печени (или других клеток).
Примечание: Эта технология обеспечивает систему для biofabricating широкий спектр структур. Такие параметры, как общий объем, количество ячеек или сфероиды, напечатанной геометрии структуры, и подложки, на которой напечатаны конструкции в значительной степени зависят от целей пользователя. - После осаждения в требуемой конфигурации, управлять УФ-светом в течение 2-4 сек, чтобы инициировать вторичный механизм поперечной сшивки, стабилизации сотрудничестваnstructs и повышения жесткости до требуемого уровня.
Примечание: Концентрация PEG-алкина, и, таким образом, общая конечная плотность поперечной сшивки, в первую очередь контролирует окончательную жесткость конструкции. - Повторите шаги 3.2.4 и 3.2.5 для создания многослойных конструкций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Когда процедуры , описанные выше, выполнены правильно, гидрогели должны содержать биохимический профиль , специфичные для типа ткани - мишени, 20 обеспечивают высокую степень контроля над bioprinting и окончательным модулем упругости, 34 и поддерживать жизнеспособные функциональные клетки в тканевых конструктов.
Гидрогель Настройка
Для лучшего мимической родной печени, гидрогель bioink была дополнена печени ECM решений и фактор роста , Array, 20 ECM решения содержат широкий спектр факторов роста и цитокинов (показанных в пг / мл, Рис . 1А) К ним относятся мозговой нейротрофический фактор (BDNF), bFGF, костного морфогенетического белка 5 (ВМР-5), FGF-4, инсулин-подобный фактор роста связывающий белок 2 (БСИФР-2), TGF-b1, BMP-7, ЭФР , FGF-7, гормон роста (ГР), гепарин-связывающий EGF-подобный фактор роста (HB-EGF), HGF и пeurotrophin 3 (NT-3). Кроме того, ECM решения содержат дополнительные структурные компоненты, которые анализируют с помощью колориметрического анализа. 20 Для ECM печени растворов, общее содержание коллагена решений ECM печени 91,33 ± 0,58 мг / мл, эластин содержание было 189,33 ± 48,40 мг / мл, и гликозаминогликаны (ГАГ) был 86,00 ± 53,45 мг / мл (рис 1б).
Гидрогель bioink механические свойства могут быть охарактеризованы с помощью теста напряжение сдвига развертки (0,6-10 Па, частота колебаний 1 Гц) на вискозиметре. 10,12,13,34 Позволяя спонтанное стадии 1 тиол-акрилат химии происходит при нейтральном рН, мягкий гидрогель с G 'от 113.66 ± 22,59 Па образуется. После инициирования сшивки тиол-алкиновая стадии 2 УФ фотополимеризации, увеличивается G 'до приблизительно 10 кПа (10,637 ± 113,83 Па, FIGURe 1С), имитируя эластичность тканей печени. Дополнительные манипуляции с концентрациями, молекулярных масс и геометрии сшиватели могут достичь широкого диапазона значений 2 -й ступени G '. 34
Качество bioprinted гидрогеля
Химическая стратегия и осуществление стадии 1 и 2 стадии сшивания гидрогеля bioinks описана на рисунке 2. В общем, сшиватели , такие как Extralink, которые основаны на акрилатных ПЭГ полимеров, спонтанно вступают в реакцию с тиоловыми группами на HA и желатиновых цепей при нейтральном рН (стадия 1), в присутствии клеток с образованием мягкого экструдируемой гидрогель. Этот мягкий гидрогель может быть bioprinted как bioink, после чего УФ света используется для инициирования фотополимеризации непрореагировавших тиолов и вторичных сшиватели на основе алкинов-модифицированных ПЭГ полимеров. Конкретные молекулярные массы и геометрические параметры сшивателями идутВерн конец жесткость конструкции bioprinted. A 7 х 7 мм образец был реализован для целей тестирования (Рисунок 3A). Первоначальные испытания показали , что начальные составы были экструдированию, но появились нерегулярные и слипаются во время и после экструзии (рисунок 3б). Для улучшения свойств экструзия, немодифицированной ГК и желатин был дополнен до bioinks (1,5 мг / мл и 30 мг / мл). Усовершенствованная гладкая печатная структура показана на рисунке 3C.
Жизнеспособность и основная функция bioprinted первичных конструкций печени человека
С помощью 3-D bioprinter биоактивный печени специфические гидрогель bioink использовали для инкапсулирования и хранение первичных сфероидов печени человека, ранее подготовленные подвешивания культуры падения, на пластиковые покровные. Будучи напечатаны на пластиковых покровные, разрешенных для надежной обработки и передачи в различных условиях культивирования клеток. После того, как bioprinting, приветГ.Х. жизнеспособность клеток в конструкциях печени наблюдалось после того, как LIVE / DEAD жизнеспособность / цитотоксичность окрашивания и конфокальной микроскопии (рис 4а). При оптимальных условиях окружающей среды жизнеспособность должна быть выше 85%. Первичные гепатоциты человека, как правило, считаются чувствительными к механическим и химическим воздействиям, которые требуют некоторой оптимизации экологических переменных.
После bioprinting и проверки жизнеспособности, дополнительные конструкции печени, которые расставлены в культуре могут быть оценены на предмет функциональности путем анализа средств массовой информации аликвот снятые на 3-й день, 7-й день, 10 день и 14 день для анализа секретируемого мочевины и альбумина. Мочевины , колориметрические анализы показывают относительно стабильный уровень секреции мочевины из конструктов печени с течением времени курс 14 дней, оставаясь в возрасте от 15 до 20 нг / мл (рис 4б). Обнаруженные уровни мочевины существенно не отличались друг от друга в разное времяточки. Анализ Альбумин человека ELISA показывает , что альбумин производства из конструкций также остается относительно постоянным в течение долгого времени, оставаясь стабильным от 125 до 140 нг / мл (рис 4в). Кроме того, при окрашивании для маркеров, которые указывают ткани печени, позитивной экспрессии внутриклеточного альбумин, CYP3A4 (цитохром Р450 изоформы участвуют в обмене веществ), E-кадгерина (эпителиальной межклеточной адгезии белка) и дипептидилпептидазы-4 (белок, выраженный высоко в печени) наблюдаются (рис 4D-F). В совокупности это жизнеспособность и функциональные данные свидетельствуют о том, что ткане-специфические гидрогель bioink помогает в поддержании жизнеспособности и функции bioprinted клеточных конструкций первичных печени.
Рисунок 1. гидрогель компонент характеристика и оценка жесткости. А) фактор роста иАнализ цитокинов протеомики массивов для ECM - решений , полученных из печени. B) колориметрический анализ количественного коллагена, гликозаминогликанов и эластина контента в ECM печени растворах. C) Демонстрация возможностей для управления bioink жесткости. После того, как 1-й этап сшивания, гель является относительно мягким и способным экструдировать плавно. После сшивания стадии 2 УФ-светом, модуль упругости увеличивается более чем на порядок, имитируя ткани печени модуль упругости. Столбики ошибок указывают стандартное отклонение. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Использование нескольких сшиватели на основе ПЭГ для экструзии bioprinting и контроля над тканью построить механические свойства. Sегии формулировки печатаемых bioinks, состоящих из акрилатов на основе сшивающих (сшивающих 1), алкина на основе сшиватели (сшивающий 2), тиолированного HA, тиолированным желатин, ткани ECM материалы, а также неизмененный HA и желатин. Состав bioink готовят и спонтанно сшивает через тиольные акрилата связывания, что приводит к мягким экструдируемого материала. Bioprinting выполняется. И наконец, bioprinted слои слиты, стабилизировалась, и привел к печени модуля упругости. Этот процесс может быть повторен для создания многослойных структур. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Bioprinting тестирование bioinks. А) 7 х 7 мм намотки образец был использован для испытания экструзионного bioinkING в bioprinter. Б) Первоначальная формулировка PEGDA и 8-плеча PEG алкиновой bioink приводит к нерегулярным осаждения. C) Добавление сырого HA и желатин улучшилось экструзии, что приводит к гладкой экструзии bioink. Шкала бар -. 1 мм Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Демонстрация жизнеспособности и функции сфероидов печени bioprinted в печени конкретных гидрогеля bioink. A) Осуществление bioink печени для bioprinting, привело к высокой жизнеспособности конструкций. Зеленый - кальцеина AM окрашенных жизнеспособных клеток; Красный - этидий гомодимер пятнах мертвые клетки B) Мочевина и С) альбумин , выделяемый конструктов печени в течение 14 суток.AYS в культуре, количественно с помощью колориметрического и ИФА, соответственно. Столбики ошибок указывают стандартное отклонение. Иммунологическое маркеров , связанных с печеночной ткани: D) CYP3A4, E) внутриклеточного альбумина, и F) DPP4 и Е-кадгерина. Зеленый или красный - указано пятно; Синий -. DAPI Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Есть несколько компонентов , которые имеют решающее значение для рассмотрения при попытке biofabricate 3-D конструкции ткани, для возможного использования в организме человека или для применения скрининга в пробирке. Используя соответствующие клеточные компоненты определяет потенциальную функциональность конечного, в то время как сам biofabrication устройство определяет общую методологию для достижения конечного конструкции. Третий компонент, биоматериал, столь же важно, поскольку это служит двойной роли. В частности, компонент биоматериал должен быть совместим с аппаратными средствами biofabrication (т.е., bioprinters) , а также поддерживают потенциально хрупких компонентов биологической клетки. Оптимизация обоих этих требований может быть трудно, так как bioprintable материалы должны отвечать ряду ключевых параметров: 1) обладать соответствующими химическими, механическими, и временные свойства для содействия эффективному и неизрасходованный печать; 2) жизнеспособность клеток поддержка на стадии подготовки и bioprinПроцедура тин; 3) и обеспечить благоприятную среду, которая наилучшим образом повышает жизнеспособность клеток и в конечном итоге функцию конструктную ткани вслед за bioprinting. Мы используем модульную систему гидрогель bioink, описанной в методике, описанной здесь, чтобы отвечать этим требованиям. Во-первых, путем включения факторы роста, коллагены, ГАГ и эластины, полученные из ECM конкретного типа ткани, мы можем достичь биохимический профиль, который напоминает тип ткани-мишени. Во-вторых, за счет использования 2 подобных, но независимые реакции сшивания мы можем достичь мягкого экструдируемый материал, который совместим с большинством экструзионного основе, которые могут быть дополнительно изменены со второй стадии сшивания для достижения определяется материала модуль упругости, который соответствует цели ткань выбора. 34
Главная характеристика этой системы, что делает его полезным является возможность поддержки нескольких химических реакций, которые могут быть использованы, чтобы манипулировать polymeкинетика rization и механические свойства системы bioink. Используя 2 независимых типа реакции, тиол-акрилатные и тиол-алкиновых, мы достигаем возможность выполнить 1-й этап тиольную-акрилат реакцию, которая приводит мягкого материала, который можно выдавливать через шприц или bioprinting устройства, и 2 этап тиола -alkyne реакция, которая запускается только при УФ-облучения в присутствии фотоинициатора, который определяет модуль упругости окончательной bioprinted конструкции. Эти несколько шагов приводят к bioprintable материала. Таким образом, для того, чтобы достичь стабильного bioink, поддерживающую экструзию и последующую настройку модуля упругости, поддержание этих отдельных типов реакций имеет важное значение.
Основная жеребьевка с использованием системы для biofabrication является его простота в настройке, которая осуществляется с помощью либо манипулирования конечный модуль упругости через вторичную сшивателя, или путем включения различных тканей, полученных ECM материалов или фактор роста коктейлей. ЕСМ в тканях содержит множество факторов роста и других цитокинов, которые часто различаются по общему распределению между типами тканей. Мы полагаем, что эти факторы являются неотъемлемой частью для поддержания функции определенных типов клеток, таких как первичные гепатоциты человека. Реализация этой концепции было ранее продемонстрировано для повышения жизнеспособности и функции первичных человеческих гепатоцитов в гепаринизированной сэндвич кислота культур гиалуроновая. 20 Объединив гепарин цепей в гидрогеле с факторами роста гепаринсвязывающих, а также других компонентов ЕСМ из ЕСМ печени, мы смогли представить этот печень-специфических биохимического профиля для первичных гепатоцитов человека, поддержание жизнеспособности и функции в пробирке в течение длительного периода времени. Такой подход может быть легко распространен на другие типы тканей, что позволяет исследователям достичь суммировании этих факторов тканеспецифических путем decellularizing и растворяющие другие ткани.
палатка "> Пользователи должны знать , что в то время как базовые компоненты этой системы bioink были реализованы в bioprinting ранее, 10,12,17 , но в менее детальными, ткане - специфических подходов, а также целый ряд других применений регенеративной медицины, 35- 45 biofabrication не было предпринято для всех типов тканей. таким образом , может быть некоторое дальнейшее развитие и поиск неисправностей требуется для того , чтобы создать такие дополнительные конструкции ткани. Однако, модульная система , как , например, описанные здесь , могут быть очень хорошо адаптируются. Другие потенциальные ограничения включают в себя природные сродства, что некоторые типы клеток могут иметь по отношению к конкретным биоматериалов. В целом, мы обнаружили, что гиалуроновая базовые компоненты этой поддержки системы гидрогеля кислота, желатин, и на основе ПЭГ жизнеспособных культур самых разнообразных типов клеток, все же есть могут быть некоторые типы клеток, которые работают лучше, в сконструированных средах различных составов, таких, как коллаген, который имеет характеристическую фиброзной пары, или эластин, который является по своей природе более упругой. Таким образом, рассмотрение для оптимального материала для данного типа ткани и конечного применения имеет важное значение, и система гидрогель bioink, описанный здесь не может быть адекватным для всех видов применения. Кроме того, важно учитывать условия окружающей среды, в соответствии с которыми осуществляется bioprinting. В процессе разработки этого протокола, мы перешли от около температуры окружающей среды (комнатной температуры) условиях с использованием bioinks без каких-либо клеточных сред, которые приводят к ухудшению жизнеспособности, если подготовка и печать времени была слишком вытягиваются, более быстрые протоколы при 37 ° C с использованием bioinks с компонентом средств массовой информации, что значительно повышенной жизнеспособности клеток.До недавнего времени несколько материалов или материалов системы были разработаны специально для взаимодействия с системами bioprinting. В результате, большинство материалов, являются упрощенными, используя либо их биологические характеристики для поддержки клетки, или, их совместимость с biofabricationаппаратного обеспечения. Немногие материалы являются оптимальными в обоих мирах. Система, описанная в данной методике разъединяет эти характеристики, тем самым позволяя настройку биологических характеристик, в то время как облегчение механических свойств, необходимых для экструзии bioprinting. Дополнительное отличие этой гидрогель bioink системы является то, что он может имитировать как биохимические и физические параметры ткани-мишени она используется для biofabricating. Это поддерживает впечатляющий уровень гибкости, позволяя суммировании биохимических факторов почти любой ткани, а также соответствие модуля упругости мягких тканей. Внимание к обоим этим аспектам ткани редко были исследованы в тандеме.
Модульный характер этой технологии обеспечивает гибкость, чтобы быть реализованы в широком спектре приложений. Возможность имитировать различные типы тканей обеспечивает возможность biofabricate не только конструкции печени, используемые в качестве примера в этой работе, но конСтруктуры представляющих многие из других тканей в организме. Возможно, наиболее очевидным широкое применение с использованием этих параметров является способность соответствовать оба аспекта к конкретной ткани, чтобы оптимизировать конечную функцию спроектированных конструкций, для реальных приложений, таких как внедрение или лекарственного средства и токсикологии скрининга. В то время как поколение человеческого размера тканей для имплантации у пациентов является конечной целью для многих исследователей, из-за регуляторных барьеров, клеток источников, а также ограничения на способность изготовить функциональную сосудистую сеть в ткани инженерии органов, эта благородная цель потребует дальнейшего развития и время реализоваться. Тем не менее, такие технологии, как методологии , описанной здесь в настоящее время начинают осуществляться для генерации "органоиды" для платформ в пробирке. Наша команда, как и другие, в настоящее время использует Органоид biofabrication создать модельные системы, в которой выполняются токсикологические исследования. Кроме того, такие органоиды могут быть использованы дляизучение патологии и прогрессирование заболевания, такие как рак, 46 и испытать потенциальные терапевтические процедуры. И, наконец, эта система также поддерживает еще одно важное применение. Манипулируя этими параметрами независимо друг от друга, исследователи могут выполнять основные научные эксперименты, чтобы определить относительную значимость биохимических в сравнении механических факторов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность финансирование со стороны Агентства защиты от угроз сокращения (DTRA) в рамках космической деятельности и морской войны систем Тихоокеанского центра (ГНЦ) PACIFIC контракту № N6601-13-C-2027. Публикация этого материала не является утверждение правительством выводов или выводов в данном документе.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hyaluronic acid | Sigma | 53747 | |
| Gelatin | Sigma | G6144 | |
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma | 410896 | |
| Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP) | ESI-BIO | GS315 | Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA) |
| PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa | Creative PEGWorks | PSB-887 | |
| Primary human hepatocytes | Triangle Research Labs | HUCPM6 | |
| Primary human liver stellate cells | ScienCell | 5300 | |
| Primary human Kupffer cells | Life Technologies | HUKCCS | |
| Hepatocyte Basal Media (HBM) | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte Media Supplement Kit | Lonza | CC-3198 | HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5 ml; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 ml; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5 ml; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 ml; insulin, 0.5 ml; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 ml; transferring, 0.5 ml) |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Other manufacturers are ok. |
| Ammonium hydroxide | Fischer Scientific | A669 | Other manufacturers are ok. |
| Fresh porcine cadaver tissue | n/a | n/a | |
| Lyophilizer | any | n/a | |
| Freezer mill | any | n/a | |
| Bioprinter | n/a | n/a | The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials. |
| Hanging drop cell culture plate | InSphero | CS-06-001 | InSphero GravityPlus 3D Culture Platform |
References
- Visconti, R. P., et al. Towards organ printing: engineering an intra-organ branched vascular tree. Expert Opin Biol Ther. 10, 409-420 (2010).
- Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338, 921-926 (2012).
- Fedorovich, N. E., et al. Hydrogels as extracellular matrices for skeletal tissue engineering: state-of-the-art and novel application in organ printing. Tissue Eng. 13, 1905-1925 (2007).
- Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends Biotechnol. 21, 157-161 (2003).
- Boland, T., Mironov, V., Gutowska, A., Roth, E. A., Markwald, R. R. Cell and organ printing 2: fusion of cell aggregates in three-dimensional gels. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol. 272, 497-502 (2003).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Drake, C., Markwald, R. R. Organ printing: promises and challenges. Regen Med. 3, 93-103 (2008).
- Skardal, A., Atala, A. Biomaterials for integration with 3-d bioprinting. Ann Biomed Eng. 43, 730-746 (2015).
- Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
- Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting. Biomaterials. 30, 5910-5917 (2009).
- Skardal, A., Zhang, J., Prestwich, G. D. Bioprinting vessel-like constructs using hyaluronan hydrogels crosslinked with tetrahedral polyethylene glycol tetracrylates. Biomaterials. 31, 6173-6181 (2010).
- Bertassoni, L. E., et al. Direct-write bioprinting of cell-laden methacrylated gelatin hydrogels. Biofabrication. 6, 024105 (2014).
- Skardal, A., Zhang, J., McCoard, L., Oottamasathien, S., Prestwich, G. D. Dynamically crosslinked gold nanoparticle - hyaluronan hydrogels. Adv Mater. 22, 4736-4740 (2010).
- Skardal, A., et al. Photocrosslinkable hyaluronan-gelatin hydrogels for two-step bioprinting. Tissue Eng Part A. 16, 2675-2685 (2010).
- Skardal, A., et al. Bioprinted amniotic fluid-derived stem cells accelerate healing of large skin wounds. Stem Cells Transl Med. 1, 792-802 (2012).
- Xu, T., et al. Hybrid printing of mechanically and biologically improved constructs for cartilage tissue engineering applications. Biofabrication. 5, 015001 (2013).
- Xu, T., et al. Complex heterogeneous tissue constructs containing multiple cell types prepared by inkjet printing technology. Biomaterials. 34, 130-139 (2013).
- Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of hydrogels for bio-printing applications. J Biomed Mater Res A. 101, 272-284 (2013).
- Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
- Freytes, D. O., Tullius, R. S., Valentin, J. E., Stewart-Akers, A. M., Badylak, S. F. Hydrated versus lyophilized forms of porcine extracellular matrix derived from the urinary bladder. J Biomed Mater Res A. 87, 862-872 (2008).
- Skardal, A., et al. Tissue specific synthetic ECM hydrogels for 3-D in vitro maintenance of hepatocyte function. Biomaterials. 33, 4565-4575 (2012).
- Johnson, T. D., Braden, R. L., Christman, K. L. Injectable ECM scaffolds for cardiac repair. Methods Mol Biol. 1181, 109-120 (2014).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nat comm. 5, 3935 (2014).
- Vanderhooft, J. L., Alcoutlabi, M., Magda, J. J., Prestwich, G. D. Rheological properties of cross-linked hyaluronan-gelatin hydrogels for tissue engineering. Macromol Biosci. 9, 20-28 (2009).
- Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. J Cell Sci. 121, 3794-3802 (2008).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Chaudhuri, T., Rehfeldt, F., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Preparation of collagen-coated gels that maximize in vitro myogenesis of stem cells by matching the lateral elasticity of in vivo muscle. Methods Mol Biol. 621, 185-202 (2010).
- Lozoya, O. A., et al. Regulation of hepatic stem/progenitor phenotype by microenvironment stiffness in hydrogel models of the human liver stem cell niche. Biomaterials. 32, 7389-7402 (2011).
- Holst, J., et al. Substrate elasticity provides mechanical signals for the expansion of hemopoietic stem and progenitor cells. Nat Biotechnol. 28, 1123-1128 (2010).
- Skardal, A., Mack, D., Atala, A., Soker, S. Substrate elasticity controls cell proliferation, surface marker expression and motile phenotype in amniotic fluid-derived stem cells. J Mech Behav Biomed Mater. 17, 307-316 (2013).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Adv Mater. 27, 1607-1614 (2015).
- Malda, J., et al. 25th anniversary article: Engineering hydrogels for biofabrication. Adv Mater. 25, 5011-5028 (2013).
- Integrated organ and tissue printing methods, system and apparatus. US Patent. Kang, H. W., Lee, S. J., Atala, A., Yoo, J. J. , 2012/00889238 A1 (2011).
- Drewitz, M., et al. Towards automated production and drug sensitivity testing using scaffold-free spherical tumor microtissues. Biotechnol J. 6, 1488-1496 (2011).
- Skardal, A., et al. A hydrogel bioink toolkit for mimicking native tissue biochemical and mechanical properties in bioprinted tissue constructs. Acta Biomater. 25, 24-34 (2015).
- Peattie, R. A., et al. Stimulation of in vivo angiogenesis by cytokine-loaded hyaluronic acid hydrogel implants. Biomaterials. 25, 2789-2798 (2004).
- Flynn, L., Prestwich, G. D., Semple, J. L., Woodhouse, K. A. Adipose tissue engineering with naturally derived scaffolds and adipose-derived stem cells. Biomaterials. 28, 3834-3842 (2007).
- Flynn, L., Prestwich, G. D., Semple, J. L., Woodhouse, K. A. Adipose tissue engineering in vivo with adipose-derived stem cells on naturally derived scaffolds. J Biomed Mater Res A. 89, 929-941 (2009).
- Duflo, S., Thibeault, S. L., Li, W., Shu, X. Z., Prestwich, G. Effect of a synthetic extracellular matrix on vocal fold lamina propria gene expression in early wound healing. Tissue Eng. 12, 3201-3207 (2006).
- Duflo, S., Thibeault, S. L., Li, W., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. Vocal fold tissue repair in vivo using a synthetic extracellular matrix. Tissue Eng. 12, 2171-2180 (2006).
- Liu, Y., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. Osteochondral defect repair with autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in an injectable, in situ, cross-linked synthetic extracellular matrix. Tissue Eng. 12, 3405-3416 (2006).
- Liu, Y., et al. Accelerated repair of cortical bone defects using a synthetic extracellular matrix to deliver human demineralized bone matrix. J Orthop Res. 24, 1454-1462 (2006).
- Zhang, J., Skardal, A., Prestwich, G. D. Engineered extracellular matrices with cleavable crosslinkers for cell expansion and easy cell recovery. Biomaterials. 29, 4521-4531 (2008).
- Serban, M. A., Scott, A., Prestwich, G. D. Unit 10.14, Use of hyaluronan-derived hydrogels for three-dimensional cell culture and tumor xenografts. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 10, (2008).
- Xu, X., Prestwich, G. D. Inhibition of tumor growth and angiogenesis by a lysophosphatidic acid antagonist in an engineered three-dimensional lung cancer xenograft model. Cancer. 116, 1739-1750 (2010).
- Liu, Y., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. Tumor engineering: orthotopic cancer models in mice using cell-loaded, injectable, cross-linked hyaluronan-derived hydrogels. Tissue Eng. 13, 1091-1101 (2007).
- Skardal, A., Devarasetty, M., Rodman, C., Atala, A., Soker, S. Liver-Tumor Hybrid Organoids for Modeling Tumor Growth and Drug Response In Vitro. Ann Biomed Eng. , (2015).
