Summary
Se describe un conjunto de protocolos que en conjunto proporcionan un bioink hidrogel imitando tejido con el que construcciones de tejido 3-D funcionales y viables se pueden bioprinted para su uso en aplicaciones de cribado in vitro.
Introduction
En los últimos años, una variedad de tecnologías se han convertido en disponibles que aborda la necesidad de fuentes alternativas de órganos y tejidos funcionales mediante la búsqueda de fabricar, o biofabricate, ellos. Bioprinting ha surgido como uno de los más prometedores de estas tecnologías. Bioprinting se puede considerar como una forma de fabricación aditiva robótico de partes biológicas, que se puede utilizar para construir o modelo viable estructuras de órganos similares o similar a un tejido en 3 dimensiones. 1 En la mayoría de los casos, bioprinting emplea un 3 dimensiones (3 -D) dispositivo de impresión que está dirigido por un ordenador para depositar las células y biomateriales en posiciones precisas, recapitulando lo tanto anatómica que imitan arquitecturas fisiológicas. 2 Estos dispositivos de impresión de un "bioink", que puede tomar la forma de agregados de células, las células encapsuladas en hidrogeles o fluidos viscosos, o microportadores sembrado de células, así como polímeros libres de células que proporcionan estructura mecánica o actuar como pla libre de células3,4. ceholders Siguiendo el proceso bioprinting, la estructura resultante puede ser madurados en las estructuras de tejidos u órganos funcionales, y se utilizan para su aplicación final previsto. 5,6 Hasta la fecha, un órgano de tamaño humano completamente funcional completa no se ha impreso, pero sigue siendo el principal objetivo a largo plazo de bioprinting investigación y desarrollo. 2 sin embargo, a pequeña escala "organoides" construcciones de tejido actualmente están siendo implementados en una serie de aplicaciones, incluyendo el modelado patología, desarrollo de fármacos, y la investigación de la toxicología.
Uno de los principales obstáculos que los investigadores han encontrado en la aplicación de tecnología bioprinting es que muy pocos materiales han sido desarrollados con el propósito explícito de bioprinting. Para tener éxito con eficacia en bioprinting, un biomaterial debe cumplir 4 requisitos básicos. El biomaterial debe tener 1) las propiedades mecánicas adecuadas para permitir la deposición (sea extrusión a través de una boquilla como un gel o un inkjet como una gota), 2) la capacidad para mantener su forma como un componente de una estructura 3-D después de la deposición, 3) la capacidad de control de los usuarios de las 2 características anteriores, y 4) el medio ambiente amistoso y de apoyo una célula en absoluto fases del procedimiento. bioprinting 7 Históricamente, el trabajo bioprinting menudo ha tratado de emplear biomateriales tradicionales existentes en dispositivos bioprinting sin tener en cuenta su compatibilidad, en lugar de diseñar un biomaterial que tienen las propiedades necesarias para bioprinting y aplicaciones de post-impresión posteriores.
Una variedad de bioinks se han desarrollado recientemente para mejor interfaz con el hardware de deposición y fabricación. sistemas de hidrogel estándar plantean problemas significativos debido a que generalmente existen como sea precursor de soluciones de fluidos con propiedades mecánicas insuficientes, o hidrogeles polimerizados que si imprimen pueden obstruir las boquillas o se rompan suba sobre el proceso de extrusión. Nuestro equipo, así como otheRS, han explorado diversas formulaciones de hidrogel para hacer frente a estos problemas bioprinting, incluyendo la impresión de esferoides de células en sustratos de hidrogel, 5,8 celular y el filamento de hidrogel de extrusión de tubos microcapillary, 9-11 extruibles ácido hialurónico (HA) hidrogeles de nanopartículas con propiedades de reticulación -Gold dinámicos , 12 de control temporal de la rigidez de hidrogel utilizando fotopolimerizable metacrilado HA y gelatina, 13 de reticulación basado en fibrinógeno-trombina, 14,15 geles de alginato-colágeno de intercambio iónico, 16 y recientemente rápida polimerización de luz ultravioleta (UV) de reticulación -initiated, 17
Estos ejemplos demuestran la viabilidad de los materiales de generación que puede ser bioprinted eficacia. Sin embargo, además de la integración con el hardware, para generar con éxito construcciones de tejido viable y funcional 3-D, los biomateriales deben contener señales bioquímicas y mecánicas que ayuda en el mantenimiento celularviabilidad y función. Estos factores adicionales, perfiles bioquímicos y mecánicos, pueden tener una influencia significativa en la función exitosa de construcciones de tejido bioprinted.
Tanto las células y la matriz extracelular nativa (ECM) son responsables de presentar una amplia gama de moléculas de señalización, tales como factores de crecimiento y otras citoquinas a otras células. La combinación de estas señales varía de un tejido a otro, pero puede ser extremadamente potente e influyente en la regulación del comportamiento de células y tejidos. 18 El empleo de componentes de ECM específicos de tejido de diferentes órganos y la aplicación como un hidrogel o como parte de un hidrogel ha sido explorado con éxito. 19-21 Este enfoque, que se compone de decellularizing un tejido dado, pulverizando, y disolviéndolo, se puede utilizar para producir señales bioquímicas específicas de tejido de cualquier tejido y pueden incorporarse en construcciones de hidrogel 3-D. 22
Adicionalmente,es ampliamente documentado que los tejidos del cuerpo ocupan una amplia gama de rigideces. 23 Como tal, la capacidad de sintonizar las propiedades mecánicas de los biomateriales, tales como el módulo de elasticidad E 'o cizallamiento módulo elástico G', es una herramienta útil en la ingeniería de tejidos . Como se describió anteriormente, el control sobre las propiedades mecánicas bioink permite Biofabrication basado en extrusión usando un gel suave, que puede entonces manipulado adicionalmente por reticulación secundaria en un momento posterior, en la que los niveles de módulo de elasticidad se pueden lograr que coincide con la del tipo de órgano diana. Por ejemplo, los biomateriales se pueden personalizar para que coincida con una rigidez de 5 a 10 kPa como un hígado nativo, 23 o que coincida con una rigidez de 10 a 15 kPa como tejido cardíaco nativo, 24,25, en teoría, el aumento de la capacidad de estos organoides para funcionar en de manera similar a sus contrapartes tejido nativo. La influencia de la rigidez del medio ambiente en el fenotipo celular se ha explored en los últimos años, en particular con respecto a las células madre. Engler et al. Demostraron que la elasticidad de sustrato con la ayuda en la conducción de las células madre mesenquimales (MSC) hacia linajes con la elasticidad del tejido equivalente a la de sustrato. 25 Este concepto ha sido explorado adicionalmente para la diferenciación en músculo, la función cardíaca, el fenotipo del hígado, la proliferación de células madre hematopoyéticas , y el mantenimiento de células madre potencial terapéutico. 24,26-29 ser capaz de sintonizar un hidrogel a diferentes módulos de elasticidad es una característica importante de un biomaterial que se utiliza para biofabricate construcciones de tejido. 30
Aquí se describe un protocolo que representa un enfoque versátil que se utiliza en nuestro laboratorio para formular un sistema de hidrogel que se puede extrusión bioprinted, y personalizar para 1) contener el perfil bioquímico de un tipo de tejido particular, y 2) imitan el módulo elástico de ese tipo de tejido . Al abordar estos requisitos, nuestro objetivo es provide un material que puede recapitular las características fisicoquímicas y biológicas de in vivo de tejidos. 31 El sistema compuesto de hidrogel modular descrito en el presente documento se aprovecha de un enfoque de reticulación múltiples para producir bioinks extruibles, y permite una reticulación secundaria para estabilizar y aumenta la rigidez de la productos finales para que coincida con una gama de tipos de tejidos. personalización bioquímica se cumple mediante el uso de componentes de ECM específicos de tejido. Como demostración, empleamos una variedad específica del hígado de este sistema de hidrogel de Bioprint hígado funcional construcciones organoides. El protocolo descrito utiliza un dispositivo bioprinting 3-D personalizado. En general, este protocolo se puede adaptar a la mayoría de las impresoras de base de extrusión, los parámetros de impresión específicas varían dramáticamente para cada tipo de dispositivo y requieren pruebas por el usuario.
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Protocol
1. hidrogel Bioink Formulaciones y Preparación
- Con el fin de proporcionar perfiles bioquímicos específicos de tejido, específico de tejido preparar ECM digerir soluciones como se describió anteriormente para el hígado. 20
Nota: En general, esta ECM digest comprenderá 40% del volumen bioink hidrogel final que se emplea. Varios cientos de mililitros de solución de ECM digesto se pueden preparar, alícuotas, y se congelaron a -80 ° C para uso futuro. - Antes de hidrogel formulación, disolver un fotoiniciador, 2-hidroxi-4 '- (2-hidroxietoxi) -2-metilpropiofenona, en agua a 0,1% w / v.
Nota: Los volúmenes en el rango de 50-100 ml se pueden preparar con antelación y se almacena protegida de la luz a 4 ° C durante varios meses. - Para formar bioinks de hidrogel, primero disolver los componentes de material de base de los kits de hidrogel de ácido hialurónico (HA) en la solución de fotoiniciador agua.
- Disolver la gelatina tiolada HA y tiolada por separado en agua-photoinitiator solución (paso 1.2) para hacer 2% w / v soluciones.
- Disolver diacrilato de polietilenglicol (PEGDA), el agente de reticulación en los kits de hidrogel, en solución de fotoiniciador agua (paso 1.2) para hacer un 8% w v / solución.
- Disolver polietilenglicol (PEG) alquino 8-brazo (10 kDa MW) en solución de fotoiniciador agua (paso 1.2) para hacer un 8% w v / solución.
- En general, formar hidrogeles utilizando el siguiente esquema, aunque personalización adicional es posible.
- Combinar 4 partes 2% tiolado HA, 4 partes 2% de gelatina tiolada, 1 parte reticulador 1, 1 parte reticulante 2 con 8 partes de solución de ECM tejido y 2 partes de medios de cultivo de hepatocitos (HCM) (o 10 partes de agua como un no-tejido genérico hidrogel específicos de).
Nota: adicional HA no modificado o gelatina se pueden añadir para que la extrusión bioink más suavemente. Esto se describe a continuación.
- Combinar 4 partes 2% tiolado HA, 4 partes 2% de gelatina tiolada, 1 parte reticulador 1, 1 parte reticulante 2 con 8 partes de solución de ECM tejido y 2 partes de medios de cultivo de hepatocitos (HCM) (o 10 partes de agua como un no-tejido genérico hidrogel específicos de).
- Agite la mezcla resultante en alta (velocidad 10 de 10) durante 10 segundos para mezclar antes de su uso. </ Li>
- El uso de hidrogel bioink
- Para la extrusión o ensayo bioprinting, transferir la mezcla en un cartucho de jeringa o una impresora y deje que se reticulan espontáneamente durante 30 minutos (etapa 1 reticulación) a 37 ° C.
- Para las mediciones reológicas, transferir la mezcla en una placa de Petri de 35 mm y dejarla para reticular durante 30 minutos.
Nota: La mezcla comienza inmediatamente para reticular a través de la formación del enlace tiol-acrilato y comenzará a aumentar la viscosidad. La mezcla debe ser transferida a una jeringa, cartucho de impresión, o ubicación de destino dentro de los 10 min para evitar la obstrucción de una pipeta o una jeringa durante la transferencia. - Cuando se desea reticulación secundaria (etapa 2), irradiar la etapa geles 1-reticulados con luz ultravioleta (365 nm, 18 W / cm 2) para iniciar una reacción de polimerización tiol-alquino.
Nota: La duración de la irradiación depende de la superficie del material. En general, un centímetro cuadrado de material sólo requiere 1-2 seg de la exposición UV en este poder UV.
2. Pruebas de compatibilidad de la impresora
- Antes de las pruebas de integración con dispositivos bioprinting, las características de extrusión de ensayo sobre la mesa de laboratorio con ensayos de extrusión simples usando jeringas estándar y puntas de las agujas de calibre pequeño (20-30 gauge).
- Empuje la bioink a través de una jeringa estándar para lograr filamentos extruidos sin problemas de hidrogel con pocos o sin baches. Extrusión de líneas o patrones simples es suficiente para determinar el éxito.
- Para la integración bioprinter, cargar bioink preparados con la pipeta ellos en cartuchos de impresora, y permitir 30 minutos para el bioink a someterse espontánea etapa 1 reticulación dentro del cartucho.
Nota: El volumen de bioink depende de la aplicación específica y debe ser determinado por el usuario. cartuchos de impresora pueden parecerse o ser jeringas que son compatibles con el dispositivo bioprinter. - Evaluar la compatibilidad de extrusiónpara bioprinting mediante la impresión de un patrón simple usando el bioink. Por ejemplo, imprimir un patrón de 7 x 7 mm compuesto por líneas paralelas. Aplicar presión (por ejemplo, 20 kPa de presión neumática), mientras que el cabezal de impresión se mueve en el plano XY a una velocidad de aproximadamente 300 mm / min.
Nota: diámetros de boquilla del cabezal de impresión de diferentes tamaños se pueden utilizar, pero boquillas cónicas con aberturas de 400 a 500 m de diámetro son óptimas para la impresión de esferoides en el rango de 250 a 350 micras.- Si los materiales extruidos son desiguales o irregulares, consulte el paso 2.4, o reducir la cantidad de PEGDA para ablandar el material reticulado etapa 1. formulaciones bioink preparados adecuadamente extruir sin problemas, lo que permite la deposición precisa de los patrones o arquitecturas deseados.
Nota: Los procedimientos bioprinting uso se describe un dispositivo bioprinting 3-D de diseño personalizado en casa específicamente para construir el tejido de impresión 32 Como tales, los parámetros de impresión específicas varían dramáticamente para cada tipo de dispositivo y requieren testin.g por el usuario.
- Si los materiales extruidos son desiguales o irregulares, consulte el paso 2.4, o reducir la cantidad de PEGDA para ablandar el material reticulado etapa 1. formulaciones bioink preparados adecuadamente extruir sin problemas, lo que permite la deposición precisa de los patrones o arquitecturas deseados.
- Para mejorar las propiedades de extrusión, complementar no modificado HA y gelatina a las bioinks (1,5 mg / ml y 30 mg / ml, respectivamente).
3. Validación por Bioprinting con el hígado Las construcciones primarias
- Preparar 3-D esferoides hepáticos célula primaria en la horca métodos de caída como el componente celular 33
Nota: Bioprinting se puede realizar sin esferoides, pero en su lugar con las células individuales en suspensión en el bioinks de hidrogel también. Los esferoides se emplean aquí para acelerar las interacciones célula-célula y construir funcionalidad. El número de esferoides o células empleadas depende de la aplicación específica y debe ser determinado por el usuario. Estos pasos deben realizarse en condiciones estériles, utilizando materiales esterilizados.- Preparar HCM mediante la adición de los contenidos descongelados de la kit componente suplemento HCM a los medios de hepatocitos basal (HBM) y filtrado estéril.
- Descongelar la ONU componentes de suplementostil líquido.
- Añadir los componentes del suplemento (ácido ascórbico, 0,5 ml; albúmina de suero bovino [ácido graso libre], 10 ml; sulfato de gentamicina / anfotericina B, 0,5 ml; hidrocortisona 21-hemisuccinato, 0,5 ml; insulina, 0,5 ml; factor de crecimiento epidérmico humano recombinante , 0,5 ml; la transferencia, 0,5 ml) a la 500 ml HBM.
- Filtro estéril a través de un filtro de 0,45 micras micras o 0,22 usando una unidad de filtro sobre frascos, o un filtro de punta de la jeringa.
- Determinar la densidad celular de hepatocitos primarios humanos, células de Kupffer, y células estrelladas por recuento en un hemocitómetro después de cada tipo de célula se ha descongelado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Combinar los hepatocitos primarios humanos, células de Kupffer, y células estrelladas en una relación de 80:10:10 por el número de células en medios de HCM que ha sido calentado a 37 ° C en un tubo cónico.
Nota: El volumen de los medios de comunicación a utilizar depende de la cantidad total de la célula específicos de la aplicación y debe ser determinado por THe usuario. - Centrifugar la suspensión celular durante 5 min a 520 xg, a 20 ° C.
- Aspirar el sobrenadante, dejando atrás el sedimento celular.
- Resuspender el sedimento celular en medios de HCM para producir una suspensión de células que contiene 1.000 células por 40 medios mu l. Volumen total depende de que se produce el número de esferoides.
- Transferir la suspensión celular a placas de gota formato colgantes 96 pocillos. Añadir un total de aproximadamente 1000 células a cada pocillo en la MCH y mantener a 37 ° C, en 5% de CO 2 durante 3 días durante los cuales forman esferoides multicelulares.
- Recoger esferoides hepáticas de la placa de gota colgante utilizando una pipeta. Transferir a un tubo cónico estéril de 15 ml.
- Preparar HCM mediante la adición de los contenidos descongelados de la kit componente suplemento HCM a los medios de hepatocitos basal (HBM) y filtrado estéril.
- esferoides hepáticos Bioprint en bioink hidrogel específico de hígado
- Preparar una formulación de hígado que contiene ECM-bioink hidrogel como se describe en el paso 1, el empleo de 8% PEGDA y 8% de 8 brazos que PEG alquino como reticulantes. Utilice esta combinación de su capacidad en resulting en un hidrogel cierre en el módulo de elasticidad de cizallamiento al tejido del hígado nativo.
- Deje que los esferoides se depositan en el fondo del tubo cónico en el que fueron colocados en el paso 3.1.7. Esto varía según el tamaño y la densidad de esferoides, pero ocurre generalmente dentro de 1-2 min. Retire todos los medios por aspiración con cuidado, o con una pipeta.
- Transferir el volumen deseado de solución de hidrogel bioink recién preparada al tubo cónico que contiene los esferoides. En general, un volumen apropiado es 10% -25% mayor que el volumen de la construcción de 3-D para ser impreso. cuidadoso pipeteado arriba y hacia abajo para volver a suspender los esferoides en la solución de hidrogel bioink. Transferencia a un cartucho bioprinter utilizando una pipeta o pipeta serológica.
- En el interior del cartucho de bioprinter, permita que la solución de someterse a la primera etapa de reticulación (reacción de tiol-acrilato) durante 30 min.
Nota: Dependiendo del tamaño del esferoide, el cartucho puede ser necesario girar lentamente o puede necesitar ser mezclado con el contenidouna espátula estéril para mantener los esferoides distribuidos por todo el bioink durante la reticulación etapa 1. Esto es menos de una necesidad para bioinks preparados con células suspendidas en lugar de esferoides.
Nota: Después de la etapa 1 de reticulación, los usuarios tienen una ventana de funcionamiento de varias horas. Sin embargo, se recomienda realizar el proceso de bioprinting rápidamente para mejorar la viabilidad celular. - Después de la etapa 1 de reticulación, utilice un dispositivo bioprinting para crear estructuras de hidrogel deseados que contienen los esferoides hepáticos primarios (u otras células).
Nota: Esta tecnología proporciona un sistema para biofabricating una amplia variedad de estructuras. Los parámetros tales como el volumen total, el número de células o esferoides, la geometría de la estructura impresa, y el sustrato sobre el que se imprimen los constructos dependen de los objetivos de la usuario altamente. - Después de la deposición en la configuración deseada, administrar la luz UV durante 2-4 segundos para iniciar el mecanismo de reticulación secundaria, la estabilización de la constructs y el aumento de la rigidez a nivel deseado.
Nota: La concentración de PEG-alquino, y por lo tanto la densidad de reticulación final global, controla principalmente la rigidez construcción final. - Repetir el 3.2.4 pasos y 3.2.5 con el fin de crear construcciones de varias capas.
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Representative Results
Cuando los procedimientos descritos anteriormente se siguen correctamente, los hidrogeles deben contener un perfil bioquímico específico para el tipo de tejido diana, 20 permiten un alto grado de control sobre bioprinting y módulo elástico final, 34 y apoyar células funcionales viables en construcciones de tejido.
Personalización de hidrogel
Para mejor hígado nativo mímica, el bioink hidrogel se complementó con soluciones ECM hepática y una matriz de factor de crecimiento, 20 soluciones de ECM contienen una amplia variedad de factores de crecimiento y citoquinas (que se muestran en pg / ml, Figura 1A). Estos incluyen el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), bFGF, proteína morfogenética ósea 5 (BMP-5), FGF-4, proteína de unión a factor de crecimiento similar a la insulina 2 (IGFBP-2), TGF-b1, BMP-7, EGF , FGF-7, la hormona del crecimiento (GH), factor de crecimiento similar a EGF de unión a heparina (HB-EGF), HGF y neurotrophin 3 (NT-3). Además, las soluciones ECM contienen componentes estructurales adicionales, que se analizan mediante ensayos colorimétricos. 20 Para las soluciones ECM hepática, el contenido total de colágeno de soluciones ECM hígado fue 91,33 ± 0,58 mg / ml, el contenido de elastina fue 189.33 ± 48.40 mg / ml, y la glicosaminoglicano (GAG) contenido era 86,00 ± 53,45 mg / ml (Figura 1B).
Hidrogel bioink propiedades mecánicas se pueden caracterizar usando un ensayo de corte de barrido de esfuerzo (0,6 a 10 Pa, frecuencia de oscilación de 1 Hz) en el reómetro. 10,12,13,34 Al permitir espontánea etapa 1 química tiol-acrilato de que se produzca a pH neutro, se forma un hidrogel blando, con un G 'de 113,66 ± 22,59 Pa. Después de la iniciación de la etapa 2 de reticulación tiol-alquino por fotopolimerización UV, aumenta G 'a aproximadamente 10 kPa (10.637 ± 113.83 Pa, Figure 1C), imitando la elasticidad del tejido del hígado. La manipulación adicional de las concentraciones, pesos moleculares, y geometrías de agentes de reticulación se puede lograr una amplia gama de valores de etapa 2 G '. 34
Calidad de hidrogel bioprinted
Estrategia química y ejecución de la etapa 1 y la etapa 2 la reticulación de los bioinks hidrogel se describen en la Figura 2. En general, los agentes de reticulación tales como Extralink, que se basan en polímeros de PEG acrilados, reaccionan espontáneamente con los grupos tiol de la HA y las cadenas de gelatina en neutral pH (etapa 1) en presencia de las células para formar un hidrogel extruible suave. Este hidrogel blanda puede bioprinted como bioink, después de lo cual se utiliza la luz ultravioleta para iniciar la fotopolimerización de tioles sin reaccionar y los reticulantes secundarios basados en polímeros PEG-alquino modificado. Los pesos moleculares particulares y geometrías de los reticulantes vanVern la rigidez final de la construcción bioprinted. Una mm patrón de 7 x 7 se llevó a cabo con fines de prueba (Figura 3A). Las pruebas iniciales mostraron que las formulaciones iniciales fueron extruible, pero aparecieron irregular y agrupada durante y después de la extrusión (Figura 3B). Para mejorar las propiedades de extrusión, no modificado HA y gelatina se complementó a las bioinks (1,5 mg / ml y 30 mg / ml). La estructura impresa suave mejorado se muestra en la Figura 3C.
La viabilidad y la función básica de los constructos de hígado humano primarias bioprinted
El uso de la 3-D bioprinter la bioink hidrogel bioactivo específico de hígado se utiliza para encapsular y depositar esferoides hepáticos humanos primarios, preparados previamente en la horca culturas gota, en cubreobjetos de plástico. Que se está imprimiendo en cubreobjetos de plástico permitidos para la manipulación y transferencia robusta a una variedad de entornos de cultivo celular. Después bioprinting, hiSe observó la viabilidad celular GH en los constructos de hígado después de la viabilidad de tinción LIVE / DEAD / citotoxicidad y la microscopía confocal (Figura 4A). En condiciones ambientales óptimas viabilidad debe estar por encima de 85%. hepatocitos humanos primarios son generalmente considerados sensibles a los esfuerzos mecánicos y químicos, lo que requería una cierta optimización de las variables ambientales.
Tras bioprinting y verificación de la viabilidad, los constructos de hígado adicionales que se colocan en cultivo pueden ser evaluados para la funcionalidad mediante el análisis de alícuotas de los medios retirados en día 3, día 7, día 10, y día 14 para el análisis de urea y albúmina secretada. Los ensayos de urea colorimétrico revelan un nivel relativamente constante de la secreción de urea a partir de los constructos de hígado en el transcurso de tiempo de 14 días, que queda entre 15 y 20 ng / ml (Figura 4B). los niveles de urea detectada no fueron significativamente diferentes uno del otro en el tiempo diferentepuntos. El ensayo ELISA Albúmina Humana revela que la producción de albúmina a partir de las construcciones también se mantiene relativamente constante en el tiempo, permaneciendo estable entre 125 y 140 ng / ml (Figura 4C). Además, cuando se tiñen para los marcadores indicativos de tejido hepático, la expresión positiva de albúmina intracelular, CYP3A4 (una isoforma del citocromo P450 involucrado en el metabolismo), E-cadherina (una proteína de adhesión célula-célula epitelial), y de la dipeptidil peptidasa-4 (una proteína expresada altamente en el hígado) se observó (Figura 4D-F). En conjunto, esto viabilidad y datos funcionales sugieren que las ayudas hidrogel bioink específicos de tejido en el mantenimiento de la viabilidad y la función del hígado construcciones basadas en células primarias bioprinted.
Figura 1. Hidrogel caracterización de componentes y la evaluación de la rigidez. A) factor de crecimiento yel análisis de citoquinas por las matrices proteómicas para soluciones ECM preparados a partir de hígado. b) cuantificación del ensayo colorimétrico de colágeno, glicosaminoglicanos, y el contenido de elastina en soluciones ECM hepática. C) Demostración de la capacidad de controlar la rigidez bioink. Después de la etapa 1 de reticulación, el gel es relativamente blando y capaz de ser extruida sin problemas. Después de la etapa 2 de reticulación por luz UV, módulo de elasticidad se incrementa en más de un orden de magnitud, que imitan el tejido hepático módulo elástico. Las barras de error indican la desviación estándar. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. El empleo de múltiples agentes de reticulación a base de PEG para bioprinting y control de extrusión sobre el tejido construir propiedades mecánicas. SSTRATEGIA de formulación de bioinks imprimibles compuestas de agentes de reticulación a base de acrilato (reticulantes 1), agentes de reticulación a base de alquino (reticulante 2), tiolada HA, gelatina tiolada, materiales ECM tejido, y no modificado HA y gelatina. La formulación bioink se prepara y se reticula de forma espontánea a través de tiol-acrilato de unión, lo que resulta en un material blando, extruible. Bioprinting se lleva a cabo. Por último, las capas bioprinted se fusionan, se estabilizaron, y se presentan al módulo de elasticidad del hígado. Este proceso se puede repetir para generar estructuras de varias capas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Bioprinting prueba de bioinks. A) Una mm patrón de arrollamiento 7 x 7 se utilizó para la prueba de extrusión bioinking en el bioprinter. B) La formulación inicial de un PEGDA y PEG de 8 brazos bioink alquino dio lugar a la deposición irregular. C) Adición prima HA y gelatina mejorado de extrusión, lo que resulta en la extrusión suave del bioink. La barra de escala -. 1 mm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Demostración de la viabilidad y la función del hígado esferoides bioprinted en el hidrogel bioink específica del hígado. A) Aplicación de la bioink hígado para bioprinting, dio lugar a construcciones de alta viabilidad. Verde - células viables calceína AM-manchada; Rojo - etidio homodímero manchados de células muertas B) La urea y C) de albúmina secretada por el hígado construcciones más del 14 d.a firma en la cultura, cuantificados mediante ensayos colorimétricos y ELISA, respectivamente. Las barras de error indican la desviación estándar. La inmunotinción de los marcadores asociados con tejido hepático: D) CYP3A4, E) de albúmina intracelular, y F) DPP4 y E-cadherina. Verde o rojo - indica la mancha; Azul -. DAPI Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hay varios componentes que son críticos a considerar cuando se trata de construcciones de tejido biofabricate 3-D, para su posible uso en seres humanos o para aplicaciones de detección in vitro. El empleo de los componentes celulares apropiadas determina la funcionalidad potencial final, mientras que el dispositivo Biofabrication sí determina la metodología general para llegar al constructo final. El tercer componente, el biomaterial, es igualmente importante, ya que sirve el doble papel. Específicamente, el componente de biomaterial debe ser compatible tanto con el hardware Biofabrication (es decir, bioprinters) y también el apoyo de los componentes de la célula biológicos potencialmente frágiles. La optimización de estos dos requisitos puede ser difícil, ya que los materiales bioprintable tienen que cumplir una serie de parámetros clave: 1) poseen propiedades de la sustancia química apropiada, mecánicos, y temporales para facilitar la impresión eficiente y sin trabas; 2) la viabilidad celular apoyo durante las etapas de preparación y bioprinprocedimiento ting; 3) y proporcionar un ambiente hospitalario que realce mejor la viabilidad celular y la función eventual construcción de tejido tras la bioprinting. Empleamos el sistema de hidrogel bioink modular descrito en la metodología descrita aquí para cumplir estos requisitos. En primer lugar, mediante la incorporación de factores de crecimiento, colágenos, GAG, y elastins derivados de la MEC de un tipo de tejido particular, podemos conseguir un perfil bioquímico que es una reminiscencia del tipo de tejido diana. En segundo lugar, mediante el empleo de 2 reacciones de reticulación similares, pero independientes que son capaces de conseguir un material extruible suave que es compatible con la mayoría a base de extrusión, que puede ser alterado aún más con la segunda etapa de reticulación para alcanzar un módulo de elasticidad de material determinada que coincide con un objetivo el tejido de elección. 34
La característica fundamental de este sistema que lo hace útil es la capacidad de soportar múltiples reacciones químicas que pueden aprovecharse para manipular la de pocinética rización y propiedades mecánicas del sistema bioink. Mediante el empleo de 2 tipos de reacción independientes, tiol-acrilato y tiol-alquino, alcanzamos la capacidad de realizar una reacción de tiol-acrilato de fase 1 que resulta en un material blando que puede ser extruido a través de un dispositivo de jeringa o bioprinting, y un tiol etapa 2 reacción -alkyne, que sólo se inicia después de la exposición UV en presencia de un fotoiniciador, que determina el módulo elástico de la construcción bioprinted final. Estas múltiples etapas resultan en un material bioprintable. Como tal, con el fin de lograr un bioink estable que soporta la extrusión y la personalización módulo elástico posterior, el mantenimiento de este tipo de reacción separadas es importante.
El sorteo principal de utilizar el sistema para Biofabrication es su facilidad para la personalización, que se realiza a través de cualquiera manipular el módulo elástico extremo a través del agente de reticulación secundaria, o mediante la inclusión de diferentes materiales ECM derivadas de tejido o cócteles de factores de crecimiento. El ECM en los tejidos contiene una variedad de factores de crecimiento y otras citoquinas, que a menudo varían en la distribución global entre tipos de tejidos. Creemos que estos factores son integrales para mantener la función de ciertos tipos de células, tales como hepatocitos humanos primarios. La aplicación de este concepto se demostró previamente para aumentar la viabilidad y la función de los hepatocitos humanos primarios en cultivos de sándwich de ácido hialurónico heparinizados. 20 Mediante la combinación de cadenas de heparina en el hidrogel con factores de crecimiento de unión a heparina, así como otros componentes de la MEC de ECM hepática, pudimos presentar este perfil bioquímico específico del hígado a los hepatocitos humanos primarios, el mantenimiento de la viabilidad y la función in vitro durante un período prolongado de tiempo. Este enfoque se puede extender fácilmente a otros tipos de tejidos, permitiendo a los investigadores para lograr la recapitulación de estos factores específicos de tejido por decellularizing y solubilización de otros tejidos.
tienda "> Los usuarios deben ser conscientes de que, si bien los componentes de base de este sistema bioink se han implementado en bioprinting anteriormente, 10,12,17, pero en los enfoques específicos de tejido menos matizadas, así como una variedad de otras aplicaciones de la medicina regenerativa, 35- 45 Biofabrication no se ha intentado para todos los tipos de tejidos. como tal, puede haber algo de un mayor desarrollo y la solución de problemas se requiere con el fin de crear tales construcciones de tejido adicionales. sin embargo, un sistema modular tal como el descrito aquí puede muy bien ser adaptable. Otro potencial limitaciones incluyen afinidades naturales que algunos tipos de células pueden tener hacia biomateriales específicos. En general, hemos encontrado que los componentes de base de ácido, a base de PEG de gelatina, y hialurónico de este apoyo del sistema de hidrogel de cultivos viables de una amplia variedad de tipos de células, sin embargo, hay puede ser algunos tipos de células que funcionan mejor en entornos de ingeniería de diferentes composiciones, tales como colágeno, que tiene una fibrosa inherente natura, o la elastina, que es por naturaleza más elástica. Como tal, la consideración para el material óptimo para un tipo de tejido dado y aplicación final es importante, y el sistema de hidrogel bioink descrito aquí puede no ser adecuado para todos los usos. Además, es importante tener en cuenta las condiciones ambientales en que se realiza bioprinting. Durante el desarrollo de este protocolo, se pasó de casi ambiente (temperatura ambiente) condiciones usando bioinks sin ningún medio de células, que conducen a la escasa viabilidad si el tiempo de preparación e impresión de ser demasiado lento, protocolos de más rápido menos de 37 ° C utilizando bioinks con un componente de medios, que aumentó drásticamente la viabilidad celular.Hasta hace poco, pocos materiales o sistemas materiales fueron desarrollados específicamente para interactuar con los sistemas bioprinting. Como resultado, la mayoría de los materiales son simplistas, aprovechando cualquiera de sus características biológicas para apoyar las células, o, su compatibilidad con Biofabricationhardware. Pocos materiales son óptimos en los dos ámbitos. El sistema descrito en esta metodología desacopla estas características, lo que permite la personalización de la caracterización biológica, facilitando al mismo tiempo las propiedades mecánicas necesarias para bioprinting extrusión. Una distinción adicional de este sistema de hidrogel bioink es que puede imitar ambos parámetros bioquímicos y físicos de los tejidos diana que se utiliza para biofabricating. Esto apoya un impresionante nivel de flexibilidad, lo que permite la recapitulación de los factores bioquímicos de casi cualquier tejido, así como hacer juego el módulo elástico de cualquier tejido blando. La atención a estos dos aspectos de un tejido rara vez han sido exploradas en tándem.
La naturaleza modular de esta tecnología permite una flexibilidad para ser implementado en una amplia variedad de aplicaciones. La capacidad para imitar diversos tipos de tejidos proporciona la capacidad de biofabricate no sólo construcciones hígado utilizadas como ejemplo en este trabajo, pero el aireestructuras que representa muchos de los otros tejidos en el cuerpo. Tal vez la aplicación más obvia amplio uso de estos parámetros es la capacidad para que coincida con los dos aspectos a un tejido particular para optimizar la función final de construcciones de ingeniería para aplicaciones reales, tales como la implantación o de drogas y de cribado de toxicología. Mientras que la generación de tejidos de tamaño humano para la implantación en los pacientes es el objetivo final para muchos investigadores, debido a los obstáculos regulatorios, el abastecimiento de células, y las limitaciones en la capacidad de fabricar vasculatura funcional en órganos de la ingeniería tisular, este noble objetivo se requiere un mayor desarrollo y hora a realizarse. Sin embargo, las tecnologías tales como la metodología descrita aquí están comenzando a implementar actualmente para la generación de "organoides" para las plataformas in vitro. Nuestro equipo, así como los demás, está actualmente utilizando organoid Biofabrication para crear sistemas modelo en el que se llevan a cabo estudios de toxicología. Además, tales organoides se pueden emplear paraestudiar patologías y progresión de la enfermedad, como el cáncer, 46 y probar posibles tratamientos terapéuticos. Por último, este sistema también soporta otro uso importante. Mediante la manipulación de estos parámetros de forma independiente, los investigadores pueden llevar a cabo experimentos científicos básicos para determinar la importancia relativa de bioquímica frente a factores mecánicos.
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Disclosures
Los autores tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen la financiación de la Agencia de Defensa de Reducción de Amenazas (DTRA) bajo Espacio y Sistemas de Guerra Naval Pacific Center (SSC Pacífico) Contrato No. N6601-13-C-2027. La publicación de este material no implica la aprobación por parte del gobierno de los resultados o las conclusiones de este documento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hyaluronic acid | Sigma | 53747 | |
| Gelatin | Sigma | G6144 | |
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma | 410896 | |
| Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP) | ESI-BIO | GS315 | Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA) |
| PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa | Creative PEGWorks | PSB-887 | |
| Primary human hepatocytes | Triangle Research Labs | HUCPM6 | |
| Primary human liver stellate cells | ScienCell | 5300 | |
| Primary human Kupffer cells | Life Technologies | HUKCCS | |
| Hepatocyte Basal Media (HBM) | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte Media Supplement Kit | Lonza | CC-3198 | HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5 ml; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 ml; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5 ml; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 ml; insulin, 0.5 ml; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 ml; transferring, 0.5 ml) |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Other manufacturers are ok. |
| Ammonium hydroxide | Fischer Scientific | A669 | Other manufacturers are ok. |
| Fresh porcine cadaver tissue | n/a | n/a | |
| Lyophilizer | any | n/a | |
| Freezer mill | any | n/a | |
| Bioprinter | n/a | n/a | The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials. |
| Hanging drop cell culture plate | InSphero | CS-06-001 | InSphero GravityPlus 3D Culture Platform |
References
- Visconti, R. P., et al. Towards organ printing: engineering an intra-organ branched vascular tree. Expert Opin Biol Ther. 10, 409-420 (2010).
- Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338, 921-926 (2012).
- Fedorovich, N. E., et al. Hydrogels as extracellular matrices for skeletal tissue engineering: state-of-the-art and novel application in organ printing. Tissue Eng. 13, 1905-1925 (2007).
- Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends Biotechnol. 21, 157-161 (2003).
- Boland, T., Mironov, V., Gutowska, A., Roth, E. A., Markwald, R. R. Cell and organ printing 2: fusion of cell aggregates in three-dimensional gels. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol. 272, 497-502 (2003).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Drake, C., Markwald, R. R. Organ printing: promises and challenges. Regen Med. 3, 93-103 (2008).
- Skardal, A., Atala, A. Biomaterials for integration with 3-d bioprinting. Ann Biomed Eng. 43, 730-746 (2015).
- Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
- Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting. Biomaterials. 30, 5910-5917 (2009).
- Skardal, A., Zhang, J., Prestwich, G. D. Bioprinting vessel-like constructs using hyaluronan hydrogels crosslinked with tetrahedral polyethylene glycol tetracrylates. Biomaterials. 31, 6173-6181 (2010).
- Bertassoni, L. E., et al. Direct-write bioprinting of cell-laden methacrylated gelatin hydrogels. Biofabrication. 6, 024105 (2014).
- Skardal, A., Zhang, J., McCoard, L., Oottamasathien, S., Prestwich, G. D. Dynamically crosslinked gold nanoparticle - hyaluronan hydrogels. Adv Mater. 22, 4736-4740 (2010).
- Skardal, A., et al. Photocrosslinkable hyaluronan-gelatin hydrogels for two-step bioprinting. Tissue Eng Part A. 16, 2675-2685 (2010).
- Skardal, A., et al. Bioprinted amniotic fluid-derived stem cells accelerate healing of large skin wounds. Stem Cells Transl Med. 1, 792-802 (2012).
- Xu, T., et al. Hybrid printing of mechanically and biologically improved constructs for cartilage tissue engineering applications. Biofabrication. 5, 015001 (2013).
- Xu, T., et al. Complex heterogeneous tissue constructs containing multiple cell types prepared by inkjet printing technology. Biomaterials. 34, 130-139 (2013).
- Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of hydrogels for bio-printing applications. J Biomed Mater Res A. 101, 272-284 (2013).
- Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
- Freytes, D. O., Tullius, R. S., Valentin, J. E., Stewart-Akers, A. M., Badylak, S. F. Hydrated versus lyophilized forms of porcine extracellular matrix derived from the urinary bladder. J Biomed Mater Res A. 87, 862-872 (2008).
- Skardal, A., et al. Tissue specific synthetic ECM hydrogels for 3-D in vitro maintenance of hepatocyte function. Biomaterials. 33, 4565-4575 (2012).
- Johnson, T. D., Braden, R. L., Christman, K. L. Injectable ECM scaffolds for cardiac repair. Methods Mol Biol. 1181, 109-120 (2014).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nat comm. 5, 3935 (2014).
- Vanderhooft, J. L., Alcoutlabi, M., Magda, J. J., Prestwich, G. D. Rheological properties of cross-linked hyaluronan-gelatin hydrogels for tissue engineering. Macromol Biosci. 9, 20-28 (2009).
- Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. J Cell Sci. 121, 3794-3802 (2008).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Chaudhuri, T., Rehfeldt, F., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Preparation of collagen-coated gels that maximize in vitro myogenesis of stem cells by matching the lateral elasticity of in vivo muscle. Methods Mol Biol. 621, 185-202 (2010).
- Lozoya, O. A., et al. Regulation of hepatic stem/progenitor phenotype by microenvironment stiffness in hydrogel models of the human liver stem cell niche. Biomaterials. 32, 7389-7402 (2011).
- Holst, J., et al. Substrate elasticity provides mechanical signals for the expansion of hemopoietic stem and progenitor cells. Nat Biotechnol. 28, 1123-1128 (2010).
- Skardal, A., Mack, D., Atala, A., Soker, S. Substrate elasticity controls cell proliferation, surface marker expression and motile phenotype in amniotic fluid-derived stem cells. J Mech Behav Biomed Mater. 17, 307-316 (2013).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Adv Mater. 27, 1607-1614 (2015).
- Malda, J., et al. 25th anniversary article: Engineering hydrogels for biofabrication. Adv Mater. 25, 5011-5028 (2013).
- Integrated organ and tissue printing methods, system and apparatus. US Patent. Kang, H. W., Lee, S. J., Atala, A., Yoo, J. J. , 2012/00889238 A1 (2011).
- Drewitz, M., et al. Towards automated production and drug sensitivity testing using scaffold-free spherical tumor microtissues. Biotechnol J. 6, 1488-1496 (2011).
- Skardal, A., et al. A hydrogel bioink toolkit for mimicking native tissue biochemical and mechanical properties in bioprinted tissue constructs. Acta Biomater. 25, 24-34 (2015).
- Peattie, R. A., et al. Stimulation of in vivo angiogenesis by cytokine-loaded hyaluronic acid hydrogel implants. Biomaterials. 25, 2789-2798 (2004).
- Flynn, L., Prestwich, G. D., Semple, J. L., Woodhouse, K. A. Adipose tissue engineering with naturally derived scaffolds and adipose-derived stem cells. Biomaterials. 28, 3834-3842 (2007).
- Flynn, L., Prestwich, G. D., Semple, J. L., Woodhouse, K. A. Adipose tissue engineering in vivo with adipose-derived stem cells on naturally derived scaffolds. J Biomed Mater Res A. 89, 929-941 (2009).
- Duflo, S., Thibeault, S. L., Li, W., Shu, X. Z., Prestwich, G. Effect of a synthetic extracellular matrix on vocal fold lamina propria gene expression in early wound healing. Tissue Eng. 12, 3201-3207 (2006).
- Duflo, S., Thibeault, S. L., Li, W., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. Vocal fold tissue repair in vivo using a synthetic extracellular matrix. Tissue Eng. 12, 2171-2180 (2006).
- Liu, Y., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. Osteochondral defect repair with autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in an injectable, in situ, cross-linked synthetic extracellular matrix. Tissue Eng. 12, 3405-3416 (2006).
- Liu, Y., et al. Accelerated repair of cortical bone defects using a synthetic extracellular matrix to deliver human demineralized bone matrix. J Orthop Res. 24, 1454-1462 (2006).
- Zhang, J., Skardal, A., Prestwich, G. D. Engineered extracellular matrices with cleavable crosslinkers for cell expansion and easy cell recovery. Biomaterials. 29, 4521-4531 (2008).
- Serban, M. A., Scott, A., Prestwich, G. D. Unit 10.14, Use of hyaluronan-derived hydrogels for three-dimensional cell culture and tumor xenografts. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 10, (2008).
- Xu, X., Prestwich, G. D. Inhibition of tumor growth and angiogenesis by a lysophosphatidic acid antagonist in an engineered three-dimensional lung cancer xenograft model. Cancer. 116, 1739-1750 (2010).
- Liu, Y., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. Tumor engineering: orthotopic cancer models in mice using cell-loaded, injectable, cross-linked hyaluronan-derived hydrogels. Tissue Eng. 13, 1091-1101 (2007).
- Skardal, A., Devarasetty, M., Rodman, C., Atala, A., Soker, S. Liver-Tumor Hybrid Organoids for Modeling Tumor Growth and Drug Response In Vitro. Ann Biomed Eng. , (2015).
