一个多腔动态单一酶幻影超极化磁共振剂研究的用途

Abstract

磁共振超极化底物的影像显示在实时关键的生化过程的评估重要的临床前景。由于受超极化状态施加限制的根本，充满异国情调的成像和重建技术是常用的。对于动态的，多光谱成像方法表征一个实用的系统迫切需要。这样的系统必须可重复复述正常和病理组织的相关化学动力学。最广泛使用的基材日期是超极化[1- ¹³ C]丙酮酸癌症代谢的评估。我们描述了介导丙酮酸至乳酸的转化基于酶的幻象系统。反应通过超极化剂的注入开始到虚线内的多个腔室，其中每一个包含不同的是控制反应速率的试剂的浓度。多个隔室是必要的，以确保伊马蔓茎序列忠实捕获组织的空间和代谢异质性。该系统将通过提供化学动力学所不具备与传统幻影，以及控制和再现那是不可能在体内帮助的先进影像战略的制定和验证。

Introduction

的¹³ C标记的化合物的超极化的磁共振成像（MRI）的临床影响主要取决于其测量流经实时磁共振光谱学和光谱成像^1-5化学转化率的能力。期间顺序开发和验证，动态化学转化一般是通过在体内或体外模型^6-9，提供有限的控制和再现性来实现的。对于稳健的测试和质量保证，它保留了化学转化特有的这种测量更多的控制系统将是首选。我们概述实现使用动态单一酶虚线可重复的方式这种转换的方法。

与超极化¹³ C制剂的研究大多集中于一个正常运作的生物环境成像超极化基板。这是显而易见的选择，如果目标是研究生物人处理或确定在临床护理潜在影响。然而，如果一些测量系统或数据处理算法的表征是期望的，生物模型有许多缺点，如固有的空间和时间变化^10。然而，传统的静态幻影缺乏化学转化驱动在超极化基底的MRI主要临床利益，并且不能用于表征转化率或其他动态参数¹¹的检测。使用单一酶系统，我们可以提供可控的和可重复的化学转化，从而实现动态显像策略严格的审查。

该系统是针对谁正在开发的成像策略超极化基板，并希望反对其他方法相比性能特征调查。如果静态测量所需的终结点，然后静¹³ C-标有代谢幻影无线会足够了^11。在另一端，如果更复杂的生物特征是该方法（交货，蜂窝密度等 ）则实际的生物模型，将需要^12-14的关键。该系统非常适合的，旨在提供明显的化学转化率的定量测量成像战略评估。

Protocol

注：（幻影设计）两个3毫升室进行机加工出来的Ultem的，并配有PEEK管（1.5875毫米外径0.762毫米ID）注射和排气。庭置于充满水（ 图1）的50ml离心管中。为了避免气泡产生信号的空隙，腔和管预填充去离子水（DH ₂ O）。

1.溶液的制备

1. 制备1升缓冲溶液（81.3毫摩尔Tris pH 7.6中，203.3毫摩尔NaCl）。称取11.38克的Trizma预设晶体pH值7.6和11.88克NaCl和1升的dh ₂ O的溶解
2. 准备50毫米NADH的解决方案。称取17.8毫克β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），减少的二钾盐，并在280微升被在第一步中制备的缓冲溶液中溶解。
3. 准备250 U / ml的酶溶液。称出乳酸脱氢酶（LDH）的78.75的活性单位，并在从s 315微升缓冲液溶解TEP之一。
4. 准备丙酮酸组合。称取21.4毫克Ox063三苯甲基自由基和1.26克溶解（约1毫升）[1- ¹³ C]丙酮酸。
5. 制备溶出介质（40毫摩尔Tris pH 7.6中，40毫摩尔的NaOH，0.27毫摩尔EDTA和50mM NaCl）中。称出5.96克的Trizma预置晶体pH值7.6，1.6克的NaOH，0.1g的乙二胺四乙酸二钠盐水合物（EDTA）和2.9克NaCl和1升的dh ₂ O溶解
6. 制备1:10钆特醇溶液（50毫摩尔）。将1微升钆特醇在9微升卫生署₂ O的8 M ^[13 C]尿素准备。称取1.465 5 ^[13 C]尿素和3毫升卫生署₂ O.溶解

2.超极化丙酮酸的制备

1. 在样品杯的动态核极化（DNP）系统中，移液管的钆特醇溶液0.3微升和丙酮酸溶液的13毫克（〜10微升）。
2. 简要地搅动与枪头样品杯该混合物。</ LI>
3. 将样品放入DNP系统。
   1. 确保门给DNP系统被关闭。通过点击DNP系统控制台上插入样品按钮开始样品插入过程。在采样向导中选择下一个正常的样品，然后按。
   2. 保持样品杯垂直插入杆轻轻地放在在样品杯的顶部。出现提示时，打开DNP系统，插入杯在使用插杆的变温插杆（VTI）。
   3. 拉柱塞在样品插入杆的端部以释放样品中的变温指数。从系统中删除样品插入杆和点击DNP系统控制台上的一个按钮。
4. 启动两极分化。
   1. 点击DNP系统控制台上的启动按钮两极分化。在RINMR软件类型.HYPERSENSENMR推出极化监控软件。设置建立的配置为1，按回车键。然后点击坚实的基础ū页。
   2. 设置保存文件的位置和名称。请在下拉DNP系统控制台选项卡上的13-C的配置文件，然​​后单击下一步。勾选积累过程中采样，样本集时间300秒，并点击完成。
5. 量出3.85克（〜4ml）中的溶解介质中或者通过用5毫升注射器体积或通过使用秤的重量。

3.幻影酶的制备

1. 填充〜3毫升^[13℃]的尿素溶液中的微量离心管中，并将其放置在50ml离心管中。填写50ml离心管，卫生署₂ O.
2. 通过注入〜3毫升的dh ₂ O成幻影的注射线，注意冲洗形成任何气泡预填充这两个酶商会和与卫生署₂ O线。
3. 放置假体与容易进入注射线磁铁的中心。确保有一些容器赶上那会发泄出来到t液体他排气管。
4. 制备高活性酶混合物（17.14毫米NADH，44.57 U / ml的LDH）。混合在一起240微升NADH溶液，125微升的LDH溶液和335微升缓冲液和保持在一个3毫升注射器可以连接到注入线。
   注意：一旦从DNP系统500微升的40mM丙酮酸结合，最终幻象体积将1.2毫升16.7毫丙酮酸，10毫NADH，并与pH值Tris缓冲溶液26 U / L LDH的浓度〜 7.5。
5. 制备低活性的酶的混合物（17.14毫NADH 26.79单位/毫升，LDH）混合在一起240微升NADH溶液，75微升的LDH溶液和385微升缓冲液和保持在一个单独的3毫升注射器可以连接到注入线。
   注意：一旦与500微升从DNP系统40毫丙酮酸结合最终幻象体积将1.2毫升16.7毫丙酮酸，10mM的NADH的浓度，并与pH值Tris缓冲溶液15.625 U / L LDH〜7.5 。

jove_title“> 4。运行任何质量保证（QA）和定位扫描

1. 初始定位。
   1. 加载操作模式^[1 H] TX / RX音量模式一个新的Flash定位扫描。更改设置尺寸2：光谱仪控制工具 - >编辑GS - >安装尺寸 - > 2.按GSP的光谱仪控制，直到在磁体中心的移动幻象。按STOP然后按GOP的光谱仪控制。
2. 引导扫描。
   1. 加载操作模式^[1 H] TX / RX音量模式新TriPiolt定位扫描。位置切片：扫描控制 - >切片工具 - >动片（按住M键单击并拖动，选择片与片包移动滑块）。
   2. 摆动¹小时线圈：光谱仪控制工具- > ACQ - >摆动。调整和背后的磁铁，按STOP比赛¹小时线圈。按住shift键按下扫描控制窗口上的红绿灯。

1. 装入新的径向平面回波波谱成像（radEPSI）运作模式^[13 C] TX / RX音量模式进行扫描。位置切片：切片工具上的扫描控制和移动切片（按住M键单击并拖动，选择片与片包移动滑块）。
2. 摆¹³ C线圈通过点击光谱仪控制工具- > ACQ - >摆动。设置接收机增益1000-2000的光谱仪。
3. 执行最后的系统检查。根据不同的顺序，从一名球探协议尿素室观察碳-13信号。
   注意：这确保了系统开始不可逆转的溶解过程之前设置正确。

6.运行解散

1. 当丙酮酸已经达到> 90％的偏振（〜1小时），将溶液和幻象准备好了，并且扫描被构造点击DNP SY运行溶解按钮干的控制台。
2. 当系统提示移动溶解粘到其操作位置，注入溶出介质。关闭DNP系统，然后单击DNP系统控制台上的按钮完成。将溶解粘回提示依次完成时休息的位置。
3. 当DNP系统提供的超极化的丙酮酸（〜加热开始后2分钟）撤回500微升丙酮酸溶液到每个高和低浓度的酶溶液注射器。缓慢（〜10秒）注​​入每个注射器到注射线。
   注：扫描可能已经启动之前注射或随时到3分钟后喷射取决于所使用的扫描协议。

7.图像处理

注：此幻象是专为与许多成像策略的使用。参见图2，随着RAD-EPSI图像的方式用Matlab处理的例子。

1. 从FID文件加载原始数据。 ReshaPE的数据来匹配突起的数目，读出的点，回波和帐户存储为实部和虚成对数据。分离出偶数和奇数回声分。
2. 傅立叶变换或者偶数或奇数回波沿着回波尺寸。可视地识别为丙酮酸和乳酸的频带。为简单起见，使用的频谱的绝对值。
3. 分隔每个波段的代谢产物和傅立叶沿频率编码方向产生孤立的正弦图的每个变换的代谢产物。逆Radon变换独立正弦图，以产生乳酸或丙酮酸的形象。

Representative Results

切片选择性的2D图像用快照radEPSI序列获得。代谢物图像用滤波反投影重建。代谢图像以及与质子图像对准，如在图2中看到的，在这种系统超极化乳酸盐信号只能从超极化的丙酮酸的酶转化产生的。在图4中 ，底室，具有较高的LDH浓度，具有更强的乳酸盐和较弱丙酮酸信号相比顶室作为。使用相对代谢物信号作为酶浓度的估计的乳酸为丙酮酸比在下部腔室更高1.47倍。下部和顶部隔室之间的实际的酶浓度比为1.66倍，其与所述信号比（ 图4）粗协议。

时间过程图像进行基因使用理想序列（ 图3）分级。代谢物图像和质子参考值之间强有力的协议再次被观察到。注意，没有尿素幻象存在这项研究。在右边的高酶室，一个非常强大的初始乳酸信号被观察到。该反应几乎完全由它被输送到腔室（9秒递送，12秒峰乳酸）时催化。反应在低酶浓度腔（左）进展更慢。它还值得注意的是在高的酶室为多个信号中观察到较少的丙酮酸信号转化成乳酸。

图1.幻影示意图：（A）图显示了腔设计。钱伯斯A和B装有注射和排气线。尿素室被密封，因为它并不需要被注入采集过程中编。 （B）拆卸幻影的照片显示室，注射线和50毫升管。 （ 三 ）组装幻影系统使周围的线路末端的注射器连接器的边框包裹注射线。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2.使用来自两个单独的光谱带中产生抗辐射EPSI。冠状图像代谢物的图像 ，丙酮酸（中心）和乳酸（右）。顶部腔室具有明显更丙酮酸信号和比底腔乳酸盐信号更少。质子图像（左）在成像超极化剂后获得的。 请点击此处查看该图的放大版本。

图使用一个理想的序列3.代谢的时间过程的图像。轴向 在这一系列的图像在3秒的间隔获得。丙酮酸（顶部）和乳酸盐（底部）被显示在灰度质子图像。强乳酸盐和较弱丙酮酸信号在包含高酶浓度的右腔室中观察到。左腔，具有较低的酶浓度，表现出了较少的乳酸和丙酮酸更强的信号。该商会是无效超极化信号的前9秒，因为扫描，在注射前启动。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4“SRC =”/文件/ ftp_upload / 53607 / 53607fig4.jpg“/>
图4.处理图像：用于在合并代谢物的图像（左）显示每个腔室的平均信号幅度。在乳酸为丙酮酸的比率为顶部和底部腔室的差异定性匹配中使用的酶的活性，显示为棒图（右）的差异。

Discussion

超极化的代谢物实时成像具有序列设计，验证和质量控制许多独特的挑战。解决时空和光谱异质性的能力提供大量的临床潜力，但是排除了与常规MRI相关的质量保证和验证方法。复杂的成像序列或重建算法可能会有细微的依赖使得它们难以定性或验证成像实验之外。生物的异质性和其它实际问题限制使用的在体内和体外模型来表征或验证序列，硬件或数据处理算法。

空间多隔间和动态化学演化，所以可以概括与成像的超极化基底体内而以受控的方式相关联的关键特征。高和低酶活性地区提供reproduci竹叶提取动态对比度用于定性和定量成像生物标记的评估。空间变化确保几何扭曲，错位，错等常见的来源是占正常。

而不是活系统通过LDH催化的反应速率更可控仍然非常敏感的实验条件和是不确定的主要来源。重要的是，LDH是对温度敏感。如果随后的测量是要比较大必须小心，房间和液体的温度保持在所有测量常数。此外，该高浓度的超极化的研究相关的丙酮酸强制使用高浓度的辅酶NADH和酶的LDH的。这些高浓度一般不允许的小的假设没有酶抑制或特定衬底过量浓度为。如果化学动力学的严格的表征可能期望将需要的试剂的差的浓度恢复这些假设。然而，该制剂将导致在其中应该足以满足大多数成像验证每个隔间可变速率生产超极化的乳酸。

如果很少或没有乳酸信号观察的第一位置来检查将是酶，它可能需要被更换的活性。此外在递送到幻象隔间变化引起超极化信号的量的不确定性。为了减少可变性的这些来源至关重要的是，超极化的丙酮酸加入到每个室中的量被精确地测量，并顺利增加。超极化丙酮酸固有的信号衰减通过把严格的时间限制在注射这项任务复杂化。今后的工作将重点放在实现一个自动注射机制，将允许超极化丙酮酸引进过程中的酶混合物和随后注入幻影被机器控制。这个系统将移除人为错误测量加到每个室丙酮酸的量以及提高交货速度到扫描仪。特别是超极化的丙酮酸被撤回到含有酶混合物的整个体积被注入到腔室之前的注射器。这样做是为了使在注射过程中的丙酮酸与酶混合物混合助剂。这种方法的一个限制是，之前的混合物是在扫描仪，因此，反应的早期部分不测量丙酮酸至乳酸的反应开始。腔室设计的未来细化将旨在允许预先腔室填充有所述酶混合物与仅注射，同时仍确保的腔室内容充分混合作为丙酮酸到达超极化的丙酮酸。

相比静态幻影该系统有一定的局限性。对D在一些动态的化学反应ependence限制了这些幻影，以单次使用。注射后的线条和室将需要进行清洁和新鲜试剂溶液需要被使用，或者从等分试样解冻。而单酶幻影捕捉一些动态的化学行为不如实地概括一个实际的生物系统。在生命系统丙酮酸是参与多种复杂的生化途径和丙酮酸的简单的转换，以在共同的酶的存在下用单个酶同种型乳酸是大幅简化。此外，如果血管或输送的一些其它形式以及任何类型的细胞摄取的是至关重要到测量该系统将可能是一个模型不充分。单一酶幻象是侧重于某些化学反应的折衷，它不是可重复或实际作为静态幻象，但是仍然更可重复的，生活系统。该系统的重现性，其特征在于b相比，其具有介于25％至40％内组变异性¹⁰动物研究中的15至20％的重复测量ý变异。此外，它不活细胞或组织的每一个环节模型，但坚持认为，使用静态幻象时，会丢失关键的动态行为。

此幻象系统被设计具有一系列成像技术来操作。有了这样一个灵活的平台，质量保证扫描及以上超极化进行收购是与其他机构所使用的程序或协议互换。为了说明这一点，我们使用一个自定义序列IDEAL类似的结果执行在GE 3T扫​​描仪类似的研究。

[1- ¹³ C]丙酮酸超极化MRI显示巨大潜力，因为它来探测体内癌症代谢的实时性。有趣的是，这种技术的灵敏度制定或验证measurem时带来了极大的挑战耳鼻喉科技术。使用单一酶幻象能够重新创建的空间和时间的动力，是通过MRI超极化剂的测量临界在一种实用的，可控制的和可重复的方式必须对开发和验证是有用的。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioSpect 7T	Bruker	BioSpec 70/30 USR	7 Tesla Pre-Clinical MRI Scanner
HyperSense	Oxford Instruments	Hypersense DNP Polarizer	Dynamic Nuclear Polarizer for MRI agents
1-13C-Pyrvic Acid	Sigma Aldrich	677175	Carbon 13 labled neat pyruvic acid
Trityl Radical	GE Healthcare	OX063	Free radical used in Dynamic Nuclear Polarization
NaOH	Sigma Aldrich	S8045
EDTA	Sigma Aldrich	E6758	Ethylenediaminetetraacetic acid
LDH	Worthingthon	LS002755	Lactate Dehydrogenase from rabbit muscle
NADH	Sigma Aldrich	N4505	β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced dipotassium salt
Trizma	Sigma Aldrich	T7943	Trizma Pre-set crystals
NaCl	Sigma Aldrich	S7653