Användning av en flerfacks Dynamic enda enzym Phantom för studier av hyper Magnetic Resonance ombud

Abstract

Avbildning av hyperpolariserade substrat genom magnetisk resonans visar stor klinisk lovande för bedömning av kritiska biokemiska processer i realtid. På grund av fundamentala begränsningar av den hyperpolariserade tillstånd, exotiska bild- och återuppbyggnads tekniker som vanligen används. kritiskt behövs ett praktiskt system för karakterisering av dynamiska, multispektrala avbildningsmetoder. Ett sådant system måste reproducerbart rekapitulera de relevanta kemiska dynamiken i normala och patologiska vävnader. Den mest utnyttjade substrat hittills är hyperpolaris [1- ¹³ C] -pyruvate för bedömning av cancer metabolism. Vi beskriver en enzymbaserad fantomsystem som förmedlar omvandlingen av pyruvat till laktat. Reaktionen initieras genom injicering av den hyperpolariserade medlet i flera kamrar inom fantom, som var och en innehåller varierande koncentrationer av reagens som styr reaktionshastigheten. Flera fack är nödvändiga för att säkerställa att imaGing sekvenser troget fånga den rumsliga och metabolisk heterogenitet av vävnad. Detta system kommer att bidra till utveckling och validering av avancerade bild strategier genom kemisk dynamik som inte är tillgängliga från konventionella fantomer, samt kontroll och reproducerbarhet som inte är möjligt in vivo.

Introduction

Den kliniska effekten av hyper magnetisk resonanstomografi (MRT) av ¹³ C-märkta föreningar är kritiskt beroende på dess förmåga att mäta kemiska omvandlingsfrekvens genom realtid magnetisk resonansspektroskopi och spektroskopi avbildning ^1-5. Under sekvens utveckling och verifiering, är dynamisk kemisk omvandling i allmänhet uppnås genom in vivo eller in vitro-modeller ^6-9 som ger begränsad kontroll och reproducerbarhet. För robust test och kvalitetssäkring, skulle ett mer styrt system som bevarar den kemiska omvandlingen endemisk för denna mätning att föredra. Vi beskriva en metod för att uppnå denna omvandling på ett reproducerbart sätt med användning av en dynamisk inre enzym fantom.

De flesta studier med hyperpolariserade ¹³ C agenter fokus på avbildning hyperpolariserade substrat i en fungerande biologisk miljö. Detta är det självklara valet om målet är att studera biologisktal behandlar eller bestämma potential för påverkan på den kliniska vården. Men om karakterisering av något system eller mätdata algoritm önskas, biologiska modeller har många nackdelar, såsom inneboende rumsliga och tidsmässiga variationer ^10. Men konventionella statiska fantomer saknar kemisk omvandling som driver primära kliniska intresset för MRT av hyperpolariserade substrat, och kan inte användas för att karakterisera detektion av omräkningskurser eller andra dynamiska parametrar ^11. Med hjälp av en enda enzymsystem kan vi erbjuda kontrollerbar och reproducerbar kemisk omvandling, vilket möjliggör noggrann granskning av dynamiska avbildnings strategier.

Detta system riktar sig till utredare som utvecklar bildbehandling strategier för hyperpolariserade substrat och vill karakterisera prestanda för jämförelse mot alternativa tillvägagångssätt. Om statiska mätningar är den önskade slutpunkten då statisk ¹³ C-labled metabolit Phantoms wiräcka ll ^11. På den andra änden om mer komplexa biologiska karakterisering är kritisk för metoden (leverans, cellulär densitet, etc.) då faktiska biologiska modeller kommer att behövas ^12-14. Detta system är idealiskt för bedömning av avbildnings strategier som syftar till att ge ett kvantitativt mått på uppenbara kemiska omvandlingsfrekvens.

Protocol

OBS: (Phantom Design) Två 3 ml kammare bearbetades av Ultem och utrustade med PEEK slang (1,5875 mm OD och 0,762 mm ID) för injektion och avgaser. The Chambers placerades i ett 50 ml centrifugrör fylld med vatten (Fig 1). För att undvika signal tomrum som skapats av bubblor, har kamrarna och ledningarna förfylld med avjoniserat vatten (dH ₂ O).

1. Lösning Beredning

1. Förbereda en L-buffertlösning (81,3 mM Tris, pH 7,6, 203,3 mM NaCl). Väg ut 11,38 g TRIZMA förinställda kristaller pH 7,6 och 11,88 g NaCl och lös i 1 liter dH ₂ O.
2. Förbered 50 mM NADH-lösning. Väg upp 17,8 mg av β-nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH), reducerad dikaliumsalt och lös upp i 280 | il av buffertlösningen som framställdes i steg ett.
3. Förbered 250 U / ml enzymlösning. Väg upp 78,75 aktivitetsenheter laktatdehydrogenas (LDH) och lös upp i 315 pl buffert från sTep en.
4. Förbereda pyrudruvsyra mix. Väg upp 21,4 mg Ox063 trityl radikal och lös upp i 1,26 g (~ 1 ml) [1- ¹³ C] pyrudruvsyra.
5. Förbereda upplösningsmedia (40 mM Tris pH 7,6, 40 mM NaOH, 0,27 mM EDTA och 50 mM NaCl). Väg upp 5,96 g Trizma förinställda kristaller pH 7,6, 1,6 g NaOH, 0,1 g etylendiamintetraättiksyra-dinatriumsalt DEHYDRERA (EDTA) och 2,9 g NaCl och lös i 1 L dH ₂ O.
6. Förbereda 01:10 gadoteridol-lösning (50 mM). Blanda 1 pl gadoteridol i 9 pl dH ₂ O. Framställning av 8 M ^[13 C] urea. Väg upp 1,465 5 ^[13 C] urea och lös i 3 ml dH ₂ O.

2. Framställning av hyper Pyruvat

1. I en provkopp för en dynamisk Nuclear Polarization (DNP) system pipett 0,3 pl av gadoteridol lösning och 13 mg (~ 10 l) av pyrodruvsyralösningen.
2. rör korthet denna blandning i provkoppen med pipettspetsen. </ Li>
3. Sätt provet i DNP-systemet.
   1. Säkerställa dörren till DNP-systemet är stängt. Börja provinföringsprocessen genom att klicka på prov knappen Infoga på DNP systemkonsolen. På prov guiden välj normal prov och tryck nästa.
   2. Att hålla provkoppen vertikala försiktigt placera insättningsstång över toppen av provkoppen. När du uppmanas att öppna DNP systemet och sätt bägaren i insatsen variabel temperatur (VTI) med hjälp av införingsstången.
   3. Dra på kolven vid slutet av provinföringsstången för att frigöra provet i indexet temperatur. Avlägsna provinföringsstången från systemet och klicka på nästa knappen på DNP systemkonsolen.
4. Starta polarisering.
   1. Klicka på start polarisering knappen på DNP systemkonsolen. I RINMR programvara typ .HYPERSENSENMR att lansera polarisering övervakning programvara. Ställ bygga upp konfigurationen till en och tryck enter. Klicka sedan fast bygga us.
   2. Ange platsen och namnet på sparfilen. Välj profil för 13-C i rullgardins fliken på DNP systemkonsolen och klicka på Nästa. Markera kryssrutan för att ta prov under uppbyggnaden, ställa provtid på 300 sekunder och klicka finish.
5. Mäta upp 3,85 g (~ 4 ml) av upplösningsmedia, antingen genom volym med en 5 ml spruta eller av vikten med användning av en skala.

3. Beredning av Enzym Phantom

1. Fyll en mikrocentrifugrör med ~ 3 ml ^[13 C] urealösning och placera den i 50 ml centrifugrör. Fylla 50 ml centrifugrör med dH ₂ O.
2. Pre-fylla två enzymkammare och linjerna med dH ₂ O genom att injicera ~ 3 ml dH ₂ O i injektions raderna i fantom, var noga med att spola eventuella bubblor bildas.
3. Placera fantom i mitten av magneten med enkel tillgång till insprutningsledningarna. Se till att det finns en viss container för att fånga den vätska som kommer ventilera ut till t han avgasledningen.
4. Förbered hög aktivitet enzymblandning (17,14 mM NADH, 44,57 U / ml LDH). Blanda 240 l NADH lösning, 125 pl LDH lösning och 335 pl buffert och hålla i en 3 ml spruta som kan fästas på insprutningsledningen.
   ANMÄRKNING: När kombineras med 500 ul av 40 mM pyruvat från DNP-system, kommer den slutliga fantomvolymen vara 1,2 ml med koncentrationer av 16,7 mM pyruvat, 10 mM NADH, och 26 U / L LDH i en tris-buffrad lösning med pH ~ 7,5.
5. Förbered låg aktivitet enzymblandning (17,14 mM NADH 26,79 U / ml LDH) Blanda 240 pl NADH lösning, 75 pl LDH lösning och 385 pl buffert och hålla en separat 3 ml spruta som kan fästas på insprutningsledningen.
   OBS: När kombinerat med 500 pl 40 mM pyruvat från DNP systemet slutliga fantomvolymen kommer att vara 1,2 ml med koncentrationer av 16,7 mM pyruvat, 10 mM NADH och 15,625 U / L LDH i en tris-buffrad lösning med pH ~ 7,5 .

jove_title "> 4. Kör Alla kvalitetssäkring (QA) och Positionering Scans

1. Initial positionering.
   1. Ladda en ny FLASH positionering scan i driftläge ^[1 H] TX / RX Volym läge. Ändra inrättats dimensioner 2: Spektrometer Control Tool -> Redigera GS -> Inställningar Mått -> 2. Tryck GSP på spektrometern kontroll och flytta fantom tills centrerad i magneten. Tryck på STOP sedan Tryck GOP på spektrometern Control.
2. Pilot Scan.
   1. Ladda en ny TriPiolt positionering scan i driftläge ^[1 H] TX / RX Volym läge. Position skiva: Scan Control -> Slice Tool-> flytta skivor (håll M knappen klicka och dra, välj skiva för att flytta med paketet reglaget skiva).
   2. Wobble ^1H Coil: Spectrometer Control Tool -> Förv -> vingla. Tune och matcha ^en H spole bakom magneten och tryck på STOP. Håll shift-tangenten trycker trafikljuset på skanningskontrollfönstret.

1. Ladda en ny radial eko plan spektroskopiska imaging (radEPSI) scanna in driftläge ^[13 C] TX / RX Volym läge. Position skiva: skiva Tool på Scan kontroll och flytta skivor (håll M knappen klicka och dra, välj skiva för att flytta med paketet reglaget skiva).
2. Wobble ¹³ C Coil genom att klicka Spectrometer Control Tool -> Förv -> Wobble. Ställ mottagaren vinst för 1000-2000 på spektrometern.
3. Utför slutliga systemkontroll. Beroende på sekvensen, observera kol-13 signal från ureakammaren i en scout protokoll.
   OBS: Detta säkerställer att systemet är korrekt inställd innan den irreversibla upplösningsprocessen.

6. Kör Upplösning

1. När pyruvat uppnått> 90% polarisering (~ 1 tim), lösningar och fantom är redo, och skanningen är konfigurerad klickar körningen upplösningsknappen på DNP syhejda konsol.
2. När du uppmanas att flytta upplösnings stick i arbetsställning och injicera lösningsmedia. Stäng DNP systemet och klicka på färdiga knappen på DNP systemkonsolen. Flytta upplösning stick tillbaka till viloläge när du uppmanas klicka på finish.
3. När DNP systemet levererar hyper pyruvat (~ 2 minuter efter uppvärmning startar) återkalla 500 pl av pyruvat lösning i varje hög och låg enzymkoncentration lösning sprutor. Långsamt (~ 10 sek) injicera varje spruta till en injektion linje.
   OBS: Scanning kunde ha inletts före injektion eller när som helst upp till tre minuter efter injektionen beroende på skannings protokoll som används.

7. Bildbehandling

OBS: Denna fantom har utformats för användning med många avbildnings strategier. Se figur 2, som ett exempel på hur Rad-EPSI bilder bearbetades med hjälp av Matlab.

1. Ladda rådata från fid filen. Reshape data för att matcha antalet projektioner, läsa ut punkter, ekon och redogöra för data som lagras som reella och imaginära par. Separera ut de jämna och udda echo punkter.
2. Fouriertransformen antingen jämna eller udda ekon längs eko dimensioner. identifiera visuellt frekvensbanden för pyruvat och laktat. För enkelhets skull det absoluta värdet av spektrumet användes.
3. Separera varje metabolit band och Fouriertransformen längs frekvens koda riktning för att ge isolerade sinogram för varje metabolit. Invers radon omvandla separata sinogram att producera bilden av antingen laktat eller pyruvat.

Representative Results

Slice-selektiva 2D-bilder förvärvades med hjälp av en ögonblicksbild radEPSI sekvens. Metaboliten bilder rekonstruerades med hjälp filtreras tillbaka projektion. Metaboliten bilderna väl i linje med proton bilder, som visas i figur 2. I detta system hyperpolariserad laktat signal endast kan genereras från den enzymatiska omvandlingen av hyper pyruvat. I figur 4, den nedre kammaren, med högre LDH koncentration, har en starkare laktat och svagare pyruvat signalen jämfört med den övre kammaren. Använda relativa metabolit signaler som en uppskattning av enzymkoncentrationen laktat till pyruvat kvoten är 1,47 gånger högre i den nedre kammaren. Det faktiska förhållandet enzymkoncentration mellan de nedre och övre utrymmena var 1,66 gånger vilket är i hårt samförstånd med de signalförhållanden (figur 4).

Tidsförloppet bilderna var genenbetygsatt med hjälp av en IDEAL sekvens (Figur 3). Stark överenskommelse mellan metabolit bilder och proton referens återigen observeras. Observera att ingen urea fantom var närvarande för denna studie. I hög enzymkammaren till höger, är en mycket stark initial laktat signal observeras. Reaktionen var nästan helt katalyseras av leveranstiden i kammaren (9 sek leverans, 12 sek topp laktat). Reaktionen gått långsammare i koncentrationskammaren låg enzym (till vänster). Det är också anmärkningsvärt att mindre pyruvat signal observerades i den höga enzymkammaren som mer av signalen omvandlas till laktat.

Figur 1. Schematisk Phantom: (A) Diagram som visar kammaren design. Chambers A och B monterade för injektioner och avgasledningar. Urea kammaren förseglas eftersom den inte behöver injiceraed under förvärv. (B) Bild av isär fantom visar kamrarna, insprutningsledningar och 50 ml rör. (C) Den sammansatta fantomsystem med injektions linjer virad runt så sprutan kontakterna i slutet av linjerna är i ramen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. metabolit bilder med hjälp rad-EPSI. Frontala bilder som genereras från två separata spektralband, pyruvat (mitten) och laktat (höger). Den övre kammaren har märkbart mer pyruvat signal och mindre laktat signal än den nedre kammaren. En proton bild (vänster) förvärvades efter avbildning hyperpolariserade medel. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. kurs bilder metabolit tid med en perfekt sekvens. Axial bilder i denna serie förvärvades 3-sek intervall. Pyruvat (överst) och laktat (nederst) visas över gråskala proton bilden. Stark laktat och svagare pyruvat signaler observeras i den högra kammaren som innehåller högre enzymkoncentrationen. Den vänstra kammare, med lägre enzymkoncentration, visade mindre laktat och starkare pyruvat signal. Kamrarna är ogiltiga av hyper signal för första nio sekunder eftersom genomsökningen inleddes före injektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4 "src =" / filer / ftp_upload / 53.607 / 53607fig4.jpg "/>
Figur 4. bearbetade bilderna: Den genomsnittliga signalstorlekar för varje kammare visas under de kombinerade metabolit bilder (vänster). Skillnaden i laktat till pyruvat förhållanden för de övre och undre kammare kvalitativt motsvarar skillnaden i enzymaktiviteter som används, visas som stapeldiagram (höger).

Discussion

Realtids avbildning av hyperpolariserade metaboliter har många unika utmaningar för sekvens konstruktion, validering och kvalitetskontroll. Förmågan att lösa Spatiotemporal och spektral heterogenitet ger betydande kliniska potentialen men utesluter QA och valideringsmetoder i samband med konventionell MRI. Komplexa avbildningssekvenser eller rekonstruktionsalgoritmerna kan ha subtila beroenden som gör dem svåra att karakterisera eller validera utanför bild experimentet. Biologisk heterogenitet och andra praktiska problem begränsar användningen av in vivo och in vitro-modeller för att karakterisera eller validera sekvenser, hårdvara eller databearbetningsalgoritmer.

Med flera rumsliga fack och dynamisk kemiska utvecklingen, är det möjligt att sammanfatta de kritiska funktioner i samband med avbildning hyperpolariserade substrat in vivo men på ett kontrollerat sätt. Områden med hög och låg enzymaktivitet ger reproducible dynamisk kontrast för bedömning av kvalitativa och kvantitativa imaging biomarkörer. Rumsliga variationer säkerställa geometriska förvrängningar, felinriktningar och andra vanliga felkällor redovisas på rätt sätt.

Medan mer kontrollerbar än levande system reaktionshastigheterna katalyseras av LDH är fortfarande mycket känsliga experimentella betingelser och är en stor källa till osäkerhet. Kritiskt, är LDH känslig för temperatur. Om efterföljande mätningar ska jämföras stor försiktighet måste iakttas så att rummet och vätsketemperaturer förblir konstant över alla mätningar. Dessutom de höga koncentrationerna av pyruvat i samband med hyperpolariserade studier tvingar användning av höga koncentrationer av coenzym NADH och enzymet LDH. Dessa höga koncentrationer i allmänhet inte tillåter antaganden om liten eller ingen enzymhämning eller ett speciellt substrat är i överskottskoncentration. Om rigorös karakterisering av kemisk kinetik önskades sannoliktskillnads koncentrationer av reagens skulle behövas för att återvinna dessa antaganden. Dock kommer denna formulering resulterar i produktion av hyper laktat till rörlig ränta i varje fack som bör vara tillräckligt för de flesta avbildning validering.

Om lite eller ingen laktat signalen observeras en första plats för att kontrollera skulle vara aktiviteten hos enzymet, som kan behöva bytas ut. Dessutom variation i leverans i fantom facken skapar osäkerhet i mängden hyper signal. För att minska dessa källor till variabilitet är det kritiskt att mängden av hyperpolariserad pyruvat tillsätts till varje kammare mäts noggrant och den tillsätts jämnt. Den inneboende signal förfall hyper pyruvat komplicerar denna uppgift genom att strikta tidsgränser på injektionen. Framtida arbete kommer att inriktas på att genomföra en automatisk injektionsmekanism som gör det möjligt för processen för hyper pyruvat introduktion till enzymblandningenoch efterföljande injektion i fantom att maskinen kontrolleras. Detta system kommer att ta bort mänskliga fel vid mätning av mängden pyruvat tillsätts till varje kammare samt öka hastigheten för leverans till skannern. Särskilt den hyperpolariserade pyruvat drogs tillbaka in i sprutor innehållande enzymblandningen innan hela volymen injicerades in i kamrarna. Detta gjordes för att låta injektionsprocessen för att underlätta blandning av pyruvat med enzymblandningen. En begränsning med denna metod är att reaktionen av pyruvat till laktat initieras innan blandningen är i skannern och därför den tidiga delen av reaktionen inte mäts. Framtida förfining av kammarens utformning syftar till att tillåta kamrarna att förfylld med enzymblandningen och endast den hyperpolariserade pyruvat injiceras samtidigt säkerställa tillräcklig blandning av kammarinnehållet som pyruvat anländer.

Jämfört med statiska fantomer detta system har vissa begränsningar. dependence på några dynamiska kemisk reaktion begränsar dessa fantomer till engångsbruk. Efter injektion linjer och kammare måste rengöras och färska reagenslösningar kommer att behöva användas, eller tinade från alikvoter. Medan enda enzym fantom fångar några av dynamisk kemiskt beteende det inte troget rekapitulera en verklig biologisk system. I levande system pyruvat är inblandad i flera komplexa biokemiska vägar och enkel omvandling av pyruvat till laktat i närvaro av co-enzym med en enda enzymatisk isoform är en betydande förenkling. Dessutom, om vaskulära eller någon annan form av leverans samt någon typ av cellulärt upptag är kritiska för mätningen detta system kommer sannolikt att vara en otillräcklig modell. Den enda enzym Phantom är en kompromiss som fokuserar på någon kemisk reaktion, är det inte så repeterbar eller praktiskt som en statisk fantom men är ännu mer repeterbar att levande system. Reproducerbarheten hos detta system kännetecknas by variation i upprepade mätningar av 15 till 20 procent i jämförelse med djurstudier som har mellan 25 till 40 procent inom gruppen variabilitet ^10. Dessutom är det inte modellera varje aspekt av levande celler eller vävnad, men bibehåller den kritiska dynamiska beteende som går förlorad när man använder en statisk fantom.

Denna fantom Systemet har utformats för att arbeta med en rad olika avbildningstekniker. Med en sådan flexibel plattform QA skannar och hyperpolariserade förvärv utförs ovan är utbytbara med sekvensen eller protokoll som används av en annan institution. För att illustrera detta har vi genomfört en liknande studie på en GE 3T scanner med en anpassad IDEAL sekvens med liknande resultat.

Hyper MRT av [1- ¹³ C] -pyruvate visar mycket lovande på grund av dess förmåga att sondera in vivo cancermetabolism i realtid. Intressant, känsligheten av denna teknik innebär en stor utmaning när man utvecklar eller validera measurement tekniker. Med hjälp av en enda enzym fantom det är möjligt att återskapa den rumsliga och tidsmässiga dynamik som är avgörande för mätning av hyperpolariserade medel genom MRI i en praktisk, kontrollerbar och repeterbart sätt som krävs för att vara användbar för utveckling och verifiering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioSpect 7T	Bruker	BioSpec 70/30 USR	7 Tesla Pre-Clinical MRI Scanner
HyperSense	Oxford Instruments	Hypersense DNP Polarizer	Dynamic Nuclear Polarizer for MRI agents
1-13C-Pyrvic Acid	Sigma Aldrich	677175	Carbon 13 labled neat pyruvic acid
Trityl Radical	GE Healthcare	OX063	Free radical used in Dynamic Nuclear Polarization
NaOH	Sigma Aldrich	S8045
EDTA	Sigma Aldrich	E6758	Ethylenediaminetetraacetic acid
LDH	Worthingthon	LS002755	Lactate Dehydrogenase from rabbit muscle
NADH	Sigma Aldrich	N4505	β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced dipotassium salt
Trizma	Sigma Aldrich	T7943	Trizma Pre-set crystals
NaCl	Sigma Aldrich	S7653