Bruk av en Multi-kupé Dynamic enkelt enzym Phantom for studier av Hyperpolariserte magnetisk resonans Agents

Abstract

Imaging av Hyperpolariserte substrater av magnetisk resonans viser stor klinisk løftet for vurdering av kritiske biokjemiske prosesser i sanntid. På grunn av grunnleggende begrensninger pålagt av hyperpolarized staten, er eksotiske bildebehandling og gjenoppbygging teknikker som vanligvis brukes. En praktisk system for karakterisering av dynamiske, multi-spektrale avbildningsmetoder er kritisk nødvendig. Et slikt system må reproduserbart repetere de aktuelle kjemiske dynamikken i normale og patologiske vev. Den mest anvendte substrat hittil er hyperpolarized [1- ¹³ C] -pyruvate for vurdering av kreft metabolisme. Vi beskriver en enzymbasert fantom system som formidler omdannelsen av pyruvat til laktat. Reaksjonen blir initiert ved injeksjon av den hyperpolariserte middel i flere kamre inne i fantom, som hver inneholder varierende konsentrasjoner av reagenser som kontrollerer reaksjonshastigheten. Flere rom er nødvendig for å sikre at imavoksende sekvenser trofast fange den romlige og metabolsk heterogenitet av vev. Dette systemet vil bidra til utviklingen og validering av avanserte bilde strategier ved å tilveiebringe kjemiske dynamikk som ikke er tilgjengelig fra konvensjonelle fantomene, samt kontroll og reproduserbarhet som ikke er mulig in vivo.

Introduction

Den kliniske betydningen av hyperpolarized magnetic resonance imaging (MRI) av ¹³ C-merkede forbindelser er kritisk avhengig av dens evne til å måle kjemiske omregningskursene gjennom sanntid magnetisk resonans spektroskopi og spektroskopiske avbildning ^1-5. Under sekvens utvikling og kontroll, er dynamisk kjemisk omdannelse vanligvis oppnås ved in vivo eller in vitro-modeller ^6-9 som gir begrenset kontroll og reproduserbarhet. For robust testing og kvalitetssikring, ville en mer kontrollert system som bevarer den kjemiske omdannelse endemisk til denne målingen blir foretrukket. Vi skissere en metode for å oppnå denne omdannelse på en reproduserbar måte ved hjelp av en dynamisk enkelt enzym fantom.

De fleste studier med Hyperpolariserte ¹³ C agenter fokusere på bildebehandling Hyperpolariserte underlag i et fungerende biologiske miljøet. Dette er det opplagte valget hvis målet er å studere biologiskal behandler eller bestemme potensialet for innvirkning på klinisk arbeid. Imidlertid, hvis karakterisering av noen målesystem eller databehandlingsalgoritmen er ønskelig, biologiske modeller har en rekke ulemper som iboende romlig og tidsmessig variabilitet ^10. Konvensjonelle statiske fantomer mangler den kjemiske omdannelse som driver den primære klinisk interesse i MR av Hyperpolariserte substrater, og kan ikke brukes til å karakterisere detektering av konverteringsfrekvenser eller andre dynamiske parametere ^11. Ved hjelp av en enkelt enzym system kan vi gi kontrollerbar og reproduserbar kjemisk konvertering, slik grundig undersøkelse av dynamiske bilde strategier.

Dette systemet er rettet mot forskere som utvikler bilde strategier for Hyperpolariserte underlag og ønsker å karakterisere ytelsen for sammenligning mot alternative tilnærminger. Hvis statiske målinger er ønsket endepunktet så statisk ^13C-stemplet metabolitt phantoms will nok ^11. På den andre enden hvis mer komplekse biologiske karakterisering er kritisk for fremgangsmåten (levering, cellulær tetthet, etc.) og deretter faktiske biologiske modeller vil være nødvendig ^12-14. Dette systemet er ideelt for vurdering av bilde strategier som tar sikte på å gi et kvantitativt mål for åpen kjemisk konverteringsfrekvenser.

Protocol

MERK: (Phantom Design) To 3 ml kamrene ble frest ut av Ultem og utstyrt med PEEK rør (1,5875 mm OD og 0,762 mm ID) for injeksjon og eksos. De Chambers ble plassert i et 50 ml sentrifugerør fylt med vann (figur 1). For å unngå signal hulrom laget av bobler, ble kamrene og linjene forhåndsfylt med avionisert vann (dH ₂ O).

1. Løsning Forberedelse

1. Fremstille en l-buffer-oppløsning (81,3 mM Tris pH 7,6, 203,3 mM NaCl). Vei ut 11,38 g Trizma forhånds krystaller pH 7,6 og 11,88 g NaCl og oppløses i en L av dH ₂ O.
2. Forbered 50 mM NADH løsning. Veie ut 17,8 mg av β-nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH), redusert dikaliumsaltet og oppløses i 280 mL av bufferløsningen som ble fremstilt i trinn en.
3. Forbered 250 U / ml enzymløsning. Vei opp 78,75 aktivitetsenheter av laktat dehydrogenase (LDH) og løses i 315 mL buffer fra sTep en.
4. Forbered pyrodruesyre mix. Veie ut 21,4 mg Ox063 trityl radikal og oppløses i 1,26 g (~ 1 ml) [1- ^13C] pyrodruesyre.
5. Forbered oppløsning media (40 mM Tris pH 7,6, 40 mM NaOH, 0,27 mM EDTA og 50 mM NaCl). Vei ut 5,96 g Trizma forhåndsinnstilte krystaller pH 7,6, 1,6 g NaOH, 0,1 g etylendiamintetraeddiksyre dinatriumsalt dehydrate (EDTA) og 2,9 g NaCl og oppløses i 1 L dH ₂ O.
6. Forbered 01:10 gadoteridol løsning (50 mm). Bland 1 mL av gadoteridol i 9 mL av dH ₂ O. Fremstilling av 8 M ^[13C] urea. Veie ut 1,465 5 ^[13C] urinstoff og oppløses i 3 ml dH ₂ O.

2. Utarbeidelse av hyperpolarized Pyruvate

1. I en prøvekopp for en dynamisk Nuclear Polarisering (DNP) system, pipette 0,3 ul av gadoteridol oppløsningen og 13 mg (~ 10 mL) av den pyrodruesyreløsning.
2. Kort fortalt røre denne blandingen i prøvekoppen med pipettespissen. </ Li>
3. Sett prøven inn i DNP-systemet.
   1. Sørg for at døren til DNP systemet er lukket. Begynn prøven innsettingsprosessen ved å klikke innsatsen sample-knappen på DNP systemkonsollen. På prøven veiviseren velg normal prøve og trykk neste.
   2. Holde prøvekoppen vertikale forsiktig plassere innsettings stang over toppen av prøvekoppen. Når du blir bedt, åpner DNP-systemet og sette koppen inn i variabel temperatur innsatsen (VTI) ved hjelp av innsetting stang.
   3. Trekk på stempelet ved slutten av prøven innføringsstanga for å frigjøre prøven i variabel temperatur indeksen. Fjern prøven innføringsstanga fra systemet, og klikk på Neste-knappen på DNP systemkonsollen.
4. Initiere polarisering.
   1. Klikk på start polarisering knappen på DNP systemkonsollen. I RINMR programvaren typen .HYPERSENSENMR å lansere polarisering avlytting programvare. Sett bygge opp konfigurasjonen til en og trykk enter. Klikk deretter solid build us.
   2. Angi plassering og navn på lagre filen. Velg profilen for 13-C i rullegardinfanen på DNP systemkonsollen og klikk på Neste. Kryss av i boksen for å prøve under oppbygging, sett prøvetiden til 300 sek og klikk finish.
5. Måle ut 3,85 g (~ 4 ml) av oppløsningsmedier, enten i volum med en 5 ml sprøyte eller ved vekt ved hjelp av en skala.

3. Utarbeidelse av enzymet Phantom

1. Fyll en mikro tube med ~ 3 ml ^[13 C] urea løsning og plassere den i 50 ml sentrifugerør. Fyll 50 ml sentrifugerør med dH ₂ O.
2. Forhånds fylle de to enzym kamre og linjene med dH ₂ O ved å injisere ~ 3 ml dH ₂ O til injeksjonslinjer fantomet, ta vare å skylle noen bobler dannes.
3. Plasser fantom i sentrum av magneten med lett tilgang til injeksjonslinjer. Sørg for at det er noen container for å fange væsken som skal ventilere ut til t han eksos linje.
4. Forbered høy aktivitet enzymblanding (17,14 mM NADH, 44.57 U / ml LDH). Bland 240 ul NADH-oppløsning, 125 pl LDH-løsning og 335 pl buffer og holde i en 3 ml sprøyte som kan være festet til injeksjonslinjen.
   Merk: Når kombinert med 500 pl av 40 mM pyruvat fra DNP-systemet, vil det endelige fantom volum være 1,2 ml med konsentrasjon av 16,7 mM pyruvat, 10 mM NADH, og 26 U / l LDH i en tris-bufret løsning med pH ~ 7,5.
5. Forbered lav aktivitet enzymblanding (17,14 mM NADH 26,79 U / ml LDH) Bland 240 ul NADH-oppløsning, 75 pl LDH-løsning og 385 pl buffer og holde i en separat 3 ml sprøyte som kan være festet til injeksjonslinjen.
   MERK: Når kombinert med 500 mL av 40 mM pyruvat fra DNP system slutt fantom volumet vil være 1,2 ml med konsentrasjoner av 16,7 mM pyruvat, 10 mM NADH og 15,625 U / L LDH i en tris bufret løsning med pH ~ 7,5 .

jove_title "> 4. Kjør Enhver Quality Assurance (QA) og posisjonering Skanner

1. Initial posisjonering.
   1. Legg i en ny FLASH posisjonering scan i driftsmodus ^[1 H] TX / RX Volume modus. Endre satt opp dimensjoner til to: Spectrometer Control Tool -> Rediger GS -> Setup Dimensjoner -> 2. Trykk GSP på Spectrometer Kontroll og flytte fantom til sentrert i magneten. Trykk STOP deretter trykk GOP på Spectrometer Control.
2. Pilot Scan.
   1. Legg i en ny TriPiolt posisjonering scan i driftsmodus ^[1 H] TX / RX Volume modus. Stilling Slice: Scan Control -> Slice Verktøy-> flytte skiver (hold M tasteklikk og dra, velg skive å flytte med stykket pakken glider).
   2. Wobble ^en H Coil: Spectrometer Control Tool -> ACQ -> Wobble. Tune og kamp ^1H spole bak magneten og trykk på STOP. Mens du holder shift-tasten trykker lyskrysset på skannekontrollvinduet.

1. Legg i en ny radial ekko planar spektroskopiske imaging (radEPSI) skanne i driftsmodus ^[13 C] TX / RX Volume modus. Stilling Slice: Slice Tool på Scan-kontroll og flytte skiver (hold M tasteklikk og dra, velg skive å flytte med stykket pakken glider).
2. Wobble ^13C Coil ved å klikke Spectrometer Control Tool -> ACQ -> Wobble. Still mottakeren gevinst til 1000-2000 på Spectrometer.
3. Utfør den endelige systemsjekk. Avhengig av sekvensen observerer karbon-13-signalet fra urea kammeret i en speider protokoll.
   MERK: Dette sikrer at systemet er satt opp skikkelig før du begynner irreversible oppløsningsprosessen.

6. Kjør Oppløsning

1. Når pyruvat har oppnådd> 90% polarisering (~ 1 time), løsningene og fantom er klare, og søket er konfigurert klikk rømmen oppløsning knappen på DNP system konsollen.
2. Når du blir bedt om å flytte oppløsning pinne inn i sin arbeidsstilling og injisere oppløsningen media. Lukk DNP system og klikk den ferdige knappen på DNP systemkonsollen. Flytt oppløsning pinne tilbake til hvilestilling når du blir bedt klikk deretter finish.
3. Når DNP systemet gir den hyperpolariserte pyruvat (~ 2 min etter oppvarming starter) ta ut 500 ul av pyruvat løsningen i hver de høye og lave enzymkonsentrasjon løsnings sprøyter. Langsomt (~ 10 sek) injisere hver sprøyte inn i en injeksjonsledning.
   MERK: Skanning kan ha blitt satt i gang før injeksjon eller når som helst opp til 3 minutter etter injeksjonen, avhengig av skanne protokollen som brukes.

7. Bildebehandling

MERK: Denne fantom er designet for bruk med mange bilde strategier. Se figur 2, som et eksempel på hvordan rad-EPSI bildene ble behandlet ved hjelp av Matlab.

1. Last rådata fra fid fil. Reshape dataene for å matche antall projeksjoner, lese ut poeng, ekko og konto for data som er lagret som reelle og imaginære par. Skille ut de like og ulike ekko poeng.
2. Fourier transform enten partall eller oddetall ekko langs ekko dimensjoner. Visuelt identifisere frekvensbånd for pyruvat og laktat. For enkelthets skyld den absolutte verdi av spekteret ble anvendt.
3. Skill metabolitt band og Fourier transform langs frekvens kode retning for å gi isolerte sinograms for hver metabolitt. Inverse radon forvandle de separate sinograms å produsere bilde av enten laktat eller pyruvat.

Representative Results

Slice-selektive 2D-bilder ble ervervet ved hjelp av et øyeblikksbilde radEPSI sekvens. Metabolitt bildene ble rekonstruert ved hjelp av filtrert tilbakeprojeksjon. De metabolitt Bildene ble helt i tråd med proton bilder, som vist i figur 2. I dette system hyperpolariserte laktat signal bare kan genereres av den enzymatiske omdannelse av hyperpolariserte pyruvat. I figur 4 i bunnkammeret, med høyere LDH-konsentrasjon, har en sterkere laktat og pyruvat svakere signal i forhold til det øvre kammeret. Ved å bruke de relative metabolitt-signaler som en estimert enzymkonsentrasjon på laktat til pyruvat-forholdet er 1,47 ganger høyere i det nedre kammer. Selve enzymkonsentrasjon forholdet mellom de nedre og øvre kamre var 1,66 ganger som er stort sett i overensstemmelse med signalforhold (figur 4).

Tidsforløpet bildene ble genetvurdert å bruke en IDEAL sekvens (figur 3). Sterk avtale mellom metabolitt bilder og proton referansen ble igjen observert. Legg merke til at ingen urea fantom var til stede for denne studien. I høy enzymkammeret til høyre, er et meget sterkt start laktat signal observert. Reaksjonen ble nesten helt katalysert av den tiden det ble levert inn i kammeret (9 sek levering, 12 sek peak laktat). Reaksjons kommet mer langsomt i lav enzymkonsentrasjon kammer (til venstre). Det er også bemerkelsesverdig at mindre pyruvat signal ble observert i høy enzymkammeret som mer av det signal som ble omdannet til laktat.

Figur 1. Skjematisk Phantom: (A) Diagram som viser kammerets design. Chambers A og B montert for injeksjoner og eksos linjer. Ureakammeret er forseglet som det ikke nødvendig å injisereed under oppkjøpet. (B) Bilde av demontert fantom viser kamrene, injeksjonslinjer og 50 ml tube. (C) Den sammensatte fantom system med injeksjons linjer pakket rundt slik at sprøyte kontaktene på slutten av linjene er i rammen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Metabolittkonsentrasjoner bilder ved hjelp av rad-EPSI. Koronale bilder generert fra to separate spektrale bånd, pyruvat (i midten) og laktat (til høyre). Den øverste kammeret har merkbart mer pyruvat signal og mindre laktat signal enn bunnkammeret. Et proton bilde (venstre) ble ervervet etter bildebehandling Hyperpolariserte midler. Vennligst Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. metabolitt tidsforløps bilder ved hjelp av en IDEAL sekvens. Axial Bildene i denne serien ble kjøpt opp i 3-sek intervaller. Pyruvat (øverst) og laktat (nederst) vises over gråtoner proton bildet. Sterk laktat og pyruvat svakere signaler blir observert i det høyre kammer som inneholder den høyere enzymkonsentrasjon. Den venstre kammer, med lavere enzymkonsentrasjon, viste mindre laktat og sterkere pyruvat signal. Kamrene er blottet for hyperpolarized signal for første 9 sek fordi skanningen ble igangsatt før injeksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4 "src =" / files / ftp_upload / 53607 / 53607fig4.jpg "/>
Figur 4. Behandlet Bilder: De gjennomsnittlige signalstørrelsene for hvert kammer vist i løpet av de kombinerte metabolitt bilder (til venstre). Forskjellen i laktat til pyruvat-forhold for den øvre og nedre kamre kvalitativt sams forskjellen i enzymaktivitet anvendes, vist som søylediagrammer (til høyre).

Discussion

Sanntid avbildning av Hyperpolariserte metabolitter har mange unike utfordringer for sekvens design, validering og kvalitetskontroll. Evnen til å løse spatiotemporal og spektral heterogenitet tilbyr betydelig klinisk potensial, men utelukker QA og validerings metoder forbundet med konvensjonell MRI. Komplekse bildesekvenser eller rekonstruksjonsalgoritmer kan ha subtile avhengigheter som gjør dem vanskelig å karakterisere eller validere utenfor bilde forsøket. Biologisk heterogenitet og andre praktiske bekymringer begrense bruken av in vivo og in vitro modeller for å karakterisere eller validere sekvenser, maskinvare eller databehandling algoritmer.

Med flere romlige lommer og dynamisk kjemisk utvikling, er det mulig å rekapitulere kritiske funksjoner i forbindelse med avbildning Hyperpolariserte substrater in vivo, men på en kontrollert måte. Regioner med høy og lav enzymaktivitet gi reproduserbarhetbart dynamisk kontrast for vurdering av kvalitative og kvantitative bilde biomarkører. Romlige variasjoner sikre geometriske forvrengninger, forskyvninger og andre vanlige feilkilder regnskapsføres riktig.

Mens mer kontrollerbar enn å leve systemer reaksjonshastighetene katalysert av LDH er fortsatt svært sensitive eksperimentelle forhold, og er en viktig kilde til usikkerhet. Kritisk, er LDH følsom for temperatur. Hvis påfølgende målinger skal sammenlignes stor forsiktighet må tas for at rommet og flytende temperaturene forblir konstant over alle målinger. I tillegg til høye konsentrasjoner av pyruvat forbundet med Hyperpolariserte studier tvinger anvendelse av høye konsentrasjoner av koenzym NADH og enzymet LDH. Disse høye konsentrasjoner vanligvis ikke tillater forutsetningene for liten eller ingen enzyminhibering eller et bestemt substrat være i overskudd konsentrasjon. Hvis streng karakterisering av de kjemisk kinetikk var ønskelig sannsynligForskjellen konsentrasjoner av reagenser som ville være nødvendig for å utvinne disse forutsetninger. Imidlertid vil denne formuleringen resultere i produksjon av hyperpolarized laktat med flytende rente i hver avdeling som bør være tilstrekkelig for de fleste bilde validering.

Hvis lite eller ikke noe signal laktat er observert et første sted for å undersøke ville være aktiviteten til enzymet, noe som kanskje må byttes ut. I tillegg variasjon av leverings inn i de stiplede kamrene fører til usikkerhet i mengden av hyperpolariserte signal. For å redusere disse kildene til variasjon er det viktig at mengden av hyperpolariserte pyruvat tilsatt til hvert kammer måles nøyaktig, og det blir tilsatt jevnt. Den iboende signal forfall hyperpolarized pyruvat kompliserer denne oppgaven ved å plassere strenge tidsfrister på injeksjonen. Fremtidig arbeid vil fokusere på å implementere en automatisert injeksjon mekanisme som gjør at prosessen med hyperpolarized pyruvat introduksjon til enzymet blandingog påfølgende injeksjon i fantomet skal maskinen kontrollert. Dette systemet vil fjerne det menneskelige feil ved måling av mengden av pyruvat tilsatt til hvert kammer, samt øke hastigheten for levering til skanneren. Særlig av hyperpolariserte pyruvat ble trukket inn i sprøytene inneholdende enzymblanding før hele volumet ble injisert inn i kamrene. Dette ble gjort for å tillate injeksjonsprosessen for å hjelpe til å blande pyruvat med enzymblandingen. En begrensning ved denne metoden er at omsetningen av pyruvat til laktat blir initiert før blandingen er i skanneren og derfor den tidlige delen av reaksjonen ikke blir målt. Fremtid avgrensning av kammeret utforming tar sikte på å tillate kamrene være pre fylles med enzymblanding, og bare de hyperpolariserte pyruvat injisert samtidig sikre tilstrekkelig blanding av kammerinnholdet som pyruvat kommer.

Sammenlignet med statiske fantomer dette systemet har noen begrensninger. dependence på noen dynamisk kjemisk reaksjon begrenser disse fantomer til engangsbruk. Etter injeksjon linjene og kamrene vil måtte bli renset og frisk reagensoppløsninger vil måtte bli brukt, eller tint fra aliquoter. Mens enkelt enzym phantom fanger noen av dynamisk kjemisk oppførsel den ikke trofast rekapitulere en faktisk biologisk system. I levende systemer pyruvat er involvert i flere komplekse biokjemiske mekanismer og det enkle omdannelsen av pyruvat til laktat i nærvær av ko-enzym med en enkelt enzymatisk isoform er en betydelig forenkling. I tillegg, hvis vaskulær eller annen form for levering så vel som hvilken som helst type cellulært opptak er kritisk for måling av dette system vil sannsynligvis være utilstrekkelig modell. Den enkelt enzym fantom er et kompromiss som fokuserer på noen kjemisk reaksjon, er det ikke så repeterbare eller praktisk som en statisk fantom men er likevel mer repeterbar det levende systemer. Reproduserbarheten av dette systemet er kjennetegnet by variasjon i gjentatte målinger av 15 til 20 prosent i forhold til dyrestudier som har mellom 25 og 40 prosent innenfor gruppen variasjoner ^10. I tillegg det ikke modellere alle aspekter av levende celler eller vev, men opprettholder den kritiske dynamiske egenskapene som er tapt når du bruker en statisk fantom.

Dette fantom Systemet er designet for å operere med en rekke avbildningsteknikker. Med en slik fleksibel plattform QA skanner og Hyperpolariserte oppkjøp utført ovenfor er utskiftbare med sekvensen eller protokoller som brukes av en annen institusjon. For å illustrere dette har vi utført en tilsvarende studie på en GE 3T skanner ved hjelp av en tilpasset IDEAL sekvens med lignende resultater.

Hyperpolariserte MR av [1- ^13C] -pyruvate viser store løftet på grunn av sin evne til å undersøke in vivo kreft metabolisme i sanntid. Interessant, følsomheten av denne teknikken utgjør en stor utfordring når man utvikler eller validere måling utenent teknikker. Ved hjelp av en enkelt enzym fantom det er mulig å gjenskape de romlige og tidsmessige dynamikken som er kritiske til måling av Hyperpolariserte midler ved MR i en praktisk, kontrollerbar og repeat måte nødvendig å være nyttig for utvikling og verifisering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioSpect 7T	Bruker	BioSpec 70/30 USR	7 Tesla Pre-Clinical MRI Scanner
HyperSense	Oxford Instruments	Hypersense DNP Polarizer	Dynamic Nuclear Polarizer for MRI agents
1-13C-Pyrvic Acid	Sigma Aldrich	677175	Carbon 13 labled neat pyruvic acid
Trityl Radical	GE Healthcare	OX063	Free radical used in Dynamic Nuclear Polarization
NaOH	Sigma Aldrich	S8045
EDTA	Sigma Aldrich	E6758	Ethylenediaminetetraacetic acid
LDH	Worthingthon	LS002755	Lactate Dehydrogenase from rabbit muscle
NADH	Sigma Aldrich	N4505	β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced dipotassium salt
Trizma	Sigma Aldrich	T7943	Trizma Pre-set crystals
NaCl	Sigma Aldrich	S7653