Summary
כתב יד זה מתאר assay PCR דיגיטלית דופלקס, שניתן להשתמש בהם כדי לכמת spp אנטרוקוקוס זמנית. ואת סמנים גנטיים HF183 כאינדיקטורים לזיהום צואתי כללית אדם הקשורים במים פנאי.
Abstract
כתב יד זה מתאר assay PCR דיגיטלית דופלקס (EntHF183 dPCR) כימות סימולטני של spp אנטרוקוקוס. ואת סמן HF183 צואה הקשורים האדם. EntHF183 דופלקס dPCR (המכונה בשם EntHF183 dPCR hereon) assay משתמשת באותו רצפים פריימר בדיקה כמו PCR כמותי הפרט שפורסם שלה (qPCR) עמיתיהם. כמו כן, אותם הליכי סינון מי מיצוי DNA כפי שבוצע לפני qPCR הם אחריו לפני הפעלת dPCR. עם זאת, assay דופלקס dPCR יש מספר יתרונות על פני מבחני qPCR. החשוב ביותר, assay dPCR מבטל את הצורך לרוץ עקומת סטנדרט ומכאן, ההטיה הקשורה ולהבדלים, על ידי כימות ישיר של מטרותיה. בנוסף, בעוד להדפסה דו-צדדי (כלומר כימות סימולטני) אנטרוקוקוס ו HF183 ב qPCR מוביל לעתים קרובות הערכה נמוכה מדי חמורה של היעד השופע פחות במדגם, dPCR מספק כימות עקבית של המטרות הן, לגרותלה לכמת בנפרד או בו-זמנית באותו התגובה. את assay dPCR הוא גם מסוגל לסבול ריכוזי מעכב PCR כי הם אחד שני סדרי גודל גבוה יותר מאלו נסבלים על ידי qPCR. יתרונות אלו הופכים את assay EntHF183 dPCR אטרקטיבי במיוחד משום שהיא בעת ובעונה אחת מספקת מידע מדויק דיר משני הזיהום הכללי ואנושיים הקשורים צואתי במי סביבה, ללא הצורך להפעיל שני מבחני qPCR נפרדים. למרות יתרונותיה מעל qPCR, מגבלת הכימות העליונה של assay dPCR עם מכשור הקיימות כיום כ ארבעה סדרי גודל נמוך מזה השגה על ידי qPCR. כתוצאה מכך, הדילול נדרש למדידת ריכוזים גבוהים של אורגניזמים היעד כגון אלו שנצפו בדרך כלל בעקבות נשפך ביוב.
Introduction
PCR כמוני (qPCR) שיטות כבר בשימוש נרחב לניטור איכות מי פנאים ויישומי מעקב מקור חיידקים כי הם מהירים יותר, גמישים יותר ספציפיים בהשוואה לשיטות תרבות המבוססת מסורתיות. כתוצאה מכך, qPCR מומלץ להשגת תוצאות ניטור מים מהירות עבור אינדיקטורים צואתי כלליים כגון spp אנטרוקוקוס. בקריטריוני איכות מי פנאי מתוקן USEPA 1. מבחני qPCR רבים גם פותחו ומאומתים לזיהוי מקורות זיהום צואתי במי סביבת 2. בין אלה, מבחני סמן HF183 הם בין הנפוצות ביותר בשימוש לזיהוי זיהום צואתי הקשורים האדם 3.
עם זאת, תוצאות qPCR יכול לעיתים קרובות להיות מוטים כי הם מסתמכים על עקומות סטנדרטיות עבור כימות. qPCR מכמת ריכוזים ידועים של יעד בדגימות על ידי ביון מחזור הכימות שלהם (CQ) מתוך סטןעקומת dard המתארת מערכת יחסים ליניארי בין Cq וכמות לוגריתמים של סט של סטנדרטים בדילול סדרתי. חוסר חומר עזר תקן אמין ועקבי ולכן יכול להטות תוצאות qPCR מאוד. מחקרים הראו כי תוצאות qPCR שונות על ידי כחצי סטנדרטי יומן באמצעות מיצרנים שונים 4 ועל ידי 2-לקפל באמצעות קבוצות שונות של סטנדרטים מאותו הספק 5.
PCR דיגיטלי (dPCR) טכנולוגיה מכמתת מדגם לא ידוע על ידי ספירת התדירות חיובית במספרים גדולים של PCRs מיניאטורי המופקים על ידי מחיצות qPCR בתפזורת לתוך אלף או מ'nanoliter האחיד או תגובות picoliter 6. זה נקרא כמו אגל PCR דיגיטלי (כלומר, במאמר זה) או תא דיגיטלי PCR, בהתאמה, אם המחיצות הן טיפות מים ב-שמן (כלומר, במאמר זה) או תא קטן על שבב. ריכוז מדגם גבוה יגרום נוכחות של DNA היעד(ומכאן חיובי PCR), בשיעור גבוה יותר של מחיצות, מערכת יחסים המקורבים על ידי התפלגות פואסון. ככזה, התוצאות בינארי (חיובי או שלילי PCR) נרשמות ואת התדירות של טיפות חיוביות משמשת לחישוב ריכוזים מדגמים לא ידועים ישירות דרך קירוב פואסון, ביטול הצורך עקום סטנדרט כמו qPCR.
הטבע בינארי זה של כימות דיגיטלי PCR מספק יתרונות נוספים על פני qPCR 7. בגלל הגברה מתעכבת עדיין יכולה להניב PCR חיובי, כימות dPCR הן חזקות יותר נגד עיכוב המפחיתה יעילה הגברה. באופן דומה, כימות dPCR אינו מושפע השתנות בערכים Cq כמו qPCR, שמוביל דיוק גבוה של dPCR לעומת qPCR 8-10.
בנוסף, תהליך יצירת המחיצות מבטיח כמות קטנה מאוד של הנוכחי DNA יעד בכל אגל, מזעור תחרות מצע ביעילות (במהלך amplification של מטרות DNA שונות) כי הם מכשולים נפוצים להשגת דופלקס (כלומר assay מודד בעת ובעונה אחת שתי מטרות DNA) qPCR. ככזה, אם בטווח בדופלקס או סימפלקס (כלומר יעד אחד נמדד ב assay אחת) dPCR מייצרת כימות כמעט נבדלות של שני היעדים 7,11.
המטרה של assay PCR הדיגיטלי (EntHF183 dPCR) המתוארת במאמר זה היא להשיג כימות ישירה סימולטני של spp אנטרוקוקוס מחוון צואתי הכללי. ואת סמן HF183 הקשורים אדם-צואה עם דיוק, שחזור וחוסנם משופרים מפני עיכוב לעומת qPCR שלה עמיתים. Assay זה נוצל בהצלחה לכימות זיהום צואתי במים מתוקים סביבה, מים ימיים, חומר צואתי שונה 7, אבל יכול גם להיות מיושם על כל סוגים אחרים של מים ואת wastewaters. assay זה טומן בחובו הבטחה גדולה לניתוח משקע או קרקעות בגלל זהזה סובלנות גבוהה עיכוב, אך בדיקות נוספות נדרשות בשל מורכבות של המעכב מתערבב סוגים אלה של דגימות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תערובת Assay כן
- הפוך 100 μmol / L ריכוזי מניות לכל פריימרים במי כיתה מולקולריים בדיקות במאגר TE pH 8 [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ 12; HF183-1, BthetR1, BthetP1 3].
הערה: בדיקות עבור שתי המטרות מסומנות fluorescently עם 7 fluorophores השונים כמצוין רשימה של חומרים / ציוד. - הכינו תערובת אמן על ידי ערבוב, לכל תגובה מתוכננת, 12 μl דיגיטלי תמהיל PCR (2x המניות, ראה רשימה של חומרים / ציוד), 0.216 μl כל קדימה לאחור תחל, 0.06 μl כל בדיקה ניאון, ו 5.016 μl מים nuclease חינם (הריכוז הסופי : פריימר 900 ננומטר כל, 250 ננומטר כל בדיקה). פיפטה מעלה ומטה לפחות 10 פעמים כדי לערבב תוך זהירות שלא להכניס בועות אוויר בתמיסה.
- פיפטה 18 μl תערובת אמן (משלב 1.2) לתוך צינור או צלחת PCR רגיל, ערבוב תבנית ה- DNA 6 μl (חילוץ כמתואר לשנים קודמותערמומי 13) לעשות תערובת assay עבור דור אגל. אם פועל דגימות בשני עותקים, pipet 36 μl של תמהיל מאסטר ו -12 תבנית ה- DNA μl לבאר כל אחד. השאר את הבארות לשכפל המקביל ריק על הצלחת. כלול בקרות חיוביות (ראה רשימה של חומרים / ציוד) ולא שולט תבנית (NTC) (כלומר עם מי כיתה מולקולריים משמשים תבנית).
הערה: בקרה חיובית יש צורך להבטיח את assay פועל כראוי ואת NTC יש צורך להבטיח שאין זיהום בתוך הצלחת ולהגדרת בסיס הניאון בהמשך לניתוח נתונים. משתמשים פעם ראשונה מומלץ להשתמש בשתי דגימות DNA חי ומדולל.
2. דור אגל והגדרת פלייט PCR
- מערבבים את תערובת assay ידי pipetting למעלה למטה כ 15 פעמים באמצעות pipet הרב ערוצית. ודא קצה pipet נשאר בתוך נוזל, כדי למנוע עושה בועות עודפות בתוך התערובת.
- insמחסנית ERT 1 (המכיל 8 בארות) לתוך בעל מחסנית לבן ולחץ על עצומות בעל מחסנית. מחסנית 1 כיום במקומו ולא ניתן וחילצה מבעל תוך יצירת טיפות. שימוש pipet הרב ערוצית, להעביר בעדינות 20 μl של תערובת assay לתוך האמצע של "מדגם" מסומן מחסנית ללא החדרת בועות אוויר.
- Pipet ב 70 μl של שמן אגל דור אל הצד השמאלי של מחסנית (מסומן 'שמן').
- מחסנית כיסוי עם אטם מוודא האטם הוא שטוח וקבע באופן שווה על ידי 4 קרציות לעבר קצה המחסנית. לחצו על הכפתור הירוק מואר על הגנרטור אגל לפתוח ולמקם את המחסנית. לחץ ירוק מואר הלחצן שוב כדי לסגור את הגנרטור.
הערה: לאחר שהדלת נסגרת, הלחצן מעומעם, הדלת לא ניתן לפתוח מחדש ודור אגל מתחיל ממשיך מיד כ 1 דקות. - אם עושים יותר מ -8 תגובות, מחסנית מקום 2 תוך שנייהבעל מחסנית לבן ולהכין באותו אופן כמו מחסנית 1 ואילו דור האגל מתבצע כדי לחסוך זמן התקנה כולל.
- פתח את דלת גנרטור אגל כאשר הכפתור מואר העמום הופך ירוק המציין השלים דור אגל. הסר את בעל מחסנית לבן המכיל מחסנית 1, להפריש, ומקום מחסנית 2 על גנרטור רביב.
- הסר את האטם ממחסנית 1 וזורקים. בעדינות להעביר את הנפח הכולל (כ 40 μl) של טיפות שנוצרו מן בטור השלישי של המחסנית (מסומן 'טיפות') לצלחת PCR סופית (נשמרה בטמפרטורת חדר) עבור רכיבה תרמית.
הערה: אל ובטל את בעל מחסנית הלבן כמו הפעולה עשוי לשבור את הטיפין החדשות שנוצרו באופן מלאכותי; רק לפתוח את בעל המחסנית אחרי הטיפין הועברו הצלחת הסופית. - חזור על שלבים 2.1-2.7 עבור דגימות נוספות.
- כשכל הטיפין נמצאות צלחת PCR הסופית, להציב לנקבהכיסוי רדיד על גבי צלחת ומניחים אותו על אוטם צלחת. הגדר את האוטם ל -180 ° C, לחץ על 'Play' על האוטם ולתת חותמים במשך 10 שניות.
3. רכיבה על אופניים תרמיים וקריאת האגל
- מניח את הצלחת האטומה על Cycler התרמית, אחד בקנה אחד עם צלחת PCR הסופית המשמשת בשלב 2.7, ומהירות ramping טמפרטורה של 2.0 מעלות צלזיוס / sec.
- הפעל תכנית תרמית כדלקמן: 10 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, ואחריו 40 מחזורים של 30 שניות על 94 מעלות צלזיוס ו -60 שניות על 60 מעלות צלזיוס, ואחריו להחזיק 10 דקות ב 98 ° C (אופציונאלי: עצירה סופית ב 4 או 15 ° C).
- עם השלמת אופניים, להעביר את הצלחת לקורא אגל למדידה אוטומטית של קרינה בכל אגל בכל טוב. לחלופין, אחסן את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 ימים לפני קריאת רביב. ודא הטיפות הן בטמפרטורת החדר לפני שתמשיך עם הקריאה.
- פתח בתוכנה הנלווית התקנת קריאת רביב. בתפריט ברירת המחדל 'הגדרת' המכיל סכמטי של צלחת ריקה 96 באר, לחץ לחיצה כפולה על כן A1 כדי לפתוח את התפריט המכיל שלושה חלקים: "לדוגמא, '' Assay 1 'ו' Assay 2."
- בקטע 'לדוגמא' הקלד את מזהה המדגם לתוך התיבה שכותרתה 'שם' ולחצו אנטר או לסמן את התיבה בצד ימין מסומן 'החל'. לאחר מכן, לחץ הנפתח 'ניסוי' שכותרתו תפריט ולבחור "RED" (זיהוי אירוע נדיר) ולחץ על Enter.
- לעבור לקטע כונה 'Assay 1.' בקטע 'שם' למלא את assay (למשל אנטרוקוקוס) ולחץ על Enter. בתיבת הדו למטה תחת הכותרת "סוג" לחץ על התפריט הנפתח ובחר 'ערוץ 1 לא ידוע' ולחץ על Enter.
- לעבור לקטע כונה 'Assay 2. " בקטע 'שם' למלא את assay (למשל HF183) ולחץ על Enter. בתיבת הדו למטה תחת הכותרת "סוג" לחץ הנפתחת תפריטd לבחור "ערוץ 2 לא ידוע 'ולחץ על Enter. כל המידע מן השלבים 3.3.2 עד 3.3.4 עכשיו להציג היטב A1.
- שם כל הבארות הבאות המכילות טיפות. כדי לחסוך זמן התקנה כולל, לחץ על 'Shift' או 'Ctrl' לבחור בארות בו זמנית.
- כאשר התיאור הדיגיטלי של צלחת מראות הצלחת הגופנית, לחץ על 'האישור' בפינה הימנית התחתונה של התפריט. בתפריט החדש שמופיע בחלק העליון של סכמטית הצלחת, תחת הסעיף 'Template' לבחור 'שמירה בשם' ושם ולשמור הצלחת.
- כדי השמאלי של המסך ולחץ על 'הפעל' ובחר מתאים דיי סט ב-אאוט פופ "הפעלת האפשרויות" החלון. איסוף נתונים יוזם מוצג בזמן אמת בתוכנה.
4. ניתוח נתונים ודיווח
- כאשר הקורא הוא סיים תופיע תיבה והצהירה "מפעיל שלמים ', לחץ על' אישור '.
הערה: רכהכלי מציג את קובץ הנתונים הסופיים, בסעיף 'לנתח' של התוכנה. לפי השקפה זו, התוכנה יש את כל הבארות בצלחת שנבחרו מחדל לעלילת הנתונים ד'2 Amplitude '. - בדוק את ההפרדה בין הטיפות חיוביות ושליליות. ודא כי הקרינה בכל טיפות בבארות NTC נמצאים בקרבת הבסיס.
- הקישו על כפתור הנקרא 'אירועים'. מהימין של ההיסטוגרמה הציג לחץ על התיבה בשם 'סה"כ' והתיבה בשם "יחיד" בתחתית כדי להציג את המספר הכולל של טיפות קבלו בכל טוב. אל תכלול כל בארות המכילות <10,000 טיפות 7-ידי החזקת מקש Ctrl ולחיצה על הבאר (ים) כדי להיות שליליות.
- לחץ על הכפתור המסומן כמו '1D Amplitude' כדי לקבוע את סף פלורסנט בכ סטיית תקן אחת (500-700 יחידות קרינה) מעל הטיפין השליליות בבארות NTC עבור מטרות שניהם. במקרה הטוב ביותר השמאלי של האו"ם המסךדער את 'אוטומטי לנתח ו"הראתה שני כפתורי סף, לבחור את הסמל בצד ימין כי יש קו אופקי ורוד מוצק רץ דרך אותה.
- לחץ בתיבה מהשמאל 'קבע סף' תחת כל הגרפים משרעת והזן את ערכי סף הקרינה המתאימים. ריכוזי היעד להעתיק לכל תגובת μl אז מחושבים באופן אוטומטי.
הערה: ספי לא צריך להיות זהה עבור מטרות שונות. - לייצא את התוצאות לקובץ csv על ידי לחיצה על כפתור "ייצוא" בפינה השמאלית העליונה במסך 1D משרעת. בקובץ CSV, להכפיל את הריכוז היעד שמייצאת 4 להמיר אותו מעותק של היעד (23S הגן של spp אנטרוקוקוס. או על סמן HF183) לכל תגובה μl להעתיק של היעד לכל μl תבנית ה- DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ריצת דופלקס EntHF183 טובה dPCR צריכה לגרום למספר גבוה היחסי של טיפות קבלו (בערך 10,000-17,000) והבדל גדול יחסית (בערך 5,000) בין ערכי קרינה עבור טיפות שליליות וחיוביות 7. באופן חריג מספר נמוך של טיפות מציין בעיות קרוב בתהליך אגל הדור, וניתוק 10,000 טיפות מוצע מבוסס על נתונים אמפיריים ממערכת אגל dPCR שימוש במאמר זה. הפרדה חלשה יותר (הבדל קרינה קטן כלומר) בין טיפות חיוביות ושליליות עשויה להצביע על עיכוב או בדיקות מושפלות 7.
בסך הכל, assay דופלקס dPCR EntHF183 מייצרת תוצאות דומות מאוד לזו מ סימפלקס qPCR כאשר qPCR תוקן הטיות הקשורות סטנדרטים ואין עיכוב 7. תוצאות מן assay דופלקס dPCR EntHF183 ואת corמבחנים להגיב סימפלקס dPCR הם ומתואמים היטב ולעתים קרובות נבדל בין שני הפורמטים 7 (איור 1). בנוסף, assay dPCR גם יכול לסבול מעכב ריכוזי אחד שני סדרי גודל גבוה יותר מזה נסבל על ידי עמיתיהם שלו qPCR 7 (איור 2).
איור 1:. כימות של דגימות צואה ומים ידי assay דופלקס dPCR EntHF183 ואת מבחני dPCR סימפלקס המקביל שמאל לוחות מימין להציג אנטרוקוקוס וכימות HF183, בהתאמה, עם מקדמי מתאם המתאים (p <0.001) בין דופלקס ותוצאות סימפלקס. קווים מוצקים לציין את קווי רגרסיה ואת הגוון האפור מציין את סטיות תקן המקבילות. סמלים מציינים סוגים שונים של דגימות (מעגלים, משולש ים וצלבים לציין צואה, מים מתוקים, דגימות מים ימיות, בהתאמה). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: סימפלקס qPCR דופלקס dPCR כימות של הסמן HF183 בדנ"א ביוב נקי ומשובץ ריכוז גדל והולך של מעכבי ה- PCR (חומצה humic) משולשים ו- x-צלבים מציינים כימות dPCR ו qPCR, בהתאמה.. כימות HF183 הצפויות בהעדר המעכבים מוגדרות 95% (כלומר, בין שני קווים מהקווקווים אופקיים). A "-1" התוצאה מצביעה על אי-זיהוי. כימות אנטרוקוקוס תערוכות דומה סובלנות גבוהה יותר למעכבי ידי assay EntHF183 דופלקס dPCR מאשר על ידי assay qPCR המקביל 7.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53611/53611fig2large.jpg" target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ישנם כמה צעדים קריטיים בפרוטוקול. ראשית, ערבוב של תערובות assay יכול להיות קשה, כי את תערובת מאסטר היא צמיגה יותר מאשר תערובות מאסטר qPCR קונבנציונליות. vortexing פשוט עלול להוביל ערבוב מספיק, אשר בתורו מוביל הפצה לא אחידה של תבניות DNA של תערובות assay וכפועל יוצא מזה הטיפות. טכניקת ערבוב האחרת pipetting כמתואר בפרוטוקול חייב להיות אחריו כדי להבטיח כימות dPCR מדויקות. שנית, חשוב להבטיח טיפות נוצרות בכל צורה וגודל אחיד. להיות זהיר של מקרים שבהם הזמן הגנרטור אגל שנדרש כדי להשלים הדור אגל על מחסנית אחת קצרה מהרגיל. זה עשוי להצביע על דור אגל לא טוב. במידת הצורך, הזמן אגל הדור של כל מחסנית ניתן להקליט לפתרון בעיות. שלישית, חשוב להעביר את 40 μl כולו של טיפות שנוצרו מהמחסנית לצלחת PCR הסופית ללא גזטיפות ולהימנע שלא טיפות מספיק כימות. הטכניקות הבאות ניתן להשתמש להעברה: 1) קבעת את pipet רב ערוצית 40 μl והכנס את הטיפים לתוך בחלק הימני של המחסנית (המסומנת 'טיפות') בזווית של 45 מעלות; 2) Pipet הטיפות החוצה לאט להבטיח שכל טיפות הם pipetted למעלה (שימו לב אם בכלל טיפות נותרים מאחור צריך להיות pipetted עד לסיבוב השני); 3) לאחר טיפות יוסרו, להעביר אותם לצלחת הסופי על ידי הצבת קצה pipet בקיר גם כמחצית הדרך למטה ולגרש את טיפות לאט.
את assay EntHF183 דופלקס dPCR יש יתרונות גדולים על פני מבחני qPCR הנפרדים הקיימים עבור אותה analytes. ראשית, assay דופלקס dPCR לא צריך עקומות סטנדרטיות עבור אלמונים לכימות, ובכך למנוע הטיות כימות qPCR הקשורים השתנות הסטנדרטים 7. שנית, assay דופלקס dPCR יכול לסבול לעכבאו ריכוזי שהם אחד שני סדרי גודל גבוה יותר מזה נסבל על ידי מבחני qPCR המקבילים 7. תכונה זו הופכת את assay דופלקס dPCR אטרקטיבי לניתוח דגימות סביבתיות (דגימות stormwater למשל) כי בדרך כלל מכילות חומרים מעכבים כדי PCR. שלישית, היכולת לכמת בו זמנית הן spp אנטרוקוקוס. ואת סמן HF183 בדופלקס אחד assay dPCR (לעומת שיש לכמת אותם בנפרד בשני מבחני qPCR) הוא יותר יעיל וחסכוני 7 ומשפר כמות הנתונים על ידי הימנעות השתנות pipetting מצטבר הקשורים מנהלת שני מבחנים נפרדים (לעומת assay dPCR דופלקס אחד). רביעית, assay דופלקס dPCR הפגין גם דיוק גבוה ואת דירות לעומת מבחני qPCR המקבילים, מה שהופך את לשעבר אלטרנטיבה טובה במחקרים השוואתיים 7.
עם זאת, מגבלות קיימות בשיטה זו (יתרונות ומגבלות מתוארים בפירוטבמקום אחר 7). ראשית, מספר טיפות קיבל לכל תגובה קובע את היקף כימות העליון (UQL) של dPCR. מכשיר dPCR המשמש בעבודה זו (מעיין הרשימה של חומרים / ציוד) דווח יש UQL 10 5 עותק לכל תגובה. זה מקביל 5 x 10 5 תאים אנטרוקוקוס ו -2 x 10 6 עותקים HF183 ל -100 מ"ל מים בהנחה בעבר 7 תיאר פרוטוקול מיצוי DNA אחריו ו -100 DNA μl מתקבל (כלומר לכל הצעד elution במהלך החילוץ DNA) מ 100 מ"ל מים ללא כל אובדן במהלך עיבוד המדגם לפני dPCR 7. מי סביבה בדרך כלל לא יעלו על ריכוזים כאלה של אנטרוקוקוס ו HF183. עם זאת, דילול מדגם צריך להיחשב עבור דגימות ריכוז גבוהות כגון צואת בעלי חיים, ביוב גולמי דגימות מים נאספות מייד לאחר לשפוך ביוב. שנית, ריכוזים גבוהים של DNA הכולל (including הוא היעד ו- DNA היעד הלא) יכולים להפריע לתהליך מחיצות רביב. זה לא מומלץ להשתמש יותר מ -66 DNA הכולל ng ללא טיפול מקדים על ידי הגבלת אנזימים 7. שלישית, על אף assay דופלקס dPCR EntHF183 הוא משמעותי יותר חזק נגד עיכוב מ qPCR, assay זה עדיין יכול להניב תוצאות שליליות שווא אם עיכוב חמור מונע הגברת PCR התרחשות. אמצעי בקרת עיכוב ולכן עדיין צריך להיות מיושם. שיטות בנוסף או דילול רגיל כמתואר ניתן להשתמש בעבר כדי להעריך עיכוב 7. לאחרונה, assay דופלקס יאומת רק על פלטפורמה אחת dPCR, ואימות שיטה צריכה להתנהל על פלטפורמות PCR דיגיטליות אחרות לפני השימוש.
זהו assay PCR הדיגיטלית דופלקס פורסם לראשונה כי במקביל המכמת אינדיקטור איכות מים מקובל סמן מארח הקשורים פופולרי עבור זיהום צואתי 7. היתרונות הפגינוהבטחת assay דופלקס dPCR EntHF183 יישומים שימושיים אחרים בטכנולוגית PCR דיגיטלית מעקב מקור חיידקים, זיהוי של פתוגנים גנים עמידים לאנטיביוטיקה. לדוגמא, מחוון צואתי כללי (אנטרוקוקוס spp., E. coli, כללי Bacteroidales) ועם סמן צואה קשור מארח (HF183, HumM2, CowM2, LeeSeagull) 2 ניתן לזווג דומה (כמו assay דופלקס dPCR EntHF183) ב assay דופלקס dPCR יותר חסכוני כימות מדויקת של זיהום צואתי כללי קשורים מארח. סמני מעקב מקור מיקרוביאלית מיקוד אותו המקור (או מקורות שונים) יכולים גם יש להתאים assay דופלקס dPCR כדי להגדיל את הביטחון באיתור המקור בצואה (או לקבל מידע על מקורות צואה מרובים בו זמנית). הסובלנות התחזק כנגד מעכבי PCR גם עלולה לאפשר ניתוח של נפח דגימה גבוה כדי להגדיל את ההסתברות של פתוגנים גילוי כי יש מינונים זיהומיות נמוך אבל נוכחים רק envirמי onmental בריכוזים נמוכים. יתרונות מתודולוגיים דומים PCR הדיגיטלית מעל qPCR יכולים לחול גם על פיתוח מבחני PCR דיגיטליים כימות של גנים עמידים לאנטיביוטיקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low Bind Microtubes | Costar | 3207 | For storage of reagents, samples/production of master mixes |
| Nuclease Free Water | FisherSci | BP2484-50 | |
| TE pH 8 buffer | FisherSci | BP2473-100 | |
| Hardshell 96 Well Plate | BioRad | HSP-9601 | For initial master mix and sample inoculation |
| Aluminum Sealing Film | BioRad | 359-0133 | To seal sample plate |
| Droplet Generator | BioRad | 186-3002 | |
| Droplet Generation Oil | BioRad | 186-3005 | |
| Cartridge | BioRad | 186-4008 | |
| DG8 Cartridge Holder | BioRad | 186-3051 | |
| Gasket | BioRad | 186-3009 | |
| 20 μl pipet tips | Rainin | GP-L10F | For tansferring sample/master mix to cartidge |
| 200 μl pipet tips | Rainin | GP-L200F | For transferring droplets to final Twin.Tec Plate |
| Twin.Tec 96 Well Plate | Eppendorf | 951020320 | For final droplets thermal cycling and reading |
| Pierceable Heat Seal Foil | BioRad | 181-4040 | To seal Twin.Tec plate before thermalcycling |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 181-4000 | |
| CFX96 Thermalcycler | BioRad | CFX96 and C1000 | Only the thermal cycler is needed, no optics |
| QX100 Droplet Reader | BioRad | 186-3001 | |
| Droplet Reader Oil | BioRad | 186-3004 | |
| Droplet PCR Supermix | BioRad | 186-3024 | i.e. the digital PCR mix in manuscript |
| QuantaSoft software (v1.3.2) | Quantasoft | QX100 | For viewing, analyzing, and exporting ddPCR data |
| Entero Forward Primer (Ent F1A) | Operon | GAGAAATTCCAAACGAACTTG | Alternative vendor can be used |
| Entero Reverse Primer (Ent R1) | Operon | CAGTGCTCTACCTCCATCATT | Alternative vendor can be used |
| Entero Probe (GPL813TQ) | Operon | [6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1] | Alternative vendor can be used, but the florophore has to be FAM |
| HF183 Forward Primer (HF183-1) | Operon | ATCATGAGTTCACATGTCCG | Alternative vendor can be used |
| HF183 Reverse Primer (BthetR1) | Operon | CGTAGGAGTTTGGACCGTGT | Alternative vendor can be used |
| HF183 Probe (BthetP1) | Operon | [6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1] |
Alternative vendor can be used, but the florophore has to be HEX (if using VIC, then the appropriate matric compensation must be chosen. |
| Positive control | Mixture of E. faecalis genomic DNA and HF183 standard plasmid (ordered from IDT). For detailed methods in culturing E. faecalis and sequences of the ordered HF183 plasmid, please see Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercilaly available Enterococcus DNA standards (ATCC 29212Q-FZ) can also be used in the positive control in place of lab-prepared E. faecalis genomic DNA. |
References
- Recreational Water Quality Criteria. EPA. , Office of Water. Washington, DC. 820-F-12-058. Available from: http://water.epa.gov/scitech/swguidance/standards/criteria/health/recreation/ (2012).
- Boehm, A. B., et al. Performance of forty-one microbial source tracking methods: A twenty-seven lab evaluation study. Water Res. 47 (18), 6812-6828 (2013).
- Layton, B. A., et al. Performance of human fecal anaerobe-associated PCR-based assays in a multi-laboratory method evaluation study. Water Res. 47 (18), 6897-6908 (2013).
- Cao, Y., et al. Effect of platform, reference material, and quantification model on enumeration of Enterococcus by quantitative PCR methods. Water Res. 47 (1), 233-241 (2013).
- Sivaganesan, M., Siefring, S., Varma, M., Haugland, R. A. MPN estimation of qPCR target sequence recoveries from whole cell calibrator samples. J. Microbiol. Methods. 87 (3), 343-349 (2011).
- Huggett, J. F., et al. The Digital MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clin. Chem. 59 (6), 892-902 (2013).
- Cao, Y., Raith, M. R., Griffith, J. F. Droplet digital PCR for simultaneous quantification of general and human-associated fecal indicators for water quality assessment. Water Res. 70, 337-349 (2015).
- Sanders, R., Huggett, J. F., Bushell, C. A., Cowen, S., Scott, D. J., Foy, C. A. Evaluation of Digital PCR for Absolute DNA Quantification. Anal. Chem. 83 (17), 6474-6484 (2011).
- Whale, A. S., et al. Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation. Nucleic Acid Res. 40 (11), 82-89 (2012).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
- Morisset, D., Štebih, D., Milavec, M., Gruden, K., Žel, J. Quantitative analysis of food and feed aamples with droplet digital PCR. PLoS One. 8 (5), e62583 (2013).
- Method 1611: Enterococci in Water by TaqMan® Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) Assay. EPA. , Office of Water. Washington, DC. EPA-821-R-12-008. Available from: http://water.epa.gov/scitech/methods/cwa/bioindicators/upload/Method-1611-Entercocci-in-Water-by-TaqMan-Quantitative-Polymerase-Chain-Reaction-qPCR-Assay.pdf (2012).
- Cao, Y., et al. Evaluation of molecular community analysis methods for discerning fecal sources and human waste. Water Res. 47 (18), 6862-6872 (2013).
