Summary
यह पांडुलिपि एक डुप्लेक्स डिजिटल पीसीआर परख है कि एक साथ उदर एसपीपी यों इस्तेमाल किया जा सकता है। और मनोरंजन पानी में सामान्य और मानव-मल जुड़े संदूषण के संकेतक के रूप HF183 आनुवंशिक मार्करों का वर्णन है।
Abstract
यह पांडुलिपि Enterococcus एसपीपी के एक साथ मात्रा का ठहराव। और मानव मल से जुड़े HF183 मार्कर के लिए एक डुप्लेक्स डिजिटल पीसीआर परख (EntHF183 dPCR) का वर्णन है। EntHF183 द्वैध dPCR (EntHF183 dPCR के रूप में भेजा hereon) परख अपनी प्रकाशित व्यक्ति मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) समकक्षों के रूप में एक ही किताब और जांच के दृश्य का उपयोग करता है। इसी तरह, एक ही पानी छानने का काम और डीएनए निष्कर्षण प्रक्रियाओं के रूप में qPCR करने से पहले किया dPCR चल रहा से पहले पालन कर रहे हैं। हालांकि, डुप्लेक्स dPCR परख qPCR assays पर कई फायदे हैं। सबसे महत्वपूर्ण है, dPCR परख एक मानक वक्र चल रहा है और इसलिए लिए की जरूरत है, जुड़े पूर्वाग्रह और परिवर्तनशीलता, अपने लक्ष्य के प्रत्यक्ष मात्रा का ठहराव द्वारा समाप्त। इसके अलावा, जबकि (यानी एक साथ मात्रा का ठहराव) उदर और qPCR में HF183 duplexing अक्सर एक नमूने में कम प्रचुर मात्रा में लक्ष्य के गंभीर मूल्यवान समझना की ओर जाता है, dPCR दोनों लक्ष्यों के अनुरूप मात्रा का ठहराव प्रदान करता है, whetउसकी व्यक्तिगत रूप से या एक साथ एक ही प्रतिक्रिया में मात्रा निर्धारित किया। dPCR परख भी पीसीआर अवरोध सांद्रता कि परिमाण qPCR द्वारा सहन उन लोगों की तुलना में अधिक के आदेशों 01:59 हैं बर्दाश्त करने में सक्षम है। ये लाभ EntHF183 dPCR परख विशेष रूप से आकर्षक है क्योंकि यह एक साथ दो अलग qPCR assays चलाने के लिए आवश्यकता के बिना पर्यावरण पानी में दोनों सामान्य और मानव-मल जुड़े संदूषण पर सटीक और repeatable जानकारी प्रदान करता है। qPCR पर अपने फायदे के बावजूद, वर्तमान में उपलब्ध उपकरण के साथ dPCR परख की ऊपरी सीमा की मात्रा का ठहराव लगभग परिमाण qPCR द्वारा प्राप्त की तुलना में कम है कि चार में से आदेश है। नतीजतन, इस तरह आम तौर पर कमजोर पड़ने सीवेज फैल निम्नलिखित मनाया उन लोगों के रूप में लक्ष्य जीवों की उच्च सांद्रता की माप के लिए की जरूरत है।
Introduction
मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) तरीकों में व्यापक रूप से, क्योंकि वे तेजी से और अधिक लचीला और पारंपरिक संस्कृति आधारित विधियों की तुलना में विशिष्ट हैं मनोरंजक पानी की गुणवत्ता की निगरानी और माइक्रोबियल स्रोत आवेदन पर नज़र रखने के लिए इस्तेमाल किया गया है। नतीजतन, qPCR संशोधित USEPA मनोरंजन पानी की गुणवत्ता मानदंड 1 में इस तरह के उदर एसपीपी के रूप में सामान्य मल संकेतकों के लिए तेजी से पानी की निगरानी परिणाम प्राप्त करने के लिए सिफारिश की है।। कई qPCR assays भी विकसित और पर्यावरण के जल 2 में मल प्रदूषण के स्रोतों की पहचान के लिए मान्य किया गया है। इन के अलावा, HF183 मार्कर assays के सबसे अधिक बार मानव-मल जुड़े संदूषण 3 की पहचान करने के लिए इस्तेमाल शामिल हैं।
हालांकि, qPCR परिणाम अक्सर पक्षपातपूर्ण हो सकता है क्योंकि वे मात्रा का ठहराव के लिए मानक घटता पर भरोसा करते हैं। qPCR एक स्टेन से उनकी मात्रा का ठहराव चक्र (सीक्यू) interpolating द्वारा नमूनों में लक्ष्य के अज्ञात सांद्रता quantifiesदर्द की अवस्था है कि Cq और क्रमानुसार-पतला मानकों का एक सेट के लघुगणक मात्रा के बीच एक रैखिक संबंध का वर्णन है। विश्वसनीय और संगत मानक संदर्भ सामग्री का अभाव इसलिए बहुत qPCR परिणाम पूर्वाग्रह कर सकते हैं। अध्ययन से पता चला है कि qPCR परिणाम विभिन्न विक्रेताओं से 4 मानकों का प्रयोग लगभग आधे से एक लॉग से भिन्न है और एक ही विक्रेता से 5 मानकों के विभिन्न बैचों का उपयोग कर 2 गुना से।
डिजिटल पीसीआर (dPCR) तकनीक लघु PCRs की बड़ी संख्या है कि हजारों या वर्दी nanoliter या picoliter प्रतिक्रियाओं 6 के लाखों में एक थोक qPCR विभाजन से उत्पन्न कर रहे हैं में सकारात्मक की आवृत्ति की गणना के द्वारा एक अज्ञात नमूना quantifies। यह छोटी बूंद डिजिटल पीसीआर (यानी, इस लेख) या चैम्बर डिजिटल पीसीआर, क्रमशः के रूप में जाना जाता है, तो विभाजन पानी में तेल की बूंदों (यानी, इस लेख) या एक चिप पर छोटे कक्षों हैं। एक उच्च नमूना एकाग्रता लक्ष्य डीएनए की उपस्थिति में परिणाम होगा(इसलिए सकारात्मक पीसीआर) विभाजन की एक उच्च अनुपात में, एक रिश्ता पॉसों वितरण द्वारा approximated। जैसे, द्विआधारी परिणाम (सकारात्मक या नकारात्मक पीसीआर) दर्ज कर रहे हैं और सकारात्मक बूंदों की आवृत्ति पॉसों सन्निकटन के माध्यम से सीधे अज्ञात नमूना सांद्रता गणना करने के लिए, qPCR में के रूप में एक मानक वक्र के लिए आवश्यकता को नष्ट किया जाता है।
डिजिटल पीसीआर गुणात्मक रूप से इस द्विआधारी प्रकृति qPCR 7 पर अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है। क्योंकि देरी प्रवर्धन अभी भी एक सकारात्मक पीसीआर उपज कर सकते हैं, dPCR मात्रा का ठहराव निषेध कि प्रवर्धन क्षमता कम कर देता खिलाफ और अधिक मजबूत है। इसी तरह, dPCR मात्रा का ठहराव Cq मूल्यों में परिवर्तनशीलता से प्रभावित नहीं है के रूप में, qPCR है qPCR 8-10 की तुलना में dPCR के उच्च परिशुद्धता के लिए अग्रणी।
इसके अलावा, विभाजन की प्रक्रिया, एक छोटी बूंद में लक्ष्य डीएनए की एक बहुत छोटी राशि सुनिश्चित करता है को प्रभावी ढंग से सब्सट्रेट प्रतियोगिता को न्यूनतम (amplificatio दौरानअलग डीएनए लक्ष्य) कि (यानी एक परख एक साथ दो लक्ष्यों को डीएनए के उपाय) qPCR में duplexing को प्राप्त करने के लिए आम बाधाएं हैं के एन। जैसे, चाहे द्वैध या सिंप्लेक्स में रन (यानी एक लक्ष्य के लिए एक एकल परख में मापा जाता है) dPCR दोनों लक्ष्यों को 7,11 के लगभग अप्रभेद्य मात्रा का ठहराव पैदा करता है।
डिजिटल पीसीआर परख (EntHF183 dPCR) इस आलेख में वर्णित के लक्ष्य के सामान्य मल सूचक Enterococcus एसपीपी के एक साथ प्रत्यक्ष मात्रा का ठहराव प्राप्त करने के लिए है। और मानव-मल जुड़े सुधार परिशुद्धता, reproducibility और निषेध के खिलाफ मजबूती के साथ HF183 मार्कर अपने qPCR की तुलना समकक्षों। इस परख सफलतापूर्वक पर्यावरण मीठे पानी, समुद्री पानी, और विभिन्न fecal सामग्री 7 में मल प्रदूषण को बढ़ाता के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन यह भी पानी और अपशिष्ट जल के किसी भी अन्य प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है। इस परख की वजह से इसे करने के लिए तलछट या मिट्टी का विश्लेषण करने के लिए महान वादा धारणनिषेध करने के लिए उच्च सहिष्णुता है, लेकिन अवरोध के नमूनों की इन प्रकारों में घोला जा सकता है आगे के परीक्षण क्योंकि जटिलताओं के लिए जरूरी है।
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Protocol
1. परख मिश्रण तैयारी
- ते 8 पीएच बफर में आणविक ग्रेड पानी में सभी प्राइमरों और जांच [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ 12 के लिए 100 μmol / एल शेयर सांद्रता करें; HF183-1, BthetR1, BthetP1 3]।
नोट: दो लक्ष्यों के लिए जांच fluorescently विभिन्न fluorophores 7 सामग्री / उपकरण की सूची में संकेत के रूप के साथ लेबल रहे हैं। - मास्टर मिश्रण, योजना बनाई है, के मिश्रण से तैयार प्रतिक्रिया प्रति 12 μl डिजिटल पीसीआर मिश्रण, 0.216 μl प्रत्येक आगे (2x शेयर, सामग्री / उपकरण की सूची देखें) और प्राइमर, 0.06 μl प्रत्येक फ्लोरोसेंट जांच रिवर्स, और ५.०१६ nuclease मुफ्त पानी μl (अंतिम एकाग्रता : 900 एनएम प्रत्येक प्राइमर, 250 एनएम हर जांच)। जबकि सावधानी लेने के समाधान में हवा बुलबुले परिचय नहीं मिश्रण करने के लिए कम से कम 10 बार पिपेट और नीचे।
- पिपेट 18 μl मास्टर मिश्रण एक नियमित रूप से पीसीआर ट्यूब या थाली में, 6 μl डीएनए टेम्पलेट में मिश्रण (1.2 कदम से) (वर्णित Previou के रूप में निकालाधूर्त 13) छोटी बूंद पीढ़ी के लिए परख मिश्रण बनाने के लिए। दो प्रतियों में नमूने चल रहे हैं, तो pipet मास्टर मिश्रण के 36 μl और अच्छी तरह से प्रत्येक में 12 μl डीएनए टेम्पलेट। इसी को दोहराने के कुओं की थाली पर खाली छोड़ दें। (आणविक ग्रेड टेम्पलेट के रूप में उपयोग किए गए पानी के साथ आईई) सकारात्मक नियंत्रण (देखें सामग्री / उपकरण की सूची) और कोई टेम्पलेट नियंत्रण (एनटीसी) को शामिल करें।
नोट: सकारात्मक नियंत्रण सुनिश्चित करने के लिए ठीक से परख चल रहा है आवश्यक है और एनटीसी सुनिश्चित करने के लिए प्लेट के भीतर कोई संदूषण है और डेटा विश्लेषण में बाद में फ्लोरोसेंट आधारभूत स्थापित करने के लिए आवश्यक है। पहली बार उन दोनों undiluted और पतला डीएनए नमूने का उपयोग करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं।
2. छोटी बूंद पीढ़ी और पीसीआर थाली सेटअप
- एक मल्टीचैनल pipet का उपयोग लगभग 15 बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा परख मिश्रण मिलाएं। सुनिश्चित करें कि pipet टिप तरल भीतर रहता मिश्रण के भीतर अतिरिक्त बुलबुले बनाने से बचने के लिए।
- भारतीय नौसेना पोतईआरटी एक सफेद कारतूस धारक में कारतूस 1 (युक्त 8 कुओं) और कारतूस धारक बंद पर क्लिक करें। कारतूस 1 अब मजबूती से जगह में है और बूंदों पैदा जबकि धारक से उखाड़ फेंकना नहीं किया जा सकता। एक मल्टीचैनल pipet का प्रयोग, धीरे हवा के बुलबुले शुरू करने के बिना कारतूस चिह्नित 'नमूना' के बीच की स्थिति में परख मिश्रण के 20 μl हस्तांतरण।
- कारतूस के बाईं ओर करने के लिए छोटी बूंद पीढ़ी तेल के 70 μl में pipet ( 'तेल' चिह्नित)।
- एक गैसकेट गैसकेट फ्लैट और 4 द्वारा समान रूप से आयोजित किया जाता है सुनिश्चित करने के साथ कवर कारतूस कारतूस के किनारे की ओर ticks। खोलने के लिए और कारतूस जगह के लिए छोटी बूंद जनरेटर पर हरे रंग की रोशनी बटन दबाएँ। प्रेस जनरेटर बंद करने के लिए फिर से हरे रंग की रोशनी बटन।
ध्यान दें: एक बार जब दरवाजा बंद कर देता है, बटन मंद है, दरवाजा फिर से खोल नहीं किया जा सकता है और छोटी बूंद पीढ़ी तुरंत लगभग 1 मिनट के लिए जारी रखने के लिए शुरू होता है। - एक दूसरे में अधिक से अधिक 8 प्रतिक्रियाओं, जगह 2 कारतूस कर रही हैंसफेद कारतूस धारक और कारतूस 1 के रूप में एक ही तरीके से तैयार है, जबकि छोटी बूंद पीढ़ी प्रगति की कुल सेटअप समय को बचाने के लिए है।
- छोटी बूंद जनरेटर दरवाजा खोलो जब मंद रोशनी वाले बटन छोटी बूंद पीढ़ी के पूरा होने का संकेत हरे रंग बदल जाता। छोटी बूंद जनरेटर पर कारतूस 1 युक्त सफेद कारतूस धारक, अलग सेट, और जगह 2 कारतूस निकालें।
- कारतूस 1 से गैसकेट निकालें और त्यागने। धीरे एक अंतिम पीसीआर प्लेट (कमरे के तापमान पर बनाए रखा) थर्मल साइकिल चालन के लिए पर कारतूस (चिह्नित 'बूंदों') के तीसरे स्तंभ से कुल मात्रा (लगभग 40 μl) उत्पन्न बूंदों के हस्तांतरण।
नोट: कार्रवाई के नव सृजित बूंदों तोड़ सकता है के रूप में सफेद कारतूस धारक unclick मत करो; केवल कारतूस धारक को खोलने के बाद बूंदों अंतिम प्लेट के लिए स्थानांतरित कर दिया गया है। - दोहराएँ अतिरिक्त नमूने के लिए 2.1-2.7 कदम।
- जब सभी बूंदों अंतिम पीसीआर थाली में हैं, एक जगह pierceableथाली के शीर्ष पर पन्नी कवर और एक थाली मुहर पर जगह है। मुहर पर 180 डिग्री सेल्सियस, प्रेस 'खेल' करने के लिए मुहर सेट और 10 सेकंड के लिए सील करते हैं।
3. थर्मल सायक्लिंग और छोटी बूंद पढ़ना
- थर्मल साइक्लर पर सील प्लेट की जगह, एक अंतिम पीसीआर थाली कदम 2.7 में इस्तेमाल किया, और 2.0 डिग्री सेल्सियस / सेकंड की एक तापमान ramping गति के साथ संगत।
- 98 डिग्री सेल्सियस (वैकल्पिक में 94 डिग्री सेल्सियस पर 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट, 30 सेकंड के 40 चक्रों के बाद और 60 डिग्री सेल्सियस पर 60 सेकंड, एक 10 मिनट की पकड़ से पीछा: थर्मल कार्यक्रम चलाने के लिए इस प्रकार के रूप में अंतिम 4 पकड़ या 15 डिग्री सेल्सियस)।
- साइकिल के पूरा होने पर, एक छोटी बूंद प्लेट रीडर करने के लिए प्रतिदीप्ति का स्वत: माप के लिए प्रत्येक छोटी बूंद में प्रत्येक कुएं में हस्तांतरण। वैकल्पिक रूप से, छोटी बूंद पढ़ने से पहले ऊपर से 3 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट की दुकान। सुनिश्चित करें बूंदों पढ़ने के साथ आगे बढ़ने से पहले कमरे के तापमान पर हैं।
- छोटी बूंद पढ़ने सेटअप करने के साथ सॉफ्टवेयर खोलें। में'नमूना', 'परख 1' और 'परख 2.': एक खाली 96 अच्छी तरह से थाली का एक योजनाबद्ध युक्त डिफ़ॉल्ट 'सेटअप' मेनू, डबल पर अच्छी तरह से A1 तीन वर्गों युक्त मेनू खोलने के लिए क्लिक करें
- 'नमूना' अनुभाग में बॉक्स लेबल 'नाम' और प्रेस दर्ज करें या चिह्नित सही करने के लिए बॉक्स की जांच में नमूना आईडी टाइप 'लागू करें।' इसके बाद, मेनू लेबल 'प्रयोग' ड्रॉप डाउन पर क्लिक करें और 'लाल' (दुर्लभ घटना का पता लगाने) का चयन और प्रवेश के लिए क्लिक करें।
- खंड चिह्नित 'परख 1.' में ले जाएँ 'नाम' खंड में परख (जैसे उदर) भरें और दर्ज करें। लेबल 'प्रकार' नीचे बॉक्स में ड्रॉप डाउन मेनू पर क्लिक करें और 'चैनल 1 अज्ञात' का चयन और प्रवेश के लिए क्लिक करें।
- खंड चिह्नित 'परख 2.' में ले जाएँ 'नाम' खंड में परख (जैसे HF183) भरें और दर्ज करें। लेबल 'प्रकार' नीचे बॉक्स में मेनू एक ड्रॉप डाउन क्लिक करें'चैनल 2 अज्ञात' का चयन और प्रवेश के लिए क्लिक करें घ। कदम से सभी जानकारी 3.3.2 3.3.4 अब अच्छी तरह A1 में प्रस्तुत करते हैं।
- बूंदों से युक्त बाद के सभी कुओं का नाम। कुल सेटअप समय बचाने के लिए, एक साथ कई कुओं का चयन करने के लिए 'शिफ्ट' या 'Ctrl,' पर क्लिक करें।
- थाली के डिजिटल चित्रण शारीरिक प्लेट, प्रेस 'ठीक है' मेनू के नीचे सही पर दर्पण है। नए मेनू है कि योजनाबद्ध प्लेट के शीर्ष पर प्रकट होता है, 'खाका' धारा के तहत चुनें 'के रूप में सहेजें' और नाम और प्लेट बचाने के लिए।
- स्क्रीन के बाईं ओर 'भागो' पर क्लिक करें और पॉप बाहर "भागो विकल्प" खिड़की में उचित डाई सेट का चयन करें। डेटा संग्रह शुरू की और सॉफ्टवेयर में वास्तविक समय में प्रदर्शित किया जाता है।
4. डेटा विश्लेषण और रिपोर्टिंग
- जब पाठक समाप्त हो गया है और एक बॉक्स प्रकट होता है 'पूरा भागो' बताते हुए, क्लिक करें 'ठीक है'।
नोट: मुलायमबर्तन सॉफ्टवेयर का 'विश्लेषण' धारा के तहत अंतिम डेटा फ़ाइल को प्रदर्शित करता है। इस दृश्य में, सॉफ्टवेयर सभी '2 डी आयाम' डेटा की साजिश करने के लिए चयनित थाली में कुओं और चूक है। - सकारात्मक और नकारात्मक बूंदों के बीच अलगाव की जाँच करें। सुनिश्चित करें कि एनटीसी कुओं में सभी बूंदों में प्रतिदीप्ति आधारभूत के पास हैं।
- लेबल बटन पर क्लिक करें 'घटनाक्रम'। प्रस्तुत हिस्टोग्राम के अधिकार के लिए बॉक्स 'कुल' नाम और बॉक्स प्रति अच्छी तरह से स्वीकार बूंदों की कुल संख्या प्रदर्शित करने के लिए तल पर नाम "एकल" पर क्लिक करें। Ctrl कुंजी पकड़ रहा है और अच्छी तरह से बाहर रखा जाना (ओं) पर क्लिक करके 10,000 बूंदों 7 युक्त <किसी भी कुओं को बाहर निकालें।
- बटन दोनों लक्ष्यों के लिए एनटीसी कुओं में नकारात्मक बूंदों से ऊपर लगभग एक मानक विचलन (500-700 प्रतिदीप्ति इकाइयों) पर फ्लोरोसेंट सीमा निर्धारित करने के लिए 'के रूप में 1 डी आयाम' चिह्नित पर क्लिक करें। स्क्रीन संयुक्त राष्ट्र के बहुत बाईं परder 'ऑटो का विश्लेषण करें' दो दहलीज बटन दिखा रहा है, एक ठोस गुलाबी क्षैतिज रेखा के माध्यम से यह चल रहा है कि सही करने के लिए आइकन चुनें।
- आयाम रेखांकन से प्रत्येक के तहत 'निर्धारित सीमा' के बाईं ओर बॉक्स में क्लिक करें और उचित प्रतिदीप्ति दहलीज मूल्यों दर्ज करें। μl प्रतिक्रिया प्रति कॉपी में लक्ष्य सांद्रता तो स्वचालित रूप से गणना कर रहे हैं।
नोट: थ्रेसहोल्ड विभिन्न लक्ष्यों के लिए समान होने की जरूरत नहीं है। - -1 डी आयाम स्क्रीन पर ऊपरी बाएँ हाथ के कोने में 'निर्यात' बटन पर क्लिक करके एक .csv फ़ाइल में परिणामों को निर्यात। .csv फ़ाइल में, 4 से निर्यात लक्ष्य एकाग्रता गुणा μl प्रतिक्रिया प्रति लक्ष्य की प्रतिलिपि (उदर एसपीपी के 23S जीन। HF183 या मार्कर) से इसे बदलने के लिए डीएनए टेम्पलेट μl प्रति लक्ष्य की नकल करने के लिए।
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Representative Results
एक अच्छा EntHF183 द्वैध dPCR रन स्वीकार कर लिया बूंदों (सीए 10,000-17,000) और नकारात्मक और सकारात्मक बूंदों 7 के लिए प्रतिदीप्ति मूल्यों के बीच अपेक्षाकृत बड़े अंतर (सीए 5000) के अपेक्षाकृत उच्च संख्या में परिणाम चाहिए। बूंदों के असामान्य रूप से कम संख्या में होने की संभावना छोटी बूंद पीढ़ी प्रक्रिया में मुद्दों को इंगित करता है, और 10,000 बूंदों की कटऑफ इस लेख में इस्तेमाल छोटी बूंद dPCR सिस्टम से अनुभवजन्य डेटा के आधार पर सुझाव दिया है। एक कमजोर जुदाई (यानी छोटे प्रतिदीप्ति अंतर) सकारात्मक और नकारात्मक बूंदों के बीच अवरोध या अपमानित जांच 7 संकेत हो सकता है।
कुल मिलाकर, EntHF183 द्वैध dPCR परख जब qPCR मानकों के साथ जुड़े पूर्वाग्रहों के लिए सही है और वहाँ कोई निषेध 7 कि सिंप्लेक्स qPCR से करने के लिए अत्यधिक तुलनीय परिणाम पैदा करता है। EntHF183 द्वैध dPCR परख और भ्रष्टाचार से परिणामजवाब सिंप्लेक्स dPCR assays अत्यधिक संगत और अक्सर दो प्रारूपों 7 (चित्रा 1) के बीच पृथक कर रहे हैं। इसके अतिरिक्त, dPCR परख भी परिमाण अपने समकक्षों qPCR 7 (चित्रा 2) द्वारा सहन तुलना में अधिक से एक दो के आदेश सांद्रता अवरोध बर्दाश्त कर सकते हैं।
चित्रा 1:। EntHF183 द्वैध dPCR परख द्वारा मल और पानी के नमूने और इसी सिंप्लेक्स dPCR assays वाम और सही पैनल की मात्रा क्रमश: उदर और HF183 मात्रा का ठहराव प्रदर्शित, डुप्लेक्स और सिंप्लेक्स परिणाम के बीच इसी सहसंबंध गुणांक (पी <0.001) के साथ। ठोस लाइनों प्रतिगमन लाइनों से संकेत मिलता है और ग्रे छायांकन इसी मानक त्रुटियों को इंगित करता है। प्रतीकों के नमूने के विभिन्न प्रकार से संकेत मिलता है (मंडलियां, त्रिकोण s और पार मल, मीठे पानी, और समुद्री पानी के नमूने, क्रमशः) निरूपित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2:। सिंप्लेक्स qPCR और साफ सीवेज डीएनए में HF183 मार्कर की मात्रा का ठहराव dPCR द्वैध पीसीआर अवरोधकों की सांद्रता (humic एसिड) त्रिकोण और एक्स-पार क्रमश निरूपित dPCR और qPCR मात्रा का ठहराव में वृद्धि के साथ नुकीला। अवरोधकों के अभाव में उम्मीद की मात्रा का ठहराव HF183 (दो क्षैतिज बिंदीदार लाइनों के बीच यानी) 95% विश्वास अंतराल के रूप में परिभाषित किया गया है। एक "-1" परिणाम का संकेत गैर पता लगाने। Enterococcus मात्रा का ठहराव इसी qPCR परख 7 से तुलना EntHF183 द्वैध dPCR परख द्वारा अवरोधकों को इसी तरह से उच्च सहिष्णुता से पता चलता है।= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53611/53611fig2large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। सबसे पहले, परख मिश्रण के मिश्रण के लिए मुश्किल हो सकता है क्योंकि मास्टर मिश्रण पारंपरिक qPCR मास्टर घोला जा सकता है और अधिक से अधिक चिपचिपा है। सरल vortexing अपर्याप्त मिश्रण है, जो बारी में परख मिश्रण में और बाद में बूंदों में डीएनए टेम्पलेट्स के गैर वर्दी वितरण करने के लिए सुराग के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। मिक्सिंग-से-pipetting तकनीक प्रोटोकॉल में वर्णित सटीक dPCR मात्रा का ठहराव सुनिश्चित करने के लिए पीछा किया जाना चाहिए। दूसरा, यह सुनिश्चित करने के लिए बूंदों एक समान आकार और आकार में उत्पन्न कर रहे हैं महत्वपूर्ण है। अवसरों को ध्यान में रखना जब समय छोटी बूंद जनरेटर छोटी बूंद पीढ़ी को पूरा करने पर एक कारतूस सामान्य से कम है लेता है। इस सबऑप्टिमल छोटी बूंद पीढ़ी का संकेत हो सकता। यदि आवश्यक हो, एक कारतूस पर छोटी बूंद पीढ़ी समय समस्या निवारण के लिए दर्ज किया जा सकता है। तीसरा, यह कर्तन के बिना अंतिम पीसीआर थाली करने के लिए कारतूस से उत्पन्न बूंदों के पूरे 40 μl हस्तांतरण करने के लिए महत्वपूर्ण हैबूंदों और मात्रा का ठहराव के लिए पर्याप्त बूंदों नहीं होने से बचें। निम्नलिखित तकनीक हस्तांतरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: 1) 40 μl के लिए मल्टीचैनल pipet सेट और एक 45 डिग्री के कोण पर कारतूस (चिह्नित 'बूंदों') का सही अनुभाग में सुझाव दिए डालने; 2) Pipet बाहर धीरे धीरे और सुनिश्चित करें कि सभी बूंदों को pipetted हैं (ध्यान दें कि यदि किसी भी बूंदों को पीछे छोड़ रहे हैं और एक दूसरे दौर के लिए ऊपर pipetted किए जाने की जरूरत है) लेने के लिए बूंदों; 3) एक बार बूंदों को हटा रहे हैं, लगभग आधे रास्ते नीचे अच्छी तरह से दीवार के खिलाफ pipet टिप डाल द्वारा अंतिम प्लेट के लिए उन्हें स्थानांतरित और धीरे धीरे बूंदों निष्कासित।
EntHF183 द्वैध dPCR परख ही analytes के लिए मौजूदा व्यक्तिगत qPCR assays पर काफी फायदे हैं। सबसे पहले, डुप्लेक्स dPCR परख, अज्ञात बढ़ाता के लिए मानक घटता की जरूरत नहीं है जिससे qPCR मात्रा का ठहराव मानकों 7 में परिवर्तनशीलता के साथ जुड़े पूर्वाग्रहों को नष्ट करने। दूसरा, डुप्लेक्स dPCR परख रोकना बर्दाश्त कर सकते हैंया सांद्रता कि परिमाण इसी qPCR assays 7 द्वारा सहन तुलना में अधिक के आदेश 1-2 कर रहे हैं। यह सुविधा द्वैध dPCR परख बहुत पर्यावरण के नमूनों (जैसे तूफानी जल नमूने) कि अक्सर पीसीआर को निरोधात्मक पदार्थ होते विश्लेषण करने के लिए आकर्षक बना देता है। तीसरा, क्षमता एक साथ दोनों Enterococcus एसपीपी। और एक डुप्लेक्स dPCR परख में HF183 मार्कर (उन्हें दो qPCR assays में अलग से यों करने के लिए होने बनाम) यों की है और अधिक लागत प्रभावी और 7 के साथ जुड़े संचयी pipetting परिवर्तनशीलता से बचने के द्वारा डेटा मात्रा में सुधार का आयोजन दो अलग assays (बनाम एक डुप्लेक्स dPCR परख)। चौथा, डुप्लेक्स dPCR परख भी इसी qPCR assays की तुलना में उच्च परिशुद्धता और repeatability का प्रदर्शन किया, तुलनात्मक अध्ययन 7 में पूर्व एक अच्छा विकल्प बना रही है।
फिर भी, सीमाओं इस विधि के लिए मौजूद हैं (फायदे और सीमाओं में विस्तार से वर्णितकहीं और 7)। सबसे पहले, प्रतिक्रिया प्रति स्वीकार कर लिया बूंदों की संख्या ऊपरी सीमा नहीं dPCR मात्रा का ठहराव के (UQL) निर्धारित करता है। इस काम में इस्तेमाल dPCR साधन (सामग्री / उपकरण की सूची को देखें) प्रतिक्रिया प्रति 10 5 नकल के एक UQL है करने के लिए सूचित किया गया है। यह 5 एक्स 10 5 Enterococcus कोशिकाओं और 2 एक्स 10 6 HF183 पानी की 100 मिलीलीटर प्रति प्रतियां संभालने पहले 7 वर्णित डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल का पालन किया जाता है और 100 μl डीएनए प्राप्त किया जाता है (यानी प्रति डीएनए निष्कर्षण के दौरान क्षालन कदम) 100 से मेल खाती है dPCR 7 से पहले नमूना प्रसंस्करण के दौरान बिना किसी नुकसान के पानी की मिलीलीटर। पर्यावरण के पानी आम तौर पर उदर और HF183 के ऐसे सांद्रता अधिक नहीं है। हालांकि, एक नमूना कमजोर पड़ने सीवेज फैल निम्नलिखित ऐसे पशु मल, कच्चे सीवेज और पानी के नमूने एकत्र तुरंत रूप में उच्च एकाग्रता के नमूने के लिए विचार किया जाना चाहिए। दूसरा, कुल डीएनए की उच्च सांद्रता (includiएनजी दोनों लक्ष्य और गैर लक्ष्य डीएनए) छोटी बूंद विभाजन की प्रक्रिया के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। यह एंजाइमों 7 प्रतिबंध से pretreatment के बिना अधिक से अधिक 66 एनजी कुल डीएनए का उपयोग करने की सलाह नहीं दी है। तीसरा, हालांकि EntHF183 द्वैध dPCR परख काफी अधिक qPCR से निषेध के खिलाफ मजबूत है, इस परख अभी भी झूठी नकारात्मक परिणाम निकल सकते हैं, तो गंभीर अवरोध से होने वाली पीसीआर प्रवर्धन से बचाता है। निषेध नियंत्रण उपायों इसलिए अभी भी लागू किया जाना चाहिए। इसके अलावा स्टैंडर्ड या कमजोर पड़ने तरीके के रूप में पहले से वर्णित निषेध 7 आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। पिछले है, डुप्लेक्स परख केवल एक dPCR मंच पर मान्य किया गया है, और विधि मान्यता उपयोग करने से पहले अन्य डिजिटल पीसीआर प्लेटफार्मों पर आयोजित किया जाना चाहिए।
यह पहली बार प्रकाशित द्वैध डिजिटल पीसीआर परख है कि एक साथ एक व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते हैं पानी की गुणवत्ता का सूचक है और मल संदूषण 7 के लिए एक लोकप्रिय मेजबान जुड़े मार्कर quantifies है। प्रदर्शन के फायदेEntHF183 द्वैध dPCR परख वादा माइक्रोबियल स्रोत ट्रैकिंग में डिजिटल पीसीआर प्रौद्योगिकी के अन्य उपयोगी अनुप्रयोगों, रोगज़नक़ों और एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीनों का पता लगाने के। उदाहरण के लिए, एक सामान्य मल सूचक (उदर एसपीपी।, ई कोलाई, सामान्य Bacteroidales) और एक मेजबान जुड़े मल मार्कर (HF183, HumM2, CowM2, LeeSeagull) 2 (EntHF183 द्वैध dPCR परख के रूप में) में इसी तरह से जोड़ा जा सकता है अधिक लागत प्रभावी और सामान्य और मेजबान जुड़े मल प्रदूषण की सही मात्रा का ठहराव के लिए एक डुप्लेक्स dPCR परख। माइक्रोबियल स्रोत ट्रैकिंग एक ही स्रोत (या विभिन्न स्रोतों) को निशाना मार्करों भी मल स्रोत का पता लगाने में विश्वास बढ़ाने के लिए (या एक साथ कई मल स्रोतों के बारे में जानकारी प्राप्त) द्वैध dPCR परख में रखा जा सकता है। पीसीआर अवरोधकों के खिलाफ उच्च सहिष्णुता भी पता लगाने रोगजनकों कम संक्रामक खुराक है, लेकिन वातावरण में ही मौजूद हैं कि की संभावना में वृद्धि करने के लिए उच्च नमूना मात्रा का विश्लेषण अनुमति दे सकता हैकम मात्रा में पानी onmental। qPCR पर डिजिटल पीसीआर की इसी पद्धति के फायदे भी एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीनों की मात्रा का ठहराव के लिए डिजिटल पीसीआर assays विकसित करने के लिए आवेदन कर सकता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low Bind Microtubes | Costar | 3207 | For storage of reagents, samples/production of master mixes |
| Nuclease Free Water | FisherSci | BP2484-50 | |
| TE pH 8 buffer | FisherSci | BP2473-100 | |
| Hardshell 96 Well Plate | BioRad | HSP-9601 | For initial master mix and sample inoculation |
| Aluminum Sealing Film | BioRad | 359-0133 | To seal sample plate |
| Droplet Generator | BioRad | 186-3002 | |
| Droplet Generation Oil | BioRad | 186-3005 | |
| Cartridge | BioRad | 186-4008 | |
| DG8 Cartridge Holder | BioRad | 186-3051 | |
| Gasket | BioRad | 186-3009 | |
| 20 μl pipet tips | Rainin | GP-L10F | For tansferring sample/master mix to cartidge |
| 200 μl pipet tips | Rainin | GP-L200F | For transferring droplets to final Twin.Tec Plate |
| Twin.Tec 96 Well Plate | Eppendorf | 951020320 | For final droplets thermal cycling and reading |
| Pierceable Heat Seal Foil | BioRad | 181-4040 | To seal Twin.Tec plate before thermalcycling |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 181-4000 | |
| CFX96 Thermalcycler | BioRad | CFX96 and C1000 | Only the thermal cycler is needed, no optics |
| QX100 Droplet Reader | BioRad | 186-3001 | |
| Droplet Reader Oil | BioRad | 186-3004 | |
| Droplet PCR Supermix | BioRad | 186-3024 | i.e. the digital PCR mix in manuscript |
| QuantaSoft software (v1.3.2) | Quantasoft | QX100 | For viewing, analyzing, and exporting ddPCR data |
| Entero Forward Primer (Ent F1A) | Operon | GAGAAATTCCAAACGAACTTG | Alternative vendor can be used |
| Entero Reverse Primer (Ent R1) | Operon | CAGTGCTCTACCTCCATCATT | Alternative vendor can be used |
| Entero Probe (GPL813TQ) | Operon | [6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1] | Alternative vendor can be used, but the florophore has to be FAM |
| HF183 Forward Primer (HF183-1) | Operon | ATCATGAGTTCACATGTCCG | Alternative vendor can be used |
| HF183 Reverse Primer (BthetR1) | Operon | CGTAGGAGTTTGGACCGTGT | Alternative vendor can be used |
| HF183 Probe (BthetP1) | Operon | [6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1] |
Alternative vendor can be used, but the florophore has to be HEX (if using VIC, then the appropriate matric compensation must be chosen. |
| Positive control | Mixture of E. faecalis genomic DNA and HF183 standard plasmid (ordered from IDT). For detailed methods in culturing E. faecalis and sequences of the ordered HF183 plasmid, please see Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercilaly available Enterococcus DNA standards (ATCC 29212Q-FZ) can also be used in the positive control in place of lab-prepared E. faecalis genomic DNA. |
References
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