Summary
Dette håndskrift beskriver en duplex digital PCR-assay, der kan anvendes til samtidigt at kvantificere Enterococcus spp. Og HF183 genetiske markører som indikatorer for generel og human-associeret fækal kontamination i rekreative vandområder.
Abstract
Dette håndskrift beskriver en duplex digital PCR-assay (EntHF183 dPCR) til samtidig kvantificering af Enterococcus spp. Og det humane fækale-associerede HF183 markør. Den EntHF183 duplex dPCR (benævnt som EntHF183 dPCR herom) assay bruger de samme primer og probe sekvenser som de offentliggjorte individuelle kvantitativ PCR (qPCR) modstykker. Ligeledes er de samme vand filtrering og DNA ekstraktion som udføres før qPCR fulgt inden du kører dPCR. Imidlertid duplex dPCR assayet har flere fordele i forhold til qPCR assays. Vigtigste, dPCR assayet eliminerer behovet for at køre en standardkurve og dermed den tilhørende bias og variabilitet, ved direkte kvantificering af sine mål. Hertil kommer, mens dupleksudskrivning (dvs. samtidig kvantificering) Enterococcus og HF183 i qPCR ofte fører til alvorlig undervurdering af mindre rigelige mål i en prøve, dPCR giver konsekvent kvantificering af begge mål, hvæssehende kvantificeres individuelt eller samtidigt i den samme reaktion. Den dPCR analysen er også i stand til at tolerere PCR inhibitor koncentrationer, som er en til to størrelsesordener højere end de tolereres af qPCR. Disse fordele gør EntHF183 dPCR analysen særligt attraktivt, fordi det samtidig giver nøjagtig og reproducerbar oplysninger om både generelle og human-associeret fækal forurening i vandmiljøet uden behov for at køre to separate qPCR assays. Trods sine fordele i forhold qPCR, den øverste kvantificering grænse for dPCR analysen med i øjeblikket tilgængelig instrumentering er cirka fire størrelsesordener lavere end der kan opnås ved qPCR. Derfor er der behov for fortynding til måling af høje koncentrationer af målorganismer såsom dem, der typisk observeres efter spildevand udslip.
Introduction
Kvantitativ PCR (qPCR) metoder er ofte blevet brugt til rekreative overvågning af vandkvalitet og mikrobielle kildesporing applikationer, fordi de er hurtigere, mere fleksibel og specifik i forhold til traditionelle kultur-baserede metoder. Derfor er qPCR anbefales for at opnå hurtige vandovervågningsnet resultater for generelle fækale indikatorer såsom Enterococcus spp. I de reviderede USEPA rekreative vand kvalitetskriterier 1. Mange qPCR assays er også blevet udviklet og valideret til at identificere kilder til fækal forurening i vandmiljøet 2. Blandt disse er de HF183 markør assays er blandt de hyppigst anvendte til at identificere humant-associeret fækal forurening 3.
Dog kan qPCR resultater ofte være forudindtaget, fordi de er afhængige af standard kurver for kvantificering. qPCR kvantificerer ukendte koncentrationer af mål i prøver ved at interpolere deres kvantificering cyklus (Cq) fra en standard kurve, der beskriver en lineær sammenhæng mellem Cq og logaritmisk mængde af et sæt af serielt fortyndede standarder. Mangel på pålidelige og konsekvent standard referencemateriale kan derfor i høj grad forspænde qPCR resultater. Undersøgelser viste, at qPCR resultater afveg ca. ½ log vha standarder fra forskellige leverandører 4 og med 2-fold under anvendelse af forskellige batches af standarder fra samme leverandør 5.
Digital PCR (dPCR) teknologi kvantificerer en ukendt prøve ved at tælle frekvensen af positive i stort antal af miniature PCR, der er genereret ved at opdele en bulk qPCR i tusinder eller millioner af ensartet nanoliter eller picoliter reaktioner 6. Det er nævnt som dråbe digital PCR (dvs. denne artikel) eller kammer digital PCR henholdsvis hvis partitioner er vand-i-olie dråber (dvs. denne artikel) eller små kamre på en chip. En højere koncentration prøve vil resultere i nærvær af mål-DNA(Dermed positiv PCR) i en højere andel af skillevægge, et forhold tilnærmes ved Poisson-fordeling. Som sådan er de binære resultater (positiv eller negativ PCR) registreres og frekvensen af positive dråber anvendes til at beregne ukendte prøvekoncentrationer direkte via Poisson tilnærmelse, hvilket eliminerer behovet for en standardkurve som i qPCR.
Denne binære karakter af digital PCR kvantificering giver yderligere fordele i forhold til qPCR 7. Fordi forsinket amplifikation stadig kan give en positiv PCR, dPCR kvantificering er mere robust over for inhibering, som reducerer virkningsgrad for forstærkningen. Tilsvarende er dPCR kvantificering ikke påvirket af variationer i CQ værdier er qPCR, hvilket fører til højere præcision dPCR sammenlignet med qPCR 8-10.
Desuden fordelingsprocessen sikrer en meget lille mængde af mål-DNA til stede i hver dråbe, effektivt minimerer substrat konkurrence (under amplification af forskellige DNA-mål), som er fælles hindringer for at opnå duplex (dvs. en assay samtidig måler to DNA-mål) i qPCR. Som sådan, uanset om løb duplex eller simplex (dvs. et mål måles i et enkelt assay) dPCR producerer næsten ikke skelnes kvantificering af begge mål 7,11.
Målet med den digitale PCR assay (EntHF183 dPCR) beskrevet i denne artikel er at opnå samtidig direkte kvantificering af den generelle fækal indikator Enterococcus spp. Og menneske-fækal forbundet HF183 markør med forbedret præcision, reproducerbarhed og robusthed mod hæmning i forhold til sin qPCR modstykker. Denne analyse er med succes blevet anvendt til kvantificering fækal forurening i miljøet ferskvand, havvand, og diverse afføring 7, men kan også anvendes på andre typer af farvande og spildevand. Denne analyse lover godt for at analysere sedimenter eller jord på grund af dets høj tolerance til hæmning, men yderligere test er nødvendig på grund af kompleksiteten af inhibitor blander i disse typer af prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Assay Blanding Forberedelse
- Gør 100 pmol / L stamkoncentrationer for alle primere i vand af molekylærbiologisk kvalitet og prober i TE pH 8 puffer [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ 12; HF183-1, BthetR1, BthetP1 3].
Bemærk: Prober til de to mål fluorescens mærket med forskellige fluoroforer 7 som angivet i Liste over materialer / udstyr. - Forbered mester mix ved at blande, pr reaktion planlagt 12 pi digital PCR mix (2x lager, se liste over materialer / udstyr), 0,216 pi hver forward og reverse primer, 0,06 pi hver fluorescerende probe, og 5,016 pi nuklease frit vand (slutkoncentration : 900 nM af hver primer, 250 nM af hver probe). Pipettere op og ned mindst 10 gange for at blande samtidig tage forsigtighed for ikke at indføre luftbobler i opløsningen.
- Pipette 18 pi mastermix (fra trin 1.2) i en regelmæssig PCR-rør eller plade, blanding i 6 pi DNA template (ekstraheret som beskrevet previouSly 13) for at gøre assay blandingen i små dråber generation. Hvis du kører prøver i to eksemplarer, pipette 36 pi mester mix og 12 pi DNA-skabelon til hver brønd. Efterlad de tilsvarende replikatbrønde tom på pladen. Medtag positive kontroller (se liste over materialer / udstyr) og ingen skabelon kontroller (NTC) (dvs. med molekylærbiologisk kvalitet vand, der anvendes som skabelon).
Bemærk: Positiv kontrol er nødvendig for at sikre analysen kører korrekt og NTC er nødvendigt for at sikre, at der ikke er nogen forurening inden pladen og indstille fluorescerende baseline senere i dataanalyse. Første gang brugere anbefales at bruge begge ufortyndede og fortyndede DNA-prøver.
2. Droplet Generation og PCR Plate Setup
- Bland assayblandinger ved pipettering op ned cirka 15 gange under anvendelse af en multikanal pipette. Sørg for, at pipettespidsen holder sig inden væske at undgå at gøre overskydende bobler i blandingen.
- Insert patron 1 (indeholdende 8 brønde) i en hvid patronholder og klik patronen holder lukket. Cartridge 1 er nu på plads og kan ikke løsnes fra holderen samtidig med at generere dråber. Ved hjælp af en multikanal pipette forsigtigt overføre 20 ul assay blandingen i den midterste position af patronen mærket "Sample" uden at indføre luftbobler.
- Pipette i 70 ul generation dråber olie til venstre side af patronen (mærket "Olie").
- Cover patron med en pakning og sørg pakningen er flad og holdes jævnt af 4 flåter mod kanten af patronen. Tryk på den grønne oplyste knap på dråben generator til at åbne og placere patronen. Tryk grøn-lit knappen igen for at lukke generatoren.
Bemærk: Når døren lukker, knappen er nedtonet, kan døren ikke genåbnes og generering dråbe begynder straks at fortsætte i ca. 1 min. - Hvis gør mere end 8 reaktioner, sted patron 2 i en andenhvid patronholder og forberede sig på samme måde som patron 1, mens generation dråbe er i gang for at spare samlede setup tid.
- Åbn dråben generator døren, når den dim tændt knap bliver grøn indikerer afsluttet dråbe generation. Fjern det hvide patronholder indeholder patron 1, der er afsat, og sted patron 2 på dråben generator.
- Fjern pakningen fra patronen 1 og kassér. overføre forsigtigt samlede volumen (ca. 40 ul) af genererede dråber fra den tredje kolonne af patronen (mærket 'Dråber') på en endelig PCR-plade (holdes ved stuetemperatur) til termisk cykling.
Bemærk: Du må ikke derefter fjerne markeringen den hvide patronholder som handlingen kan bryde de nyligt genererede dråber; kun åbne kassetteholderen efter dråberne er blevet overført til den endelige plade. - Gentag trin 2,1-2,7 for yderligere prøver.
- Når alle dråberne er i den sidste PCR-plade, placere en gennemtrængeligfolie dækning på toppen af pladen og læg den på en tallerken sealer. Indstil sealer til 180 ° C, tryk på 'Play' på sealer og lad tætning til 10 sek.
3. Termisk Cykling og Droplet Reading
- Placer forseglede plade på termiske cykler, én kompatibel med den endelige PCR-plade anvendt i trin 2.7, og en temperaturreguleringsstation hastighed på 2,0 ° C / sekund.
- Kør termisk program som følger: 10 minutter ved 95 ° C, efterfulgt af 40 cykler af 30 sekunder ved 94 ° C og 60 sekunder ved 60 ° C, efterfulgt af en 10 minutters pause ved 98 ° C (valgfri endelig hold ved 4 eller 15 ° C).
- Ved afslutningen af cykling, overføre pladen til en Droplet Reader til automatisk måling af fluorescens i hver dråbe i hver brønd. Alternativt opbevares pladen ved 4 ° C i op til 3 dage før dråbe læsning. Sørg dråberne har stuetemperatur, før du fortsætter med at læse.
- Åbn den medfølgende software til opsætning læsning dråbe. Imenuen 'Setup' standard indeholder en skematisk af en tom plade med 96, dobbelt klik på godt A1 for at åbne menuen indeholder tre afsnit: "Prøve, '' Assay 1 'og' Assay 2."
- I 'Eksempel' sektionen skrive prøve-ID ind i feltet 'Navn' og tryk enter eller check boksen til højre markeret 'Anvend'. Klik derefter på drop down menu mærket "Experiment" og vælg 'RED' (sjælden afsløring begivenhed), og klik ind.
- Flyt til afsnittet betegnet "Assay 1." I 'Navn' sektion udfylde analysen (f.eks Enterococcus) og klik ind. I boksen nedenfor mærket 'Type' klikke på drop down menuen og vælg 'Kanal 1 Ukendt' og klik ind.
- Flyt til afsnittet betegnet "Assay 2." I 'Navn' sektion udfylde analysen (f.eks HF183) og klik ind. I boksen nedenfor mærket 'Type' klikke på rullemenuen end Vælg 'Kanal 2 Unknown' og klik ind. Alle oplysninger fra trin 3.3.2 til 3.3.4 er nu til stede i godt A1.
- Name alle efterfølgende brønde indeholdende dråber. For at spare samlede setup tid, klik på 'Shift' eller 'Ctrl, "for at vælge flere brønde på samme tid.
- Når den digitale skildring af pladen afspejler den fysiske plade, tryk på OK nederst til højre i menuen. I den nye menu, der vises på toppen af pladen skematiske, under 'Skabelon' sektion vælg 'Save As' og navn og gemme pladen.
- Til venstre på skærmen klikke 'Kør' og vælg passende Dye Set i pop-out "Run Options" vinduet. Dataindsamling igangsætter og vises i realtid i softwaren.
4. Dataanalyse og rapportering
- Når læseren er færdig og en boks vises det, "Run Complete", klik på 'OK'.
Bemærk: Den blødeware viser den endelige datafil under afsnittet "Analyser" af softwaren. I denne visning softwaren har alle de brønde i pladen udvalgte og standard den '2D Amplitude "data plot. - Check adskillelsen mellem de positive og negative dråber. Sørg for, at fluorescens i alle dråber i de NTC brønde er nær baseline.
- Klik på knappen 'Events'. Til højre for præsenterede histogram klikke på feltet med navnet "I alt" og boksen med navnet "single" i bunden for at vise det samlede antal accepterede dråber per brønd. Udeluk alle brønde, der indeholder <10.000 dråber 7 ved at holde Ctrl-tasten nede og klikke på godt (er), der skal udelukkes.
- Klik på knappen betegnet som '1D Amplitude' for at indstille den fluorescerende tærskel på ca. en standardafvigelse (500-700 fluorescensenheder) ovenfor de negative dråber i NTC brønde til begge mål. I det venstre hjørne af skærmen unwho den 'Auto Analyser' viser to tærskel knapper, skal du vælge ikonet til højre, der har en solid lyserød vandret linje, der løber igennem den.
- Klik i boksen til venstre for 'Set Threshold "under hver af de amplitude grafer og indtast de relevante fluorescens tærskelværdier. Koncentrationerne mål i kopi pr pi reaktion derefter beregnes automatisk.
Bemærk: Tærskelværdierne behøver ikke at være ens for de forskellige mål. - Eksportere resultaterne i en .csv-fil ved at klikke på knappen 'Export' i øverste venstre hjørne på skærmen 1D Amplitude. I .csv-filen, multipliceres eksporterede målkoncentration med 4 for at konvertere det fra kopi af target (23S genet af Enterococcus spp. Eller HF183 markør) per pi reaktion til at kopiere af mål pr pi DNA-skabelon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En god EntHF183 duplex dPCR løb bør resultere i relativt højt antal accepterede dråber (ca. 10,000-17,000) og relativ stor forskel (ca. 5000) mellem fluorescens-værdier for negative og positive dråber 7. Usædvanligt lave antal dråber sandsynligvis indikerer problemer i dråben generation proces, og en cutoff på 10.000 dråber foreslås baseret på empiriske data fra dråben dPCR system, der anvendes i denne artikel. En svagere adskillelse (dvs. mindre fluorescens forskel) mellem positive og negative dråber kan indikere inhibering eller nedbrudte prober 7.
Samlet set EntHF183 duplex dPCR assay producerer meget sammenlignelige resultater til at fra simplex qPCR når qPCR er korrigeret for fordomme forbundet med standarder, og der er ingen hæmning 7. Resultater fra EntHF183 duplex dPCR assay og Regionsudvalgetresponderende simplex dPCR assays er meget konsekvent og ofte ikke skelnes mellem de to formater 7 (figur 1). Endvidere kan dPCR assayet også tolerere inhibitorkoncentrationer en til to størrelsesordener højere end tolereres af dets qPCR modstykker 7 (figur 2).
Figur 1:. Kvantificering af fækale og vandprøver fra EntHF183 duplex dPCR analysen og den tilsvarende simplex dPCR analyser Venstre og højre paneler vise Enterococcus og HF183 kvantificering henholdsvis med de tilsvarende korrelationskoefficienter (p <0,001) mellem duplex og simplex resultater. Solid linjer angiver regressionslinjerne og den grå skygge angiver de tilsvarende standardafvigelser. Symboler angiver forskellige typer af prøver (Circles, trekant s og kors betegne fecal, ferskvand, og marine vandprøver, henholdsvis). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Simplex qPCR og duplex dPCR kvantificering af HF183 markør i rent spildevand DNA tilsat stigende koncentrationer af PCR-inhibitorer (humussyre) Trekanter og x-kors betegne dPCR og qPCR kvantificering hhv.. Den forventede HF183 kvantificering i fravær af inhibitorer er defineret som 95% konfidensinterval (dvs. mellem de to vandrette stiplede linjer). En "-1" resultat indikerer ikke-detektion. Enterococcus kvantificering viser tilsvarende højere tolerance over for inhibitorer af EntHF183 duplex dPCR assay end ved den tilsvarende qPCR analysen 7.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53611/53611fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er et par kritiske trin i protokollen. Først, kan blanding af assayblandinger være vanskeligt, fordi master mix er mere viskøs end konventionelle qPCR masterblandinger. Simpel vortexing kan føre til utilstrækkelig blanding, hvilket igen fører til uensartet fordeling af DNA-templates i assayblandinger og efterfølgende i små dråber. Blanding-by-pipetteringsteknik beskrevet i protokollen skal følges for at sikre nøjagtig dPCR kvantificering. For det andet er det vigtigt at sikre dråber genereres ved en ensartet form og størrelse. Vær opmærksom på lejligheder, hvor tiden dråbens generatoren tager at fuldføre dråbe generation på en patron er kortere end normalt. Dette kan indikere suboptimal generation dråbe. Hvis det er nødvendigt, kan optages generation dråbe tid på hver patron til fejlfinding. Det tredje er det vigtigt at overføre hele 40 pi genererede dråber fra patronen til den endelige PCR-plade uden forskydning afdråber og undgå ikke at have nok dråber til kvantificering. Følgende teknikker kan anvendes til overførsel: 1) Sæt multikanal pipette til 40 pi og indsætte tips til den rigtige afdeling af patronen (mærket 'Dråber') i en 45 ° vinkel; 2) Pipetter dråberne langsomt ud, og sikre, at alle dråberne pipetteres op (notere, hvis nogen dråber er efterladt og skal pipetteres op til en anden runde); 3) Når dråberne er fjernet, overføre dem til den endelige plade ved at sætte pipettespidsen mod brønden væg ca. halvvejs ned og udvise dråberne langsomt.
Den EntHF183 duplex dPCR analysen har store fordele i forhold til eksisterende individuelle qPCR assays til de samme analytter. For det første er duplex dPCR analysen ikke brug standardkurver til kvantificering ubekendte, hvilket eliminerer qPCR kvantificering fordomme forbundet med variation i standarder 7. For det andet kan duplex dPCR analysen tolerere hæmmereller koncentrationer, som er en til to størrelsesordener højere end tolereres af de tilsvarende qPCR assays 7. Denne funktion gør duplex dPCR analysen meget attraktivt til analyse miljøprøver (f.eks regnbetingede prøver), der ofte indeholder stoffer hæmmende til PCR. For det tredje, at kapaciteten samtidig kvantificere både Enterococcus spp. Og HF183 markør i en duplex dPCR assay (vs. at skulle kvantificere dem separat i to qPCR assays) er mere omkostningseffektiv 7 og forbedrer datamængde ved at undgå akkumulerende pipettering variation forbundet med ledende to separate analyser (vs. en duplex dPCR assay). For det fjerde, duplex dPCR analysen viste også højere præcision og gentagelsesnøjagtighed sammenlignet med de tilsvarende qPCR assays, hvilket gør den tidligere et godt alternativ i komparative studier 7.
Alligevel eksisterer begrænsninger for denne metode (fordele og begrænsninger beskrevet detaljeretandetsteds 7). Det første er antallet af accepterede dråber pr reaktionen bestemmer den øvre kvantificeringsgrænsen (UQL) i dPCR. Den dPCR instrument, der anvendes i dette arbejde (se listen over stoffer / udstyr) er blevet rapporteret at have en UQL af 10 5 kopi pr reaktion. Dette svarer til 5 x 10 5 Enterococcus-celler og 2 x 10 6 HF183 kopier pr 100 ml vand under antagelse af tidligere 7 beskrevne DNA-ekstraktion protokol følges, og der opnås 100 pi DNA (dvs. pr elueringstrinnet under DNA-ekstraktion) fra 100 ml vand uden tab under prøve behandling før dPCR 7. Miljømæssige farvande generelt ikke overskride sådanne koncentrationer af Enterococcus og HF183. Dog bør prøve fortynding overvejes til høje koncentration prøver såsom dyrs afføring, rå spildevand og vandprøver indsamlet umiddelbart efter en spildevand spill. For det andet, høje koncentrationer af totalt DNA (including både mål og ikke-mål-DNA) kan forstyrre dråben partitionering proces. Det anbefales ikke at bruge mere end 66 ng total DNA uden forbehandling af restriktionsenzymer 7. For det tredje, selv om EntHF183 duplex dPCR assayet er betydeligt mere robust over for inhibering end qPCR, dette assay kan stadig give falske negative resultater, hvis alvorlig inhibering forhindrer PCR-amplifikation i at opstå. derfor fortsat skal iværksættes Inhibition kontrolforanstaltninger. Standardaddition eller fortynding metoder som tidligere beskrevet kan anvendes til at vurdere inhibering 7. Endelig har duplex-analysen kun blevet valideret på én dPCR platform, og metodevalidering skal udføres på andre digitale PCR platforme før brug.
Dette er den første offentliggjorte duplex digital PCR-assay, der samtidig kvantificerer en bredt accepteret indikator vandkvalitet og en populær vært-associeret markør for fækalt kontaminering 7. De demonstrerede fordeleaf EntHF183 duplex dPCR assay løfte andre nyttige anvendelser af digital PCR-teknologi i mikrobiel kildesporing, detektion af patogener og antibiotikaresistens gener. For eksempel kan en generel fækal indikator (Enterococcus spp., E. coli, generelt Bacteroidales) og en vært-associeret fækal markør (HF183, HumM2, CowM2, LeeSeagull) 2 parres tilsvarende (som i EntHF183 duplex dPCR assay) i en duplex dPCR assay for mere omkostningseffektiv og nøjagtig kvantificering af almen og vært-associeret fækal forurening. Mikrobielle kildesporing markører rettet mod samme kilde (eller forskellige kilder) kunne også blive parret i duplex dPCR assay til at øge tilliden til detektering af fækal kilde (eller få oplysninger om flere fækale kilder samtidigt). Den højere tolerance mod PCR-inhibitorer kan også tillade analyse af større prøvevolumen at øge sandsynligheden for at opdage patogener, der har lave infektiøse doser, men er kun til stede i envirmæssig vand i lave koncentrationer. Lignende metodiske fordele ved digital PCR end qPCR kunne også gælde for udvikling af digitale PCR assays til kvantificering af antibiotikaresistensgener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low Bind Microtubes | Costar | 3207 | For storage of reagents, samples/production of master mixes |
| Nuclease Free Water | FisherSci | BP2484-50 | |
| TE pH 8 buffer | FisherSci | BP2473-100 | |
| Hardshell 96 Well Plate | BioRad | HSP-9601 | For initial master mix and sample inoculation |
| Aluminum Sealing Film | BioRad | 359-0133 | To seal sample plate |
| Droplet Generator | BioRad | 186-3002 | |
| Droplet Generation Oil | BioRad | 186-3005 | |
| Cartridge | BioRad | 186-4008 | |
| DG8 Cartridge Holder | BioRad | 186-3051 | |
| Gasket | BioRad | 186-3009 | |
| 20 μl pipet tips | Rainin | GP-L10F | For tansferring sample/master mix to cartidge |
| 200 μl pipet tips | Rainin | GP-L200F | For transferring droplets to final Twin.Tec Plate |
| Twin.Tec 96 Well Plate | Eppendorf | 951020320 | For final droplets thermal cycling and reading |
| Pierceable Heat Seal Foil | BioRad | 181-4040 | To seal Twin.Tec plate before thermalcycling |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 181-4000 | |
| CFX96 Thermalcycler | BioRad | CFX96 and C1000 | Only the thermal cycler is needed, no optics |
| QX100 Droplet Reader | BioRad | 186-3001 | |
| Droplet Reader Oil | BioRad | 186-3004 | |
| Droplet PCR Supermix | BioRad | 186-3024 | i.e. the digital PCR mix in manuscript |
| QuantaSoft software (v1.3.2) | Quantasoft | QX100 | For viewing, analyzing, and exporting ddPCR data |
| Entero Forward Primer (Ent F1A) | Operon | GAGAAATTCCAAACGAACTTG | Alternative vendor can be used |
| Entero Reverse Primer (Ent R1) | Operon | CAGTGCTCTACCTCCATCATT | Alternative vendor can be used |
| Entero Probe (GPL813TQ) | Operon | [6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1] | Alternative vendor can be used, but the florophore has to be FAM |
| HF183 Forward Primer (HF183-1) | Operon | ATCATGAGTTCACATGTCCG | Alternative vendor can be used |
| HF183 Reverse Primer (BthetR1) | Operon | CGTAGGAGTTTGGACCGTGT | Alternative vendor can be used |
| HF183 Probe (BthetP1) | Operon | [6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1] |
Alternative vendor can be used, but the florophore has to be HEX (if using VIC, then the appropriate matric compensation must be chosen. |
| Positive control | Mixture of E. faecalis genomic DNA and HF183 standard plasmid (ordered from IDT). For detailed methods in culturing E. faecalis and sequences of the ordered HF183 plasmid, please see Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercilaly available Enterococcus DNA standards (ATCC 29212Q-FZ) can also be used in the positive control in place of lab-prepared E. faecalis genomic DNA. |
References
- Recreational Water Quality Criteria. EPA. , Office of Water. Washington, DC. 820-F-12-058. Available from: http://water.epa.gov/scitech/swguidance/standards/criteria/health/recreation/ (2012).
- Boehm, A. B., et al. Performance of forty-one microbial source tracking methods: A twenty-seven lab evaluation study. Water Res. 47 (18), 6812-6828 (2013).
- Layton, B. A., et al. Performance of human fecal anaerobe-associated PCR-based assays in a multi-laboratory method evaluation study. Water Res. 47 (18), 6897-6908 (2013).
- Cao, Y., et al. Effect of platform, reference material, and quantification model on enumeration of Enterococcus by quantitative PCR methods. Water Res. 47 (1), 233-241 (2013).
- Sivaganesan, M., Siefring, S., Varma, M., Haugland, R. A. MPN estimation of qPCR target sequence recoveries from whole cell calibrator samples. J. Microbiol. Methods. 87 (3), 343-349 (2011).
- Huggett, J. F., et al. The Digital MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clin. Chem. 59 (6), 892-902 (2013).
- Cao, Y., Raith, M. R., Griffith, J. F. Droplet digital PCR for simultaneous quantification of general and human-associated fecal indicators for water quality assessment. Water Res. 70, 337-349 (2015).
- Sanders, R., Huggett, J. F., Bushell, C. A., Cowen, S., Scott, D. J., Foy, C. A. Evaluation of Digital PCR for Absolute DNA Quantification. Anal. Chem. 83 (17), 6474-6484 (2011).
- Whale, A. S., et al. Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation. Nucleic Acid Res. 40 (11), 82-89 (2012).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
- Morisset, D., Štebih, D., Milavec, M., Gruden, K., Žel, J. Quantitative analysis of food and feed aamples with droplet digital PCR. PLoS One. 8 (5), e62583 (2013).
- Method 1611: Enterococci in Water by TaqMan® Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) Assay. EPA. , Office of Water. Washington, DC. EPA-821-R-12-008. Available from: http://water.epa.gov/scitech/methods/cwa/bioindicators/upload/Method-1611-Entercocci-in-Water-by-TaqMan-Quantitative-Polymerase-Chain-Reaction-qPCR-Assay.pdf (2012).
- Cao, Y., et al. Evaluation of molecular community analysis methods for discerning fecal sources and human waste. Water Res. 47 (18), 6862-6872 (2013).
