Summary
Dette manuskriptet beskriver en tosidig digital PCR-analyse som kan brukes til å samtidig kvantifisere Enterococcus spp. Og HF183 genetiske markører som indikatorer på generell og menneske-forbundet fekal forurensning i fritids farvann.
Abstract
Dette manuskriptet beskriver en tosidig digital PCR-analyse (EntHF183 dPCR) for samtidig kvantifisering av Enterococcus spp. Og den menneskelige fekal-forbundet HF183 markør. Den EntHF183 duplex dPCR (omtalt som EntHF183 dPCR heretter) analysen bruker de samme primer og probe sekvenser som sine publiserte individuelle kvantitativ PCR (qPCR) kolleger. Likeledes er de samme vann filtrering og DNA utvinning prosedyrer som utføres før qPCR fulgt før du kjører dPCR. Imidlertid har duplex dPCR analysen flere fordeler fremfor de qPCR analyser. Viktigst, eliminerer dPCR analysen behovet for å kjøre en standardkurve og dermed den tilhørende skjevhet og variabilitet ved direkte kvantifisering av sine mål. I tillegg, mens tosidig (dvs. samtidig kvantifisering) Enterococcus og HF183 i qPCR ofte fører til alvorlig undervurdering av den mindre mål i en prøve, gir dPCR konsekvent kvantifisering av begge målene, skjerpehennes kvantifisert enkeltvis eller samtidig i den samme reaksjon. Den dPCR analysen er også i stand til å tåle PCR-inhibitorkonsentrasjoner som er en til to størrelsesordener høyere enn de som tåles av qPCR. Disse fordelene gjør det EntHF183 dPCR analysen særlig attraktivt fordi det samtidig gir nøyaktig og repeterbar informasjon om både generell og human-assosiert fekal forurensning i miljøet farvann uten behov for å kjøre to separate qPCR analyser. Til tross for sine fordeler fremfor qPCR, er den øvre grense kvantifisering av dPCR analysen med for tiden tilgjengelig instrumentering omtrent fire størrelsesordener lavere enn det som er oppnåelig ved qPCR. Følgelig blir fortynning er nødvendig for måling av høye konsentrasjoner av målorganismer så som de som vanligvis observert etter kloakkutslipp.
Introduction
Kvantitative PCR (qPCR) metoder har vært mye brukt til fritidsfiske vannkvalitet overvåking og mikrobiell kilde sporing applikasjoner fordi de er raskere, mer fleksible og spesifikk i forhold til tradisjonelle kulturbaserte metoder. Følgelig er qPCR anbefales for å oppnå raske vann overvåkingsresultater for generelle fekale indikatorer som Enterococcus spp. I de reviderte USEPA rekreasjons vann kvalitetskriterier 1. Mange qPCR analyser har også blitt utviklet og validert for å identifisere kildene til fekal forurensning i miljø farvann 2. Blant disse, de HF183 markør analysene er blant de mest brukte for å identifisere human-forbundet fekal forurensning tre.
Imidlertid kan qPCR resultatene ofte være partisk fordi de er avhengige av standardkurver for kvantifisering. qPCR kvantifiserer ukjente konsentrasjoner av mål i prøvene ved å interpolere sin kvantifisering syklus (Cq) fra en standard kurve som beskriver et lineært forhold mellom Cq og logaritmisk mengde av et sett serielt-fortynnede standarder. Mangel på pålitelig og konsekvent standard referansemateriale kan derfor i stor grad skjevhet qPCR resultater. Undersøkelser viste at qPCR resultatene skilte med ca en halv logg bruker standarder fra ulike leverandører 4 og med to ganger ved hjelp av ulike grupper av standarder fra samme leverandør fem.
Digital PCR (dPCR) teknologi kvantifiserer en ukjent prøve ved å telle frekvensen av positive i et stort antall miniatyr PCR som er generert ved å dele en bulk qPCR inn i tusener eller millioner av ensartet nanoliter eller picoliter reaksjoner 6. Det er omtalt som dråpe digitalt PCR (dvs. denne artikkelen) eller kammer digital PCR, henholdsvis, hvis skilleveggene er vann-i-olje-dråper (dvs. denne artikkel) eller små kamre på en chip. En høyere prøvekonsentrasjon vil resultere i nærvær av mål-DNA(Derav positive PCR) i en høyere andel av skillevegger, et forhold tilnærmet ved hjelp av Poisson-fordelingen. Som sådan, er de binære resultater (positive eller negative PCR) registreres og frekvensen av positive dråpene blir brukt til å beregne ukjente prøvekonsentrasjoner direkte via Poisson tilnærmelse, som eliminerer behovet for en standardkurve som i qPCR.
Denne binære natur digital PCR kvantifisering gir flere fordeler i forhold til qPCR 7. Fordi forsinket forsterkning kan likevel gi et positivt PCR, er dPCR kvantifisering mer robust mot inhibering som reduserer forsterkningsvirkningsgrad. Tilsvarende er dPCR kvantifisering ikke påvirket av variasjoner i CQ verdier som er qPCR, noe som fører til høyere presisjon av dPCR forhold til qPCR 8-10.
I tillegg sikrer partisjoner prosess en meget liten mengde av mål-DNA til stede i hver dråpe, som effektivt minimerer substrat konkurranse (under amplification av forskjellige DNA-mål) som er felles hindringer for å oppnå tosidig (dvs. en analyse måler to DNA-mål samtidig) i qPCR. Som sådan, enten løpe i tosidig eller simplex (dvs. en target blir målt i et enkelt assay) dPCR produserer nesten umulig å skille kvantifisering av begge målene 7,11.
Målet med den digitale PCR-analyse (EntHF183 dPCR) beskrevet i denne artikkelen er å få samtidig direkte kvantifisering av den generelle fekal indikator Enterococcus spp. Og menneske-avføring forbundet HF183 markør med forbedret presisjon, reproduserbarhet og robusthet mot hemming i forhold til sin qPCR kolleger. Denne analysen har blitt brukt for å kvantifisere fekal forurensning i miljøet ferskvann, sjøvann, og diverse avføring 7, men kan også anvendes på andre typer av vann og avløpsvann. Denne analysen har store løftet for å analysere sedimenter eller jord på grunn av dets høy toleranse overfor inhibering, men ytterligere testing er nødvendig på grunn av kompleksiteten av inhibitor blander i slike prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Analyse Blanding Forberedelse
- Gjør 100 mikromol / L aksje konsentrasjoner for alle primere i molekylær grad vann og sonder i TE pH 8 buffer [Entero F1a, Entero R1, GPL813TQ 12; HF183-1, BthetR1, BthetP1 3].
Note: Prober for de to målene er fluorescensmerkede med forskjellige fluorophores 7 som er angitt i Liste over materialer / utstyr. - Forbered mester blanding ved å blande, per reaksjon planlagt, 12 pl digital PCR mix (2x lager, se liste over materialer / utstyr), 0,216 mL hver forover og bakover primer, 0,06 mL hver fluorescerende probe, og 5,016 mL nukleasefritt fritt vann (endelig konsentrasjon : 900 nM hver primer, 250 nM hver sonde). Pipettere opp og ned minst 10 ganger for å blande mens man tar forsiktighet for ikke å innføre luftbobler i oppløsningen.
- Pipetter 18 mL mester mix (fra trinn 1.2) inn i en vanlig PCR rør eller plate, blande i 6 mL DNA-templat (ekstrahert som beskrevet previouslu 13) for å gjøre prøveblanding for dråpe generasjon. Hvis du kjører prøver i to eksemplarer, pipette 36 mL av master-mix og 12 mL DNA mal i hver brønn. La de tilsvarende replikere brønnene tomt på tallerkenen. Inkluder positive kontroller (se liste over materialer / utstyr) og templat-kontroller (NTC) (dvs. med molekylær grade vann brukes som mal).
Merk: Positiv kontroll er nødvendig for å sikre analysen går riktig og NTC er nødvendig for å sikre at det er forurensning i platen og stille inn fluorescerende baseline senere i dataanalyse. Førstegangsbrukere anbefales å bruke begge utvannet DNA-prøver.
2. Droplet generasjon og PCR Plate Setup
- Bland analyse blandinger ved å pipettere opp ned ca 15 ganger ved hjelp av en flerkanals pipette. Pass på at pipettespiss holder seg innenfor flytende å unngå å gjøre overskytende bobler i blandingen.
- insERT kassett 1 (inneholder 8 brønner) i en hvit kassettholderen, og klikk på kassettholderen stengt. Cartridge 1 er nå på plass og kan ikke løsner fra holderen under generering dråper. Ved hjelp av en multikanal pipette, forsiktig overføre 20 ul prøveblanding inn i midtstilling av kassetten merket "Sample 'uten å innføre luftbobler.
- Pipet i 70 pl dråpe generasjon olje til venstre side av kassetten (merket "Oil").
- Cover kassetten med en pakning som gjør at pakningen er flat og holdt jevnt med 4 ticks mot kanten av patronen. Trykk på den grønne opplyste knappen på dråpe generator for å åpne og plassere kassetten. Trykk på den grønne opplyste knappen igjen for å lukke generator.
Merk: Når døren lukkes, knappen er nedtonet, kan døren ikke gjenåpnes og dråpe generasjon begynner umiddelbart fortsetter i ca 1 min. - Ved å gjøre mer enn 8-reaksjoner, sted patron 2 i en annenhvit kassettholderen og forberede på samme måte som patron en stund dråpen generasjon er i gang for å spare totalt setup tid.
- Åpne dråpegeneratoren døren når dim tent knappen blir grønn indikerer fullføring av dråpe generasjon. Ta ut den hvite kassettholderen inneholder patron 1, satt til side, og stedet patron 2 på dråpen generator.
- Fjern pakningen fra patronen 1 og kast. overføre forsiktig det totale volum (ca. 40 ul) av genererte dråper fra den tredje kolonne av patronen (merket "Dråper ') på en avsluttende PCR-plate (opprettholdt ved romtemperatur) for termisk sykling.
Merk: Ikke unclick den hvite kassettholderen som handlingen kan bryte de nylig genererte dråper; bare åpne kassettholderen etter dråpene er overført til den endelige plate. - Gjenta trinn 2.1 til 2.7 for ytterligere prøver.
- Når alle dråpene er i finalen PCR plate, plassere et gjennomhullfolie på toppen av platen og legg den på en tallerken sealer. Sett sealer til 180 ° C, trykk "Play" på fangstskuta og la sel i 10 sek.
3. Termisk Sykling og Droplet Reading
- Plasser den forseglede platen på termosykler, en kompatibel med den endelige PCR-plate som anvendes i trinn 2.7, og en temperatur ramping hastighet på 2,0 ° C / sek.
- Kjør termisk program som følger: 10 min ved 95 ° C, etterfulgt av 40 sykluser med 30 sek ved 94 ° C og 60 sek ved 60 ° C, etterfulgt av en 10 min hold ved 98 ° C (valgfritt: endelig feste på 4 eller 15 ° C).
- Ved ferdigstillelse av sykling, overføre plate til en Droplet Reader for automatisk måling av fluorescens i hver dråpe i hver brønn. Alternativt lagre platen ved 4 ° C i opp til 3 dager før dråpe lesing. Sørg dråpene er i romtemperatur før du fortsetter med lesing.
- Åpne den medfølgende programvaren til å sette opp dråpe lesing. Istandard 'Setup-menyen inneholder en skjematisk av en tom 96 brønners plate, dobbeltklikker du på brønn A1 for å åpne menyen inneholder tre deler: "Sample", "Analyse 1" og "analysen 2.'
- I "Sample" -delen skriver prøven ID inn i boksen merket "Name" og trykk enter eller sjekk boksen til høyre merket "Apply". Deretter klikker du på rullegardinmenyen "Experiment" og velg 'RED' (sjelden hendelse deteksjon) og klikk enter.
- Flytt til avsnittet betegnes 'analyse 1.' I "Name" -delen fylle ut analysen (f.eks Enterococcus) og klikk enter. I boksen under merket "Type 'klikker du på rullegardinmenyen og velg' Kanal 1 Unknown" og klikk enter.
- Flytt til avsnittet betegnes 'analysen 2.' I "Name" -delen fylle ut analysen (f.eks HF183) og klikk enter. I boksen under merket "Type" klikk på rullegardinmenyen end Velg "Channel 2 Unknown" og klikk enter. All informasjon fra trinn 3.3.2 til 3.3.4 er nå til stede i brønn A1.
- Navn alle påfølgende brønner som inneholder dråper. For å spare total oppsett tid, klikk "Shift" eller "Ctrl," for å velge flere brønner samtidig.
- Når digital avbildning av platen speiler den fysiske platen, trykker du på "OK" nederst til høyre i menyen. I den nye menyen som vises på toppen av platen skjematisk, under "mal" seksjonen velge "Lagre som" og navn og lagre platen.
- Til venstre på skjermen klikk "Kjør" og velge riktig Dye ligger i pop-out "Run Options" -vinduet. Datainnsamling startes og vises i sanntid i programvaren.
4. Data Analysis and Reporting
- Når leseren er ferdig og en boks med melding om 'Kjør Complete ", klikk" OK ".
Merk: Den mykeware viser den endelige datafilen under "Analyser" -delen av programvaren. I denne visningen har programvaren alle brønnene i platen utvalgte og mislighold til "2D Amplitude 'data plottet. - Sjekk avstanden mellom de positive og negative dråper. Kontroller at fluorescens i alle dråper i NTC brønnene er i nærheten baseline.
- Klikk på knappen merket "Events. ' Til høyre for den presenterte histogrammet klikk på boksen som heter "Total" og den boksen som heter "single" nederst for å vise det totale antall aksepterte dråper per brønn. Utelukke noen brønner som inneholder <10.000 dråper 7 ved å holde nede Ctrl-tasten og klikke på brønnen (e) som skal utelukkes.
- Klikk på knappen merket som "1D Amplitude" for å stille inn fluorescerende terskel på ca ett standardavvik (500-700 fluorescens enheter) over de negative dråper i NTC brønner for begge målene. I det venstre på skjermen unDer den "Auto Analyser 'viser to terskel knapper, velg ikonet til høyre som har en solid rosa horisontal linje som går gjennom den.
- Klikk i boksen til venstre for "Set Threshold" under hver av amplitude grafer og angi riktig fluorescens terskelverdier. De målkonsentrasjoner i eksemplar per mL reaksjon blir automatisk beregnet.
Merk: terskler trenger ikke å være identiske for de forskjellige mål. - Eksporter resultatene i en CSV-fil ved å klikke på "Eksporter" knappen øverst i venstre hjørne på 1D Amplitude skjermen. I CSV-filen, multiplisere den eksporterte mål konsentrasjonen av fire å konvertere den fra kopi av målet (23S genet av Enterococcus spp. Eller HF183 markør) per mL reaksjon å kopiere fra mål per mL DNA-templat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En god EntHF183 duplex dPCR løp bør resultere i relativt høyt antall aksepterte dråper (ca 10,000-17,000) og relativt stor forskjell (ca. 5000) mellom fluorescens verdier for negative og positive dråper 7. Uvanlig lavt antall dråper sannsynlig indikerer problemer i dråpen generasjon prosessen, og en cutoff på 10.000 dråper er foreslått basert på empiriske data fra dråpen dPCR systemet som brukes i denne artikkelen. En svakere separasjon (dvs. mindre fluorescens forskjell) mellom positive og negative dråper kan indikere hemming eller forringet prober 7.
Total, produserer EntHF183 duplex dPCR assay sterkt sammenlignbare resultater til at det fra simplex qPCR når qPCR er korrigert for skjevheter i forbindelse med standarder, og det er ingen hemming 7. Resultater fra EntHF183 duplex dPCR analyse og corsvarer simplex dPCR analysene er svært konsekvent og ofte umulig å skille mellom de to formatene 7 (figur 1). I tillegg kan den dPCR analysen også tåle inhibitorkonsentrasjoner en til to størrelsesordener høyere enn det som tåles av dens qPCR motstykker 7 (figur 2).
Figur 1:. Kvantifisering av fekale og vannprøver ved EntHF183 duplex dPCR analysen og den tilsvarende simplex dPCR analyser Venstre og høyre panel viser Enterococcus og HF183 kvantifisering, henholdsvis med de tilsvarende korrelasjonskoeffisienter (p <0,001) mellom duplex og simplex resultater. Heltrukne linjer indikerer regresjonslinjer og grå skyggelegging indikerer tilsvarende standardfeil. Symboler indikerer ulike typer prøver (Circles, trekant s og kors betegne avføring, ferskvann og marine vannprøver, henholdsvis). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Simplex qPCR og tosidig dPCR kvantifisering av HF183 markør i ren kloakk DNA tilsatt økende konsentrasjoner av PCR-hemmere (humus) Trekanter og x-kors betegne dPCR og qPCR kvantifisering, henholdsvis.. Den forventede HF183 kvantifisering i fravær av inhibitorer er definert som 95% konfidensintervall (det vil si mellom de to horisontale stiplede linjer). En "-1" resultatet indikerer ikke-deteksjon. Enterococcus kvantifisering viser tilsvarende høyere toleranse for hemmere av EntHF183 duplex dPCR analyse enn ved tilsvarende qPCR analysen 7.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53611/53611fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er noen viktige skritt i protokollen. Først, blanding av analyse blandingene kan være vanskelig fordi det konsentrat-blanding er mer viskøse enn konvensjonelle qPCR Master Mix. Enkel virvling kan føre til utilstrekkelig blanding, noe som igjen fører til ujevn fordeling av DNA-templater i prøveblandingene og deretter i dråpene. Blande-by-pipettering teknikk som er beskrevet i protokollen må følges for å sikre nøyaktig dPCR kvantifisering. For det andre er det viktig å sikre at dråpene er generert ved en jevn form og størrelse. Vær oppmerksom på anledninger når tiden dråpegeneratoren tar å fullføre dråpe generasjon på en patron er kortere enn vanlig. Dette kan indikere suboptimal dråpe generasjon. Om nødvendig kan dråpen generasjon tid på hver patron skal registreres for feilsøking. For det tredje er det viktig for å overføre hele 40 ul generert dråper fra patronen til den endelige PCR-plate uten skjæring avdråper og unngår ikke å ha nok dråper for kvantifisering. Følgende teknikker kan brukes for overføring: 1) Still flerkanals pipette 40 mL og sette inn tips i den høyre delen av kassetten (merket 'Dråper') i en 45 ° vinkel; 2) Pipet dråpene langsomt ut og sikre at alle dråpene pipetteres opp (ta oppmerksom hvis noen dråper er forlatt og må pipetteres opp for en ny runde); 3) Når dråpene blir fjernet, overføre dem til den ferdige plate ved å sette den pipettespiss mot brønnveggen, omtrent halvveis ned og fordrive dråpene langsomt.
Den EntHF183 duplex dPCR analysen har store fordeler i forhold til de eksisterende individuelle qPCR analyser for de samme analyttene. Først gjør duplex dPCR analysen ikke trenger standardkurver for kvantifisering ukjente, og dermed eliminere qPCR kvantifisering skjevheter knyttet til variasjon i standarder 7. For det andre kan det duplex dPCR analysen tolerere sperreeller konsentrasjoner som er en til to størrelsesordener høyere enn det som tolereres av de tilsvarende qPCR analyser 7. Denne funksjonen gjør duplex dPCR analysen svært attraktive for å analysere miljøprøver (f.eks overvann prøver) som ofte inneholder stoffer som hemmer PCR. Tredje, kapasitet til samtidig kvantifisere både Enterococcus spp. Og HF183 markør i en duplex dPCR analysen (vs å kvantifisere dem separat i to qPCR analyser) er mer kostnadseffektivt 7 og forbedrer datamengden ved å unngå akkumulerte pipettering variasjon forbundet med gjennomføre to separate analyser (kontra en duplex dPCR analyse). Fjerde, duplex dPCR analysen viste også høyere presisjon og repeterbarhet i forhold til tilsvarende qPCR analyser, noe som gjør det tidligere et godt alternativ i komparative studier 7.
Ikke desto mindre begrensninger finnes for denne fremgangsmåte (fordeler og begrensninger som er beskrevet i detaljandre steder 7). For det første antallet aksepterte dråper per reaksjon bestemmer den øvre kvantifiseringsgrense (UQL) av dPCR. Den dPCR instrument som brukes i dette arbeidet (se liste over materialer / utstyr) har blitt rapportert å ha en UQL av 10 5 eksemplar per reaksjon. Dette tilsvarer 5 x 10 5 Enterococcus-celler og 2 x 10 6 HF183 kopier pr 100 ml vann, forutsatt at den tidligere 7 beskrevne DNA-ekstraksjon protokollen blir fulgt og 100 pl DNA-er oppnådd (dvs. pr elueringen trinn i DNA-ekstraksjon) fra 100 ml vann uten tap under utvalgets behandling før dPCR 7. Miljø farvann generelt ikke overstige slike konsentrasjoner av Enterococcus og HF183. Imidlertid bør prøvefortynning vurderes for store konsentrerte prøver slik som dyr avføring, rå kloakk og vannprøver innsamlet umiddelbart etter et kloakkutslipp. For det andre, høye konsentrasjoner av total DNA (including både target og ikke-target DNA) kan forstyrre den dråpepartisjoneringsprosessen. Det er ikke anbefalt å bruke mer enn 66 ng total DNA uten forbehandling med restriksjonsenzymer 7. For det tredje, selv om den EntHF183 duplex dPCR analysen er vesentlig mer robust mot inhibering enn qPCR, denne analysen kan likevel gi falske negative resultater hvis alvorlig inhibering hindrer PCR-amplifisering oppstår. Hemming kontrolltiltak derfor bør fortsatt gjennomføres. Standard tilsetnings eller fortynningsmetoder som er beskrevet tidligere kan brukes til å vurdere inhibisjon 7. Siste har duplex analysen kun blitt godkjent for en dPCR plattform, og metodevalidering skal utføres på andre digitale PCR-plattformer før bruk.
Dette er den første publiserte duplex digital PCR assay som samtidig kvantifiserer en allment akseptert vannkvalitet indikator og en populær vert-forbundet markør for fekal forurensning 7. De demonstrerte fordelerav EntHF183 duplex dPCR analysen løfte andre nyttige anvendelser av digital PCR-teknologi i mikrobiell kilde sporing, påvisning av patogener og antibiotikaresistensgener. For eksempel kan en generell fekal indikator (Enterococcus spp., E. coli, generell Bacteroidales) og en rekke assosiert fecal markør (HF183, HumM2, CowM2, LeeSeagull) 2 kobles sammen på samme måte (som i EntHF183 duplex dPCR analyse) i en duplex dPCR analyse for mer kostnadseffektiv og nøyaktig kvantifisering av generell og vert-assosiert fekal forurensning. Mikrobiell kilde sporing markører rettet mot samme kilde (eller ulike kilder) kan også være koblet sammen i duplex dPCR analyse for å øke tilliten i å oppdage fekal kilde (eller få informasjon på flere fekal kilder samtidig). Jo høyere toleranse mot PCR-inhibitorer kan også tillate analyse av større prøvevolum for å øke sannsynligheten for å detektere patogener som har lav infeksiøse doser, men er bare til stede i environmental vann i lave konsentrasjoner. Lignende metodiske fordelene med digital PCR enn qPCR kan også gjelde for utviklingen av digitale PCR-analyser for kvantifisering av antibiotikaresistensgener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low Bind Microtubes | Costar | 3207 | For storage of reagents, samples/production of master mixes |
| Nuclease Free Water | FisherSci | BP2484-50 | |
| TE pH 8 buffer | FisherSci | BP2473-100 | |
| Hardshell 96 Well Plate | BioRad | HSP-9601 | For initial master mix and sample inoculation |
| Aluminum Sealing Film | BioRad | 359-0133 | To seal sample plate |
| Droplet Generator | BioRad | 186-3002 | |
| Droplet Generation Oil | BioRad | 186-3005 | |
| Cartridge | BioRad | 186-4008 | |
| DG8 Cartridge Holder | BioRad | 186-3051 | |
| Gasket | BioRad | 186-3009 | |
| 20 μl pipet tips | Rainin | GP-L10F | For tansferring sample/master mix to cartidge |
| 200 μl pipet tips | Rainin | GP-L200F | For transferring droplets to final Twin.Tec Plate |
| Twin.Tec 96 Well Plate | Eppendorf | 951020320 | For final droplets thermal cycling and reading |
| Pierceable Heat Seal Foil | BioRad | 181-4040 | To seal Twin.Tec plate before thermalcycling |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 181-4000 | |
| CFX96 Thermalcycler | BioRad | CFX96 and C1000 | Only the thermal cycler is needed, no optics |
| QX100 Droplet Reader | BioRad | 186-3001 | |
| Droplet Reader Oil | BioRad | 186-3004 | |
| Droplet PCR Supermix | BioRad | 186-3024 | i.e. the digital PCR mix in manuscript |
| QuantaSoft software (v1.3.2) | Quantasoft | QX100 | For viewing, analyzing, and exporting ddPCR data |
| Entero Forward Primer (Ent F1A) | Operon | GAGAAATTCCAAACGAACTTG | Alternative vendor can be used |
| Entero Reverse Primer (Ent R1) | Operon | CAGTGCTCTACCTCCATCATT | Alternative vendor can be used |
| Entero Probe (GPL813TQ) | Operon | [6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1] | Alternative vendor can be used, but the florophore has to be FAM |
| HF183 Forward Primer (HF183-1) | Operon | ATCATGAGTTCACATGTCCG | Alternative vendor can be used |
| HF183 Reverse Primer (BthetR1) | Operon | CGTAGGAGTTTGGACCGTGT | Alternative vendor can be used |
| HF183 Probe (BthetP1) | Operon | [6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1] |
Alternative vendor can be used, but the florophore has to be HEX (if using VIC, then the appropriate matric compensation must be chosen. |
| Positive control | Mixture of E. faecalis genomic DNA and HF183 standard plasmid (ordered from IDT). For detailed methods in culturing E. faecalis and sequences of the ordered HF183 plasmid, please see Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercilaly available Enterococcus DNA standards (ATCC 29212Q-FZ) can also be used in the positive control in place of lab-prepared E. faecalis genomic DNA. |
References
- Recreational Water Quality Criteria. EPA. , Office of Water. Washington, DC. 820-F-12-058. Available from: http://water.epa.gov/scitech/swguidance/standards/criteria/health/recreation/ (2012).
- Boehm, A. B., et al. Performance of forty-one microbial source tracking methods: A twenty-seven lab evaluation study. Water Res. 47 (18), 6812-6828 (2013).
- Layton, B. A., et al. Performance of human fecal anaerobe-associated PCR-based assays in a multi-laboratory method evaluation study. Water Res. 47 (18), 6897-6908 (2013).
- Cao, Y., et al. Effect of platform, reference material, and quantification model on enumeration of Enterococcus by quantitative PCR methods. Water Res. 47 (1), 233-241 (2013).
- Sivaganesan, M., Siefring, S., Varma, M., Haugland, R. A. MPN estimation of qPCR target sequence recoveries from whole cell calibrator samples. J. Microbiol. Methods. 87 (3), 343-349 (2011).
- Huggett, J. F., et al. The Digital MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clin. Chem. 59 (6), 892-902 (2013).
- Cao, Y., Raith, M. R., Griffith, J. F. Droplet digital PCR for simultaneous quantification of general and human-associated fecal indicators for water quality assessment. Water Res. 70, 337-349 (2015).
- Sanders, R., Huggett, J. F., Bushell, C. A., Cowen, S., Scott, D. J., Foy, C. A. Evaluation of Digital PCR for Absolute DNA Quantification. Anal. Chem. 83 (17), 6474-6484 (2011).
- Whale, A. S., et al. Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation. Nucleic Acid Res. 40 (11), 82-89 (2012).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
- Morisset, D., Štebih, D., Milavec, M., Gruden, K., Žel, J. Quantitative analysis of food and feed aamples with droplet digital PCR. PLoS One. 8 (5), e62583 (2013).
- Method 1611: Enterococci in Water by TaqMan® Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) Assay. EPA. , Office of Water. Washington, DC. EPA-821-R-12-008. Available from: http://water.epa.gov/scitech/methods/cwa/bioindicators/upload/Method-1611-Entercocci-in-Water-by-TaqMan-Quantitative-Polymerase-Chain-Reaction-qPCR-Assay.pdf (2012).
- Cao, Y., et al. Evaluation of molecular community analysis methods for discerning fecal sources and human waste. Water Res. 47 (18), 6862-6872 (2013).
